著者らは、ドナーの家族や専門家の支援のため、本研究とマリア·マルティーノとイリーナKusmartsevaに関与する臓器調達機関に感謝します。この作品は、糖尿病患者の膵臓の臓器提供者のネットワークをサポートする青少年糖尿病研究財団（MC-T.、MA）によって資金を供給された。

1。セットアップ<ol><li>鉛筆で、または自動的にカセット·プリンタを手動でパラフィンブロックのラベルカセット。ドナー識別子（CaseID）、サンプルの種類、分量番号、および任意の追加を一意に識別（ケースワークシートが含ま<a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">付録1</a> ）。 </li><li>永久的なマーカーでカセットのラベルとして10月の金型。アルミ箔の5-10 cmの長方形を切り取ります。 </li><li>永久的なマーカーすべてのバイアル、チューブのラベルを印刷するか、手動で。新鮮な出荷のためのRPMIメディアとひき肉スナップ凍結サンプルとチューブの十分なバイアルが含まれています。 RNAlater中でスナップ凍結バイアルについては、各クライオバイアルに1 mLのRNAlaterを追加します。 </li><li>滅菌解剖器具（鉗子、メス、刃、ガーゼパッド（4×4））と同様の使用順に並んでカセットや10月の金型バイオセーフティーフードとカウンタートップの解剖ボードを設定します。 </li><li>置くことによって、凍結風呂の準備をする乾燥した少なくとも3 cmの深さまで中小発泡スチロールの箱（10×10センチ）の氷とドライアイスが完全に覆われるまで、イソペンタンを追加します。 </li><li>オプション：液体窒素デュワー小さなコンテナを記入してください。 </li><li>膵臓は、電子顕微鏡（EM）のために必要な場合は、1.25 mLの16％パラホルムアルデヒド、1.25 mLの8％のグルタルアルデヒド、および7.5 mLの0.1M PBSを加えることによってTAABの固定を準備します。 7.5mLの0.1M PBSに2.5 mLの16％パラホルムアルデヒドを添加することによりLowicryl固定を準備します。 </li><li>細胞を単離するために使用される溶液を準備します。以下を追加しながらDMEFの500ミリリットルボトル（グルタミンを含む）に、無菌テクニックを、次のとおりです。 <ol><li>ウシ胎児血清（FBS）：最終追加50mLの10％。 </li><li>ペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌、10,000 U / mLの/ 10,000 ug / mlのストック） - 100 U / mLの/ 100ug/mLの最終濃度をRPMIに5 mLのペン/連鎖球菌株を追加します。また、リンパ節や脾臓のサンプルを保持するために使用するDPBS 500mlのボトルに5ミリリットルを追加します。 </li></ol></li></ol> 2。人員<oL&gt; <li>プロシージャは最適しかし手順が1つのよく訓練個々で行うことができる3人のスタッフで実現されます。二人の個人は、一般的に90分で手続きを完了することができます。実際の期間は、受信した組織や膵リンパ節を見つけることの容易さの数値に依存しています。セルアイソレーションのサンプルは4℃で保持されます°Cを組織郭清の完成までの血清サンプルを並列に処理されている間。 </li><li>病理医は、病理学助手、または同等の経験豊富なスタッフが、組織の処理をリードし、膵頭部と収穫膵臓リンパ節の分割（S）を含む主要な解剖を行います。初期の努力はリンパ節のために周囲の膵脂肪の検査に続いて膵臓に向けられている。 </li><li>その主な責任は固定と凍結ブロックおよびスナップ凍結vの膵臓と地域トリム組織​​の重量を量ることですトリミング組織の訓練を受けた検査技師または等価スタッフIALS。病理アシスタントから十二指腸と脾臓を受信すると、病理アシスタントは膵臓を処理している間に、これらの臓器を処理します。 </li><li>ブロックとバイアルのラベル、cryovials用ミンチのサンプル、および血清処理など、他の人を支援する実験助手·スタッフ。 </li></ol> 3。膵臓の解剖<ol><li>十二指腸と脾臓を除去し、鈍と鋭い解剖を使用して、余分な脂肪、血管、神経の膵臓をきれいに</li><li>紙タオルで覆われた解剖基板上にきれいに膵臓を配置します。膵臓の前面にある青色のインクと普及に綿棒を浸します。過剰をオフにブロット。 </li><li>オプション：膵臓の後面に黒インクと普及の新しいアプリケーターを浸します。死体を解剖する人が直面している前面の通常の向きに膵臓を返します。 </li><li>頭、体、尾（ 図1）：3領域に膵臓を切った。 HEAの間の接合部を切断dとボディは、ボディとテールのために〜に等しい部分に残りの部分を分割します。 </li><li>膵臓とレコードの重み（ケース後処理シート（の各領域を量り<a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">付録1</a> ））。 </li><li>セクション（〜0.5 cm）の横方向の&quot;パン一斤&quot;の方法（ 図1）で、膵臓の各地域。 </li><li>みじん切りにしたサンプルの地域間の両方の接合部からセクションを使用しています。膵臓の大きさに応じて、体尾部の接合領域からのサンプルはパラフィンブロックの数を得ることができる膵臓頭部、ボディ領域からミンチのサンプルまたはサンプルのみを取得するために減少させることができ、その場合に得ることが困難かもしれません。頭や接合部の近位の領域を示すために体によるとしてラベルcryovials。 <ol><li>の部分をミンチとcryovials（バイアルあたり≥1グラム）との間で均等に分割します。急速に液体窒素やドライアイスでRNAlaterでなく、バ​​イアルを凍結 - イソペンタンスラリーは、tを転送OA -80℃の冷凍庫。 </li><li>平衡を可能にするために、室温で30分間RNAlater中でバイアルを維持し、急速にリミックスして、その後-80℃の冷凍庫に移し、液体窒素やドライアイス·イソペンタンスラリー中のフリーズ。 </li></ol></li><li>パラフィン、パラフィン（ 図1）で始まる10月ブロックの交互のセクションを削除します。 </li><li>右側にあるすべての横断面を傾けます。 </li><li>場所〜カセットで1.5×1.5×0.5 cmのセクションでは、。横断面が大きすぎる場合、半分（ 図2b）にカット。 &quot;A&quot;と &quot;B&quot;として後半に青前半のラベルカセット。 </li><li>作品はまだ大きすぎる場合、以前のカット（ 図2c）にそれぞれ垂直な断面を切った。時計回りの方法でラベルカセットは、AD。カセット内に収まるように、必要に応じてさら​​に作品をトリミングします。 </li><li>順次地域内の数ブロック、最も内側のセクションから始まる。 </li><li>パラフィンブロック、位置cのラベルなどassettesは、​​その方向を維持し、カセットに左にと場所を組織することです。閉じるカセットの蓋と中性〜500 mlの10％は（NBF）緩衝ホルマリンを使用してコンテナに転送する。最後のカセットを固定で配置されているタイミングの固定を開始します。 </li><li> OCTのブロックでは、標識し金型内に10月のメディアの薄層を注ぐその後、方向を維持し、10月に組織をカバーしている金型の組織を置く。 〜1分のイソペンタンスラリー - 急速にドライアイス中で10月の金型を浸漬。一時的な記憶のためにドライアイス上または-80でスラリーとの場所から削除する長期保存のための°Cの冷凍庫。 </li><li>電子顕微鏡（EM）のヘッド·ボディ接合部から約0.5×0.5 cmのスライスを取得します。 TAABの固定とLowicryl固定の他のスライスで1つのスライスを配置します。少なくとも48時間、および/または無期限にEMのためにさらに処理まで。のために4℃でサンプルと固定の両方のタイプを保存する</li></ol> 4。脾臓、リンパ節Dissectionsと十二指腸粘膜解剖<ol><li>脂肪からの膵臓リンパ節（PLN）を分離し、ノードのカプセルへのすべての結合組織をトリミングします。 DMEFを含む滅菌細胞培養皿の中の場所。隔離された総数に応じて、新鮮な出荷、凍結保存細胞のアイソレーション、パラフィンおよび/または10月のブロック、およびバイアルのアリコートにPLNに分割します。 0.5センチメートルより大きくない部分に大規模なノードをミンチ。 </li><li>小さな（〜0.5 cm）の立方体に非膵臓リンパ節と脾臓をミンチ。出発物質の量に応じて新鮮なサンプル出荷または凍結細胞のアイソレーションのために固定、OCTメディア、またはDMEMに置きます。 </li><li>十二指腸を開き、ゆっくりと湿らせたガーゼパッドで粘膜の十二指腸粘膜をきれいに拭いてください。ととRNAlaterでなく、パラフィンおよび/またはバイアルの凍結のOCTブロックとみじん切りにしたサンプルの粘膜の部分をカットします。他のサンプルと同様にフリーズします。 </li></ol> 5。事前に標識されたアルミ箔と場所10月·ブロック内のラップOCTのブロックと<html> -80℃で長期保存のためのボックス内のバイアル℃の 6。パラフィン処理のための固定のサンプルを提出<ol><li>自動パラフィンプロセッサを使用するか、または手動でタイミングを使用して16時間（範囲20±4時間）のために組織を固定します。自動プロセッサ（を使用してパラフィンブロックを処理する<a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">付録2</a> ）。 </li><li>左側にカセットラベルが付いた死体を解剖する人によって置かとして正確な向きでセクションを埋め込むことができます。粘膜下に粘膜に垂直の検査を可能にするために切断面と十二指腸粘膜下に埋め込むことができます。 </li></ol> 7。解剖エリアを清掃し、消毒する。解剖器具を洗浄、再滅菌する。生物廃棄物として貯蔵するためのホルマリン固定で残りのヒト組織を配置します。 1ヶ月以内に地域の規則に従って医学廃棄物を廃棄します。 8。サンプルの在庫システムを更新ve_title &quot;&gt; 9。代表的な結果この手順では、2時間以内という3つの主要な地域、頭部、体尾部の境界を含む臓器全体の代表的なサンプリングで、無傷のヒト膵臓を処理します。後部頭部に見られる鉤状領域は、頭部郭清に含まれています。糖尿病のない臓器提供者の中央値は膵臓重量が82.4グラム（ - 139.0グラム52.7）であった。膵臓地域の重みは（ 図3）とほぼ同じであった。 また、この手順では、シーケンシャルパラフィンとOCTブロックから染色されたスライドを使用して全体の膵臓の再建を可能にすることができる。複数のフォーマットは、現在および将来の技術の最大活用を可能にする実現可能である。現在nPODケースワークシートは、（提供されている<a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">付録1</a>回収試料とその後のprocを文書化するために使用されている）アリコートの種類と量によってディエッシング。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> 図1。手順の全体的なスキーム。解剖学的方位を維持しながら、全体の膵臓が処理されます。頭部には、鉤状領域を含む後方地域で腹膵臓葉の存在のために優れた劣性軸に長くなっています。接合部の斜線エリアはcryovialsでひき肉のサンプルに使用される領域を示す。 P、パラフィン、O、10月<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> 図2。膵臓セクションのレタリング方式を採用しています。横膵臓スライスがさらに半分または四半期に分割され、時計回りの方法で、文字のことができます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> 図3。糖尿病の臓器ドナーから膵臓の重み。大人のドナー（&gt; 17歳）からの無傷の膵臓が得られる地域や地域の重みに分けた後秤量した。データは平均±SEM（N = 15）です。

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	<li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li><li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas:+the+effects+of+age+and+diabetes.">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li><li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas:+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development.">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li><li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+concentration+in+the+head,+body,+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas.">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li><li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas.">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li><li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources.">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li><li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies.">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li><li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hy&#246;ty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+&#946;-cell+autoimmunity.">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of &#946;-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li><li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors.">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li><li>T&#246;ns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans.">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

この手順の目的は、複数のコレクションのサイト間で調和することができます標準の膵臓の処理を定義するため、異なったグループによって得られた結果の比較を可能にすることです。解剖法は、域内の分割に続く主要な膵臓領域の注釈の追加の手順と標準的な外科病理プラクティスに基づいています。生物検体処理方法の標準化などの国立がん研究所6として国家のバイオバンクの?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 22ブレードを搭載したメスを含む解剖器具</td><td>さまざまな</td><td>さまざまな</td><td></td></tr><tr><td>遠心管（15〜50 ml）を</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 05-539-5、430828 </td><td>無菌の</td></tr><tr><td>クリオチューブ（1.8 ml）を</td><td> VWR北米</td><td> 89004-300 </td><td>滅菌、バーコードオプション</td></tr><tr><td> RNAlaterは</td><td> Ambionの</td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td>病理インク</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カセット</td><td>メルセデスメディカル</td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 1ニュートラル0％緩衝ホルマリン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> OCT凍結メディア</td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td>金型</td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td>様々なサイズ</td></tr><tr><td>イソペンタン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> O3551-4 </td><td> 10月ゾッとお風呂</td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td> 10月ゾッとお風呂</td></tr><tr><td>デュワーフラスコ内の液体窒素</td><td></td><td></td><td>凍結cryovialsスナップ</td></tr><tr><td>細胞培養皿（長さ100mm） </td><td>コー​​ニング</td><td> 430167 </td><td>無菌の</td></tr><tr><td>ハイクローンDMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td>滅菌、保管、冷蔵、グルタミンが含まれている</td></tr><tr> &lt;TD&gt;ウシ胎児血清</td><td> Cellgro </td><td> 35から010-CV </td><td>滅菌、保管、冷凍のアリコート</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/抗真菌薬</td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td>滅菌、保管、冷凍のアリコート</td></tr><tr><td>タイプ9パラフィン</td><td>リチャード·アラン·サイエンティフィック</td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1X D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td>無菌の</td></tr><tr><td> 16％パラホルムアルデヒド</td><td> EMサイエンス</td><td> 15710 </td><td>冷蔵新鮮な店を作る</td></tr><tr><td> 8％のグルタルアルデヒド</td><td> EMサイエンス</td><td> 16019 </td><td>冷蔵新鮮な店を作る</td></tr><tr><td>バイオセーフティレベル2のフード</td><td>さまざまな</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超低冷凍庫</td><td>さまざまな</td><td></td><td></td></tr><tr><td>さくらカセットプリンター</td><td>桜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>さくらVIP300 </td><td>桜</td><td></td><td>自動パラフィンプロセッサ</td></tr><tr><td>パラフィン包埋ステーション</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1特異的試薬および装置。

collection protocol for human pancreas

この解離およびサンプリング手順は、死体臓器提供者から回収された膵臓の準備を標準化するための糖尿病（nPOD）プログラムと膵臓の臓器提供者のためのネットワーク用に開発されました。膵臓は、横軸の内側全体に連続横断切片に続いて3つの主要領域（頭、体、尾）に分かれています。交互にセクションが固定パラフィン包埋に使用され、新鮮凍結ブロックと残りのサンプルは、DNA、RNA、またはタンパク質を分離するため、RNアーゼ阻害剤の有無に関わらずどちらかは、スナップ凍結試料調製のために刻まれています。膵臓の解剖手順の全体的な目標は、解剖学的配向性を維持しながら、全体の膵臓をサンプリングすることである。 膵島組成、サイズ、および数字の面で内分泌細胞の不均一性は、齧歯類膵島1に比べてヒト膵島 ​​のために報告されています。膵頭部、膵体尾部領域からのヒト膵島の大半はインスリンcontaininで構成されていますgのβ細胞は、低い割合に続いてグルカゴンを含有するα細胞、δ細胞をソマトスタチン含有します。膵臓ポリペプチドを含有するPP細胞とグレリン含有イプシロン細胞も存在するが、少数である。対照的に、鉤状領域は主に2膵ポリペプチドを含有するPP細胞から構成されている島が含まれています。これらの地域の膵島バリエーションが発達の違いから生じる。膵臓は、前腸と胃や十二指腸、背3腹葉の動きやヒューズの回転後の腹側と背側膵臓芽から開発しています。腹葉は背側葉、臓器の残りの部分を生じさせる一方鉤状突起を含む頭部の後方部分を形成する。地域の膵臓の変化はまた、尾部領域では1型糖尿病で選択萎縮を受けて他の地域と背側葉由来の成分に比べて高い膵島密度を有すると報告されている<sアップ&gt; 4,5。 追加の臓器や組織は、多くの場合、臓器提供者から回収し、膵臓のリンパ節、脾臓および非膵臓リンパ節を含んでいる。これらのサンプルは、凍結保存細胞の単離を加えた膵臓の場合と同様の形式で回収される。近位十二指腸が膵臓に含まれている場合は、十二指腸粘膜にはパラフィンや冷凍ブロックとひき肉スナップ凍結の準備のために収集されることがあります。

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Collection Protocol for Human Pancreas

このビデオでは、複数のストレージ形式にヒト膵臓を処理するための解剖の手順を示しています。解剖学的なオリエンテーションは、地域の膵島の組成と密度の定義を可能にするために、膵臓領域を通して維持されています。

ヒト膵臓の収集プロトコル

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Research

JoVE Journal

Medicine

14.7K ビュー.  University of Florida. このビデオでは、複数のストレージ形式にヒト膵臓を処理するための解剖の手順を示しています。解剖学的なオリエンテーションは、地域の膵島の組成と密度の定義を可能にするために、膵臓領域を通して維持されています。

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

医学

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

汗は小説、小型、ワイヤレスデバイスを使用した監視するための詳細なプロトコル

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

変更されたカフを用いた膵臓移植マウス モデル

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

マウスの膵臓の組織学的解析と代謝プロファイリングに対する郭清

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The recent rise of robotic and laparoscopic pancreatic surgery has found benefits such as reduced time to functional recovery. Few studies have reported on the feasibility, technique and outcome of robotic LPJ, especially including transection of the gastroduodenal artery. The present study describes the main steps for robotic LPJ in a patient with painful chronic pancreatitis with a dilated main pancreatic duct. The patient underwent robotic LPJ. The LPJ anastomosis is performed using a running suture technique in a longitudinal side-to-side manner. Routinely, the gastroduodenal artery is transected to drain the entire length of the main pancreatic duct. The patient is in French position; 7 trocars are placed (4 robotic, 2 laparoscopic assistants, 1 liver-retractor). After docking of the robot system, the omental bursa is opened, and the right gastroepiploic artery and vein are ligated at their base at the lower border of the pancreas. Intraoperative ultrasonography is performed in order to determine trajectory of the dilated main pancreatic duct which is opened for its entire length after the gastroduodenal artery has been suture ligated both cranially and caudally from the main pancreatic duct. A Roux limb is created, and a latero-lateral PJ is fashioned using several 3-0 barbed sutures. A stapled jejuno-jejunostomy is created at sufficient distance from the pancreatic anastomosis, aided by a 50 cm suture. The described technique for robotic LPJ is a complex but feasible operation for patients with treatment refractory CP and a dilated main pancreatic duct. Due to its complexity, implementation in high volume centers with extensive experience with CP surgery may improve outcomes.

Robotic lateral pancreaticojejunostomy (RLPJ) may be used in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis and a dilated main pancreatic duct. We describe a standardized and reproducible technique for RLPJ, which includes transection of the gastroduodenal artery.

慢性膵炎に対するロボット横膵イェノ間切全切全切全切り

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Robot-Assisted Kidney Transplantation

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed in the supine Trendelenburg position. Kidney allografts are provided by a living donor. Before vascular anastomosis, the kidney allograft is prepared by inserting a double-J stent in the ureter, and the temperature for the anastomosis is lowered by wrapping it in an ice-packed gauze. A 12 mm or 8 mm port for the robotic camera and three 8 mm ports for robotic arms are placed. A peritoneal pouch is created for the kidney allograft by raising the peritoneal flaps on both sides over the psoas muscle before dissecting the iliac vessels and bladder. A 6 cm Pfannenstiel incision is made to insert the kidney into the peritoneal pouch, lateral to the right iliac vessels. 
After clamping the external iliac vein with Bulldogs clamps, a venotomy is performed, and the graft renal vein is anastomosed to the external iliac vein in an end-to-side continuous manner with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture. After clamping the graft renal vein, the iliac vein is declamped. This is followed by clamping of the external iliac artery, arteriotomy, arterial anastomosis with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture, clamping of the graft renal artery, and declamping of the external iliac artery. Reperfusion is then carried out, and ureteroneocystostomy is performed using the Lich-Gregoir technique. The peritoneum is closed at a few locations with polymer locking clips, and a closed-suction drain is placed through one of the working ports. After deflating the pneumoperitoneum, all incisions are closed.

This paper provides technical details for robot-assisted kidney transplantation from a living donor.

ロボット支援腎移植

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

繊毛拍動頻度の定量化のための初代ヒト鼻上皮細胞モデルの収集、拡大、および分化

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ shortages and increasing numbers of patients being listed for PTx, new strategies are needed to increase the number of available grafts for transplantation. 
Static cold storage (SCS) is considered the gold standard for standard criteria organs. However, standard criteria donors (SCD) are becoming scarce and new strategies that can increase the rate of organ acceptance from extended criteria donors (ECD) are urgently needed. 
Normothermic ex vivo perfusion (NEVP) is one of the strategies that has become increasingly popular over the past couple of decades. This preservation method has already been used successfully in other organs (liver, kidneys, and lungs) but has been minimally explored in pancreas transplantation. The few papers that describe the method for pancreas show little success, edema being one of the major issues. The following manuscript describes the successful NEVP method and setup developed by our group to perfuse swine pancreas.

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic ex vivo machine perfusion (NEVP) has scarcely been explored for the preservation of pancreas allografts. We present an innovative preservation technique for pancreas allografts before transplantation.

移植前の膵臓同種移植片の保存のための標準母性 Ex vivo 膵臓灌流

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...

Surgical Tips and Tricks for Performing Porcine Pancreas Transplantation

Despite the promising results of pancreas transplantation in type 1 diabetes mellitus and metabolic syndrome, the biggest concern around this state-of-the-art technique remains the paucity of organs deemed fit for transplantation. High intravascular resistance, delicate intraparenchymal capillary framework, and complex lobular anatomy around the mesenteric vasculature are what make this organ more susceptible to injury and less tolerant to trivial trauma compared to organs such as the liver and kidney. Meticulous surgical dissection and judicious tissue handling form the cornerstone of the entire exercise of pancreas transplantation. Owing to morphological similarity between the anatomy of the porcine pancreas to the surrounding mesenteric vessels and the organs when compared to the human anatomy, demonstration of the technique in the porcine model could help to most accurately extrapolate this to a human setting. The present article aims to outline the essential surgical tips and tricks that need to be followed, in order to ensure a higher success rate of transplantation of this highly susceptible organ in a porcine 3-day survival model.

The video article summarizes the technique of pancreatectomy and pancreas allotransplantation in a porcine 3-day survival model with a step-by-step description of the method and emphasis on the surgical tips and tricks to deal with the precarious and delicate porcine visceral anatomy.