Les auteurs tiennent à remercier les familles des donneurs et des d&#39;approvisionnement en organes impliqués dans cette recherche et Maria Martino et Irina Kusmartseva pour leur aide d&#39;experts. Ce travail a été financé par la Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) à l&#39;appui du Réseau des donneurs d&#39;organes atteints de diabète pancréatique.

1. Mise en place <ol><li> Cassettes d&#39;étiquettes pour des blocs de paraffine manuellement avec un crayon, ou automatiquement avec une imprimante à cassette. Inclure l&#39;identificateur du donneur (CASEID), type d&#39;échantillon, le nombre aliquote, et toute autre identification unique (feuille de calcul de cas, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">l&#39;annexe 1</a> ). </li><li> Étiquettes moules PTOM comme pour les cassettes avec un marqueur permanent. Découpez des rectangles de 5-10 cm de papier d&#39;aluminium. </li><li> Imprimer ou manuellement l&#39;étiquette avec un marqueur permanent, tous les flacons et tubes. Inclure flacons assez pour les échantillons composant logiciel enfichable hachés surgelés et les tubes avec les médias pour les expéditions RPMI frais. Pour les flacons congelés pression avec RNAlater, ajouter 1 ml à chaque RNAlater cryovial. </li><li> Conseils de dissection Set-up en matière de biosécurité capot et les comptoirs avec des instruments de dissection stérilisés (forceps, scalpels, lames, tampons de gaze (4x4)) ainsi que des cassettes et des moules PTOM classées par ordre d&#39;utilisation. </li><li> Préparer un bain de congélation par la miseglace sèche dans une zone de mousse de polystyrène de taille moyenne (10x10 cm) à une profondeur d&#39;au moins 3 cm et ajouter l&#39;isopentane jusqu&#39;à ce que la glace sèche est complètement recouverte. </li><li> En option: Remplir un petit récipient Dewar d&#39;azote liquide. </li><li> Si le pancréas est nécessaire pour la microscopie électronique (EM), de préparer fixateur Taab par l&#39;ajout de 1,25 ml de paraformaldéhyde 16%, glutaraldéhyde à 1,25 ml 8%, et 7,5 ml 0,1 M PBS. Préparer fixateur Lowicryl en ajoutant 2,5 mL de paraformaldéhyde 16% à 7,5 mL du PBS 0,1 M. </li><li> Préparer des solutions utilisées pour isoler des cellules. Pour bouteille de 500 ml de DMEF (avec de la glutamine), suivez les techniques d&#39;asepsie tout en ajoutant ce qui suit: <ol><li> Sérum de veau fœtal (FBS): ajouter 50 ml, 10% final. </li><li> Pénicilline / streptomycine (Pen / Strep, 10.000 U / ml / 10000 ug / ml de bouillon) - ajouter 5 ml Pen / Strep stock de RPMI pour une concentration finale de 100 U / ml / 100ug/mL. Aussi, ajoutez 5 ml d&#39;un flacon de 500 ml de DPBS lorsqu&#39;ils sont utilisés pour la tenue de ganglions lymphatiques ou la rate des échantillons. </li></ol></li></ol> 2. Personnel <ol&gt; <li> La procédure est optimale accompli avec trois membres du personnel mais la procédure peut être menée avec un individu bien formé. Deux individus peuvent généralement terminer la procédure en 90 minutes. La durée réelle dépend du nombre de tissus reçus et la facilité de trouver des noeuds lymphatiques du pancréas. Les échantillons destinés à des isolements cellulaires sont conservés à 4 ° C jusqu&#39;à la fin de la dissection des tissus alors que les échantillons de sérum sont traitées en parallèle. </li><li> Pathologiste, de la pathologie assistant, ou équivalent-un membre du personnel expérimenté mène la manipulation des tissus et effectue des dissections importantes, y compris la division (s) de la tête du pancréas et de la récolte des ganglions lymphatiques du pancréas. Les efforts initiaux sont dirigés vers le pancréas suivie d&#39;un examen de la péri-pancréatique la graisse pour les ganglions lymphatiques. </li><li> Technologiste de laboratoire ou équivalent-membre du personnel formé dans le tissu coupe dont les principales responsabilités sont de peser le pancréas et les régions et les tissus de garniture pour les blocs fixes ou congelées et pour encliquetage congelés vl&#39;EIAA. Reçoit le duodénum et la rate partir de l&#39;assistant de pathologie et traite ces organes tandis que l&#39;assistant pathologie est le traitement du pancréas. </li><li> Assistant de laboratoire-membre du personnel qui assiste les autres y compris le bloc et l&#39;étiquetage du flacon, l&#39;échantillon de hachage pour cryotubes, et le traitement du sérum. </li></ol> 3. Dissection du pancréas <ol><li> Retirez le duodénum et de la rate et nettoyer le pancréas de graisse superflus, les vaisseaux et les nerfs à l&#39;aide dissection et forte </li><li> Placez le pancréas nettoyé sur une planche de dissection couverte avec du papier absorbant. Trempez un coton-tige à l&#39;encre bleue et la propagation à la surface antérieure du pancréas. Éponger l&#39;excédent. </li><li> En option: Trempez un nouvel applicateur à l&#39;encre noire et la propagation sur la face postérieure du pancréas. Retour du pancréas à l&#39;orientation normale avec la surface antérieure face prosecteur. </li><li> Couper le pancréas dans 3 régions: la tête, le corps et la queue (Figure 1). Couper la jonction entre head et le corps, puis divisez la partie restante dans ~ portions égales pour le corps et la queue. </li><li> Peser chaque région du poids du pancréas et l&#39;enregistrement (Affaire bilan feuille ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">annexe 1</a> )). </li><li> Section (~ 0,5 cm) de chaque région du pancréas dans un transversal &quot;pain&quot; de manière (Figure 1). </li><li> Utilisez les sections des deux jonctions entre les régions pour les échantillons hachés. Selon la taille du pancréas, un échantillon de la région de jonction corps-queue peut être difficile à obtenir dans ce cas, le nombre de blocs de paraffine peut être diminuée pour obtenir des échantillons ou des échantillons hachés seulement de la tête et le corps du pancréas région peut être obtenu. Cryotubes étiquette selon la tête ou le corps pour désigner la région proximale à la jonction. <ol><li> Mince morceaux et répartir également entre les cryotubes (≥ 1 gramme par flacon). Congeler rapidement flacons sans RNALater dans l&#39;azote liquide ou dans la glace sèche - suspension isopentane puis transfert to -80 ° C au congélateur. </li><li> Conserver les flacons avec RNALater à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre l&#39;équilibrage, remix et congeler rapidement dans l&#39;azote liquide ou dans la glace sèche-isopentane bouillie puis transférer dans un congélateur à -80 ° C. </li></ol></li><li> Supprimer les sections en alternance pour les blocs de paraffine et des PTOM à compter avec de la paraffine (Figure 1). </li><li> Penchez-vous toutes les sections transversales vers la droite. </li><li> Lieu ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm dans les sections cassettes. Si les sections transversales sont trop gros, coupé en deux (Figure 2b). Cassettes d&#39;étiquettes pour moitié antérieure bleu comme «A» et la moitié postérieure comme «B». </li><li> Si les morceaux sont encore trop grande, couper chaque section perpendiculaire à la coupe précédente (figure 2c). Cassettes d&#39;étiquettes AD dans le sens horaire. Coupez des morceaux plus que nécessaire pour s&#39;inscrire dans des cassettes. </li><li> Blocs de numéros de façon séquentielle au sein de la région, en commençant par la partie la plus médiale. </li><li> Pour les blocs de paraffine, la position cassettes de sorte que le marqueur est à l&#39;endroit gauche et le tissu dans la cassette, le maintien de son orientation. Couvercle de la cassette Fermer et transférer dans un récipient avec 500 ml ~ 10% du formol tamponné neutre (FBN). Début de fixation moment où la dernière cassette est placée dans un fixateur. </li><li> Pour les blocs de PTOM, versez une couche mince de l&#39;OCT médias dans le moule puis posez prelabeled le tissu dans le moule en veillant à maintenir l&#39;orientation et de couvrir tout le tissu avec octobre Rapidement immerger des moules dans un PTOM de la glace sèche - suspension isopentane pendant ~ 1 minute. Retirer du lisier et le lieu sur la glace sèche pour le stockage temporaire ou -80 ° C congélateur pour le stockage à long terme. </li><li> Obtenir ~ 0,5 x 0,5 cm tranches de la jonction tête-corps pour la microscopie électronique (EM). Placer une tranche dans le fixateur Taab et l&#39;autre tranche dans le fixateur Lowicryl. Conserver les deux types de fixateur avec des échantillons à 4 ° C pendant au moins 48 heures et / ou indéfiniment jusqu&#39;à ce que le traitement ultérieur des EM. </li></ol> 4. Spleen, dissection des ganglions lymphatiquestions et duodénal dissections Muqueuse <ol><li> Isoler les nœuds lymphatiques du pancréas (PLN) de la graisse et enlevez tout le tissu conjonctif de la capsule du ganglion. Placer dans un plat de culture cellulaire stérile contenant DMEF. Selon le nombre total isolé, il faut diviser PLN en aliquots pour les expéditions fraîches, congelées, isolations de cellules de paraffine et / ou des blocs de PTOM, et les flacons. Mince nœuds grands en morceaux pas plus de 0,5 cm. </li><li> Mince ganglions lymphatiques non-pancréatiques et de la rate dans de petites (~ 0,5 cm) cubes. Lieu dans un fixateur, OCT médias, et pour les expéditions ou DMEM échantillons frais ou les isolants cellulaires cryopréservés selon quantités de matières premières. </li><li> Ouvrez le duodénum et essuyez doucement la muqueuse duodénale propre de la muqueuse avec une compresse de gaze humide. Coupez les sections de la muqueuse de la paraffine et / ou congelés blocs PTOM et des échantillons pour flacons hachée, avec et sans RNAlater. Congelez comme pour les autres échantillons. </li></ol> 5. Wrap blocs PTOM en pré-étiquetés feuille d&#39;aluminium et placer des blocs PTOM et<html> flacons dans des boîtes pour le stockage à long terme à -80 ° C. 6. Soumettre des échantillons fixes pour le traitement de paraffine <ol><li> Fixer les tissus pendant 16 heures (plage de 20 ± 4 heures) à l&#39;aide d&#39;un processeur de paraffine automatique ou en utilisant le chronométrage manuel. Processus de blocs de paraffine en utilisant un processeur automatique ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">Annexe 2</a> ). </li><li> Incorporer les sections de l&#39;orientation exacte par ce prosecteur avec l&#39;étiquette de cassette vers la gauche. Intégrer la muqueuse duodénale avec la surface de coupe vers le bas pour permettre l&#39;examen de la perpendiculaire à la muqueuse sous-muqueuse. </li></ol> 7. Nettoyer les zones de dissection et à désinfecter. Laver instruments de dissection et re-stériliser. Placez les tissus résiduels de l&#39;homme dans le fixateur de formol pour le stockage de déchets biomédicaux. Jeter les déchets biomédicaux conformément aux réglementations locales délai d&#39;un mois. 8. Mise à jour du Système d&#39;inventaire des échantillons ve_title &quot;&gt; Résultats représentatifs 9. Cette procédure va traiter d&#39;un pancréas humain intact avec un échantillonnage représentatif tout au long de l&#39;organe, y compris la délimitation des trois grandes régions, à savoir, tête, corps et la queue dans les 2 heures. La région unciforme, trouvé dans la région postérieure de la tête, est inclus dans la dissection de tête. Le poids du pancréas médian des donneurs d&#39;organes sans le diabète est de 82,4 grammes (52,7 - 139,0 grammes). Poids du pancréas régionaux étaient à peu près égale (Figure 3). Cette procédure peut également permettre la reconstruction du pancréas entier en utilisant les lames colorées de la paraffine et des blocs séquentiels PTOM. Plusieurs formats sont possibles permettant une utilisation maximale des technologies actuelles et futures. La feuille de calcul cas actuel nPOD est fourni ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Annexe 1</a> ) qui est utilisé pour documenter échantillons récupérés et proc ultérieureesser par types et les quantités aliquotes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme d&#39;ensemble de la procédure. Le pancréas est entièrement traitée, tout en maintenant les orientations anatomiques. La région de tête est plus longue dans l&#39;axe supérieur-inférieur en raison de la présence du lobe pancréatique ventrale dans la région postérieure qui comprend la région unciforme. Zone hachurée au niveau des jonctions désigner les régions utilisées pour les échantillons hachés dans cryotubes. P, paraffine, O, EAO. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> Figure 2. Régime lettrage pour les sections du pancréas. Tranches transversales du pancréas peut encore être divisé en deux moitiés ou des quartiers et une lettre dans le sens horaire. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> Figure 3. Poids du pancréas de donneurs d&#39;organes sans le diabète. Lespancréas intact provenant de donneurs adultes (&gt; 17 ans) ont été pesés, puis divisé en régions et les poids régionaux obtenus. Les données sont des moyennes ± SEM (n = 15).

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	<li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li><li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas:+the+effects+of+age+and+diabetes.">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li><li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas:+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development.">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li><li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+concentration+in+the+head,+body,+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas.">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li><li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas.">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li><li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources.">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li><li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies.">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li><li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hy&#246;ty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+&#946;-cell+autoimmunity.">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of &#946;-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li><li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors.">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li><li>T&#246;ns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans.">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;objectif de cette procédure est de définir un traitement pancréas standard qui peut être harmonisé à travers les sites de collecte multiples et permettre ainsi la comparaison des résultats obtenus par les différents groupes. La méthode de dissection est basé sur le standard chirurgicales pratiques de pathologie avec des mesures supplémentaires pour l&#39;annotation des régions importantes du pancréas suivi par voie intra-régionaux subdivisions. Normalisation des méthodes de traitement des échantill...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Instruments de dissection, y compris bistouris à lames 22 </td><td> Divers </td><td> Divers </td><td></td></tr><tr><td> Tubes à centrifuger (15 et 50 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-539-5, 430828 </td><td> Stérile </td></tr><tr><td> Cryotubes (1,8 ml) </td><td> VWR en Amérique du Nord </td><td> 89004-300 </td><td> Stériles des codes à barres, en option </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgicale d&#39;encre pathologie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cassettes </td><td> Mercedes médicale </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 10% formol neutre tamponné </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> Milieux de congélation OCT </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Moules </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> Différentes tailles </td></tr><tr><td> Isopentane </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3551-4 </td><td> Octobre bain froid </td></tr><tr><td> La glace sèche </td><td></td><td></td><td> Octobre bain froid </td></tr><tr><td> L&#39;azote liquide dans un flacon de Dewar </td><td></td><td></td><td> Enclenchez cryotubes de congélation </td></tr><tr><td> Boîte de culture cellulaire (100mm) </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Stérile </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> Stérile, conserver au réfrigérateur, de la glutamine inclus </td></tr><tr> &lt;td&gt; Sérum fœtal bovin </td><td> Cellgro </td><td> 35-010-CV </td><td> Stériles, entreposer des portions congelées </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine / antifongique </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> Stériles, entreposer des portions congelées </td></tr><tr><td> Tapez 9 paraffine </td><td> Richard-Allan scientifique </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1X D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> Stérile </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 16% </td><td> EM Sciences </td><td> 15710 </td><td> Assurez-frais, réfrigéré magasin </td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde 8% </td><td> EM Sciences </td><td> 16019 </td><td> Assurez-frais, réfrigéré magasin </td></tr><tr><td> Prévention des risques biotechnologiques Niveau 2 hotte </td><td> Divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultra-faible congélateur </td><td> Divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Imprimante cassette Sakura </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura VIP300 </td><td> Sakura </td><td></td><td> Processeur de paraffine automatique </td></tr><tr><td> Gare inclusion dans la paraffine </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs et équipements spécifiques.

collection protocol for human pancreas

Cette dissection et la procédure d&#39;échantillonnage a été développé pour le réseau de donneurs d&#39;organes pancréatiques avec diabète (nPOD) programme visant à normaliser la préparation du pancréas récupéré de donneurs d&#39;organes cadavériques. Le pancréas est divisé en 3 régions principales (tête, corps, queue), suivis par série des coupes transversales à travers le dedans de l&#39;axe latéral. Sections alternées sont utilisées pour la paraffine fixe et frais blocs congelés et des échantillons restantes sont hachées pour la préparation des échantillons congelés pression, avec ou sans inhibiteurs de RNAse, de l&#39;ADN, l&#39;ARN, ou l&#39;isolement des protéines. L&#39;objectif global de la procédure de dissection du pancréas est d&#39;échantillonner le pancréas entier, tout en conservant l&#39;orientation anatomique. L&#39;hétérogénéité des cellules endocrines en termes de composition des îlots, la taille et le nombre est indiqué pour des îlots humains par rapport à 1 îlots de rongeurs. La majorité des îlots humains à partir de la tête du pancréas, les régions du corps et la queue sont composées de l&#39;insuline-containing les cellules ß suivie par de plus faibles proportions de glucagon contenant les alpha-cellules et la somatostatine contenant ô-cellules. Le polypeptide pancréatique des cellules contenant PP et les cellules epsilon ghréline contenant sont également présents mais en petit nombre. En revanche, la région unciforme contient îlots qui sont principalement composées de cellules pancréatiques PP polypeptide contenant 2. Ces variations régionales des îlots de Langerhans proviennent des différences de développement. Le pancréas se développe à partir des bourgeons pancréatiques ventrale et dorsale de l&#39;intestin antérieur et après la rotation de l&#39;estomac et du duodénum, ​​les lobes se déplace ventrales et fusibles avec la 3 dorsale. Le lobe ventrale forme la partie postérieure de la tête y compris le processus unciforme tandis que le lobe dorsale donne lieu à la suite de l&#39;organe. La variation du pancréas régional est également signalé à la région de la queue ayant une densité plus élevée par rapport à l&#39;îlot d&#39;autres régions et les dorsales du lobe dérivés composants qui subissent une atrophie sélective diabète de type 1 <sjusqu&#39;à&gt; 4,5. Organes et de tissus supplémentaires sont souvent récupérés par les donneurs d&#39;organes et incluent des ganglions lymphatiques du pancréas, la rate et les ganglions lymphatiques non-pancréatiques. Ces échantillons sont récupérés avec des formats similaires à ceux de l&#39;pancréas avec l&#39;addition d&#39;isolement de cellules cryoconservées. Lorsque le duodénum proximal est inclus avec le pancréas, la muqueuse duodénale peuvent être collectées pour des blocs de paraffine et congelées et préparations pression hachés surgelés.

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Collection Protocol for Human Pancreas

Cette vidéo montre une procédure pour le traitement de la dissection pancréas humain dans des formats multiples de stockage. L&#39;orientation anatomique est maintenu dans toutes les régions du pancréas pour permettre la définition de la composition et la densité de l&#39;îlot régionale.

Protocole de collecte des pancréas humain

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Research

JoVE Journal

Medicine

14.7K vues.  University of Florida. Cette vidéo montre une procédure pour le traitement de la dissection pancréas humain dans des formats multiples de stockage. L'orientation anatomique est maintenu dans toutes les régions du pancréas pour permettre la définition de la composition et la densité de l'îlot régionale.

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Recherche

Médecine

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Collection, isolement, et cytométrie en flux analyse des échantillons Endocervical humain

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

Un protocole détaillé pour Transpiration surveillance utilisant un roman, petit appareil sans fil

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modèle de souris pour une Transplantation du pancréas en utilisant une Technique mis à jour le brassard

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Dissection du pancréas de souris pour faire une analyse histologique et profilage métabolique

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The recent rise of robotic and laparoscopic pancreatic surgery has found benefits such as reduced time to functional recovery. Few studies have reported on the feasibility, technique and outcome of robotic LPJ, especially including transection of the gastroduodenal artery. The present study describes the main steps for robotic LPJ in a patient with painful chronic pancreatitis with a dilated main pancreatic duct. The patient underwent robotic LPJ. The LPJ anastomosis is performed using a running suture technique in a longitudinal side-to-side manner. Routinely, the gastroduodenal artery is transected to drain the entire length of the main pancreatic duct. The patient is in French position; 7 trocars are placed (4 robotic, 2 laparoscopic assistants, 1 liver-retractor). After docking of the robot system, the omental bursa is opened, and the right gastroepiploic artery and vein are ligated at their base at the lower border of the pancreas. Intraoperative ultrasonography is performed in order to determine trajectory of the dilated main pancreatic duct which is opened for its entire length after the gastroduodenal artery has been suture ligated both cranially and caudally from the main pancreatic duct. A Roux limb is created, and a latero-lateral PJ is fashioned using several 3-0 barbed sutures. A stapled jejuno-jejunostomy is created at sufficient distance from the pancreatic anastomosis, aided by a 50 cm suture. The described technique for robotic LPJ is a complex but feasible operation for patients with treatment refractory CP and a dilated main pancreatic duct. Due to its complexity, implementation in high volume centers with extensive experience with CP surgery may improve outcomes.

Robotic lateral pancreaticojejunostomy (RLPJ) may be used in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis and a dilated main pancreatic duct. We describe a standardized and reproducible technique for RLPJ, which includes transection of the gastroduodenal artery.

Pancreaticojejunostomy latéral robotique pour la pancréatite chronique

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Robot-Assisted Kidney Transplantation

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed in the supine Trendelenburg position. Kidney allografts are provided by a living donor. Before vascular anastomosis, the kidney allograft is prepared by inserting a double-J stent in the ureter, and the temperature for the anastomosis is lowered by wrapping it in an ice-packed gauze. A 12 mm or 8 mm port for the robotic camera and three 8 mm ports for robotic arms are placed. A peritoneal pouch is created for the kidney allograft by raising the peritoneal flaps on both sides over the psoas muscle before dissecting the iliac vessels and bladder. A 6 cm Pfannenstiel incision is made to insert the kidney into the peritoneal pouch, lateral to the right iliac vessels. 
After clamping the external iliac vein with Bulldogs clamps, a venotomy is performed, and the graft renal vein is anastomosed to the external iliac vein in an end-to-side continuous manner with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture. After clamping the graft renal vein, the iliac vein is declamped. This is followed by clamping of the external iliac artery, arteriotomy, arterial anastomosis with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture, clamping of the graft renal artery, and declamping of the external iliac artery. Reperfusion is then carried out, and ureteroneocystostomy is performed using the Lich-Gregoir technique. The peritoneum is closed at a few locations with polymer locking clips, and a closed-suction drain is placed through one of the working ports. After deflating the pneumoperitoneum, all incisions are closed.

This paper provides technical details for robot-assisted kidney transplantation from a living donor.

Transplantation rénale assistée par robot

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Collecte, expansion et différenciation de modèles de cellules épithéliales nasales nasales humaines primaires pour la quantification de la fréquence des battements de cils

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ shortages and increasing numbers of patients being listed for PTx, new strategies are needed to increase the number of available grafts for transplantation. 
Static cold storage (SCS) is considered the gold standard for standard criteria organs. However, standard criteria donors (SCD) are becoming scarce and new strategies that can increase the rate of organ acceptance from extended criteria donors (ECD) are urgently needed. 
Normothermic ex vivo perfusion (NEVP) is one of the strategies that has become increasingly popular over the past couple of decades. This preservation method has already been used successfully in other organs (liver, kidneys, and lungs) but has been minimally explored in pancreas transplantation. The few papers that describe the method for pancreas show little success, edema being one of the major issues. The following manuscript describes the successful NEVP method and setup developed by our group to perfuse swine pancreas.

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic ex vivo machine perfusion (NEVP) has scarcely been explored for the preservation of pancreas allografts. We present an innovative preservation technique for pancreas allografts before transplantation.

Perfusion pancréatique ex vivo normamère pour la conservation des allogreffes de pancréas avant transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...

Surgical Tips and Tricks for Performing Porcine Pancreas Transplantation

Despite the promising results of pancreas transplantation in type 1 diabetes mellitus and metabolic syndrome, the biggest concern around this state-of-the-art technique remains the paucity of organs deemed fit for transplantation. High intravascular resistance, delicate intraparenchymal capillary framework, and complex lobular anatomy around the mesenteric vasculature are what make this organ more susceptible to injury and less tolerant to trivial trauma compared to organs such as the liver and kidney. Meticulous surgical dissection and judicious tissue handling form the cornerstone of the entire exercise of pancreas transplantation. Owing to morphological similarity between the anatomy of the porcine pancreas to the surrounding mesenteric vessels and the organs when compared to the human anatomy, demonstration of the technique in the porcine model could help to most accurately extrapolate this to a human setting. The present article aims to outline the essential surgical tips and tricks that need to be followed, in order to ensure a higher success rate of transplantation of this highly susceptible organ in a porcine 3-day survival model.

The video article summarizes the technique of pancreatectomy and pancreas allotransplantation in a porcine 3-day survival model with a step-by-step description of the method and emphasis on the surgical tips and tricks to deal with the precarious and delicate porcine visceral anatomy.