Yazarlar, donörlerin aileleri ve uzman yardımı için bu araştırma ve Maria Martino ve Irina Kusmartseva yer Organ İhale Organizasyonlar teşekkür ederim. Bu çalışma Diyabet ile Pankreas Organ Bağış için Ağ destek Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (MC-T., MA) tarafından finanse edildi.

1. Set-up <ol><li> Bir kalemle veya otomatik bir kaset yazıcı ile el parafin blokları için etiket kasetleri. Donör tanımlayıcı (CaseID), numune tipi, tablet sayısı ve herhangi bir ek benzersiz bir kimlik (Olgu çalışma, Include <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Ek 1</a> ). </li><li> Kalıcı bir kalem ile kaset olarak Etiket Ekim kalıplar. Alüminyum folyo 5-10 cm dikdörtgenler kesin. </li><li> Kalıcı bir kalem bütün şişeler ve tüpler ile etiket yazdırmak veya manuel. Taze gönderiler için RPMI medya ile kıyılmış ek donmuş numuneler ve tüpler için yeterli şişeleri ekleyin. RNAlater ile ek dondurulmuş şişeleri için, her cryovial 1 ml RNAlater ekleyin. </li><li> Sterilize diseksiyon aletleri (forseps, neşter, bıçaklar, gazlı bez (4x4)) yanı sıra kaset ve OCT kalıpları ile biyogüvenlik kaput ve tezgahlar Set-up diseksiyon panoları kullanım sırasına göre düzenlenmiş. </li><li> Koyarak dondurucu bir banyo hazırlayınKuru en az 3 cm derinliğe kadar orta büyüklükte bir strafor kutu (10x10 cm) buz ve kuru buz tamamen kaplıdır kadar izopentan ekleyin. </li><li> İsteğe Bağlı: sıvı nitrojen ile küçük bir Dewar doldurun. </li><li> Pankreas elektron mikroskobu (EM) için gerekli ise, 1.25 mL% 16 paraformaldehit, 1.25 mL% 8 glutaraldehit ve 7.5 mL 0.1M PBS ekleyerek TAAB fiksatif hazırlamak. 7.5 mL 0.1M PBS 2.5 mL% 16 paraformaldehit ekleyerek Lowicryl fiksatif hazırlayın. </li><li> Hücreler izole etmek için kullanılan çözümler hazırlayın. Aşağıdaki eklerken DMEF 500 ml şişe (glutamin ile), aseptik teknikler aşağıda: <ol><li> Fetal sığır serumu (FBS): add 50mL, son 10%. </li><li> Penisilin / Streptomisin (Kalem / Strep, 10.000 U / mL / 10,000 ug / mL stok) - 100 U / mL / 100ug/mL son konsantrasyon için RPMI 5 ml Kalem / Strep stok ekleyin. Ayrıca, lenf düğümleri ve dalak örnekleri tutmak için kullanılan DPBS bir 500 ml&#39;lik şişe için 5 ml ilave edilir. </li></ol></li></ol> 2. Personel <ol&gt; <li> Prosedür optimum üç personeli ise işlem bir iyi eğitilmiş birey ile yapılabilir gerçekleştirilir. İki bireyler genellikle 90 dakika içinde işleminizi yapabilirsiniz. Gerçek süresi alınan dokuların numaraları bağlıdır ve pankreatik lenf düğümleri bulma kolaylığı. Hücre izolasyonları için Örnekler 4 yapılmaktadır ° C ye kadar doku diseksiyonu tamamlanması serum örneklerinde paralel olarak işlenirken. </li><li> Patolog, patoloji asistanı veya eşdeğeri-deneyimli personel doku işleme açar ve pankreas başı bölünmesi (ler) de dahil olmak üzere ve pankreatik lenf düğümleri hasat büyük disseksiyonlar gerçekleştirir. İlk çabaları lenf düğümleri için peri-pankreatik yağ muayenesini takiben pankreas yöneliktir. </li><li> Laboratuvar teknisyeni veya eşdeğeri-personel, temel sorumlulukları sabit ve donmuş blokları ve ek dondurulmuş v için pankreas ve bölgeler ve trim dokular tartmak olan kırpma doku eğitimIALS. Patoloji asistanı ile duodenum ve dalak alır ve patoloji asistanı pankreas işlerken bu organların işler. </li><li> Blok ve şişe etiketleme, cryovials için kıyma örneği ve serum işleme dahil olmak üzere diğer yardımcı laboratuvar asistanı-personel. </li></ol> 3. Pankreas Diseksiyon <ol><li> Duodenum ve dalak çıkarın ve künt ve keskin diseksiyon kullanılarak gereksiz yağ, damar ve sinirlerin pankreas temizlemek </li><li> Kağıt havlu ile örtülü bir diseksiyon gemide temizlenmiş pankreas yerleştirin. Pankreasın ön yüzünde mavi mürekkep ve yayılmasında bir pamuk uçlu aplikatör batırın. Fazla gelen lekeyi silin. </li><li> İsteğe Bağlı: Pankreasın arka yüzeyinde siyah mürekkep ve yayılmasında yeni bir aplikatör batırın. Ön yüzey prosector bakan normal yönlendirmeye pankreas dönün. </li><li> Baş, gövde ve kuyruk (Şekil 1): 3 bölgeye pankreas kesin. Hea arasındaki bağlantı kesind ve sonra vücut, vücut ve kuyruk için ~ eşit kısma kalan kısmını bölün. </li><li> Pankreas ve kayıt ağırlıkları (Olgu workup sayfası (her bölge tartılır <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Ek-1</a> )). </li><li> Bölüm (~ 0.5 cm) enine bir &quot;Ekmek&quot; bir şekilde (Şekil 1) pankreas her bölge. </li><li> Kıyma örnekleri için bölgeler arasında kavşak gelen bölümleri kullanın. Pankreas boyutuna bağlı olarak, vücudun-kuyruk bileşke bölgesinden bir numune parafin blok sayısı elde edilebilir pankreas kafası-vücut bölgesinden kıyılmış numune ya da yalnızca örnek elde etmek için düşük olabilir ve bu durumda elde etmek zor olabilir. Baş veya kavşakta proksimal bölge belirtmek için vücut olarak göre Etiket cryovials. <ol><li> Adet kıyma ve cryovials (flakon başına ≥ 1 gram) arasında eşit olarak bölün. Hızla sıvı azot veya kuru buz RNALater olmadan şişeleri dondurmak - izopentan bulamaç ardından t aktarmakoa -80 ° C derin dondurucuda. </li><li> Dengelenmesi için izin vermek için 30 dakika için oda sıcaklığında RNALater ile şişe tutmak, hızla remix ve daha sonra bir derin dondurucu -80 ° C transfer sıvı azot içinde ya da kuru buz-izopentan bulamaç içinde donma. </li></ol></li><li> Parafin ve parafin (Şekil 1) ile başlayan Ekim blokları için alternatif bölümleri kaldırın. </li><li> Sağa doğru enine bölüm eğimlidir. </li><li> Yeri ~ 1.5 x 1.5 kasetlere x 0.5 cm bölümleri. Enine kesitler çok büyükse, yarım (Şekil 2b) kesti. &quot;B&quot; &quot;A&quot; ve posterior yarısı gibi mavi anterior yarısı için etiket kasetleri. </li><li> Parçaları hala çok büyükse, önceki kesme (Şekil 2c) için her bölüm dik olarak kesilmiş. Saat yönünde bir şekilde etiket kasetleri AD. Daha kaseti sığdırmak için gerekli parçaları kesin. </li><li> En medyal bölümü ile başlayarak bölge içinde sırayla numarası bloklar,. </li><li> Parafin bloklar, pozisyon cböylece etiketli assettes yönünü koruyarak, kaset içine sol ve yerinde doku etmektir. Kapat kaset kapağı ve ~ 500 ml% 10&#39;luk nötral bir konteyner aktarma (NBF) tamponlu formalin. Son kaset sabitleştirici yerleştirilir zamanlama fiksasyon başlayın. </li><li> Ekim blokları için prelabeled kalıp içine Ekim medyanın ince bir tabaka dökün yönlendirme sonra korumak ve OCT ile doku karşılandığından emin olmak kalıp doku yatıyordu. ~ 1 dakika izopentan bulamaç - Hızla bir kuru buz kalıpları Ekim batırmayın. Geçici depolama için kuru buz veya -80 olarak çamur ve yerden kaldırma, uzun süreli depolama için ° C derin dondurucuda. </li><li> Elektron mikroskobu (EM) için baş-beden ayrımından ~ 0.5 x 0.5 cm dilimleri alın. TAAB sabitleştirici ve Lowicryl sabitleştirici diğer dilim koyun bir dilim. En az 48 saat ve / veya belirsiz bir süre için EM işlenmek. Için 4 ° C&#39;de numunelerin ile sabitleştirici Her iki tip depolamak </li></ol> 4. Dalak, lenf nodu diseksiyonuASIZ ve Duodenum Mukoza Diseksiyonlarında <ol><li> Yağdan pankreatik lenf düğümleri (PLN) yalıtmak ve düğüm kapsül tüm bağ dokusu kırpın. DMEF içeren steril hücre kültür kaplarına koyun. Izole edilen toplam sayı bağlı olarak, taze gönderiler, soğukta saklanan hücre izolasyonları, parafin ve / veya Ekim blokları ve flakon için kısma PLN bölün. 0.5 cm&#39;den daha büyük parçalar halinde büyük düğümleri kıyma. </li><li> Küçük (~ 0.5 cm) küpler halinde olmayan pankreatik lenf bezleri ve dalak kıyma. Başlangıç ​​maddelerinin miktarlarına göre taze örnek gönderiler veya dondurulmuş hücre izolasyonları için fiksatörü, Ekim medya ve ya DMEM yerleştirin. </li><li> Duodenum açın ve hafifçe ıslatılmış gazlı bezle mukus duodenal mukoza silin. Ve RNAlater olmadan, parafin ve / veya flakon için dondurulmuş Ekim blokları ve kıyma örnekleri için mukozasının bölümleri kesin. Diğer örnekleri gibi dondurun. </li></ol> 5.. Önceden etiketli alüminyum folyo ve yeri Ekim blokları ve içine al Ekim bloklar<html> -80 uzun süreli saklama için kutuları şişeleri ° C 6. Parafin İşleme Sabit Örnekleri gönderin <ol><li> Otomatik bir parafin işlemci kullanarak ya da manuel zamanlama kullanarak 16 saat boyunca dokular (aralığı 20 ± 4 saat) sabitleyin. Otomatik bir işlemci (parafin bloklara işlemek <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">Ek 2</a> ). </li><li> Sol kaset etiketi ile prosector tarafından yerleştirilmiş olarak kesin yönde bölümleri Embed. Submukozaya mukoza dik muayene izin kesim yüzeyi ile duodenal mukoza aşağı Embed. </li></ol> 7. Diseksiyon alanları temizleyin ve dezenfekte edin. Diseksiyon aletleri yıkayın ve tekrar sterilize. Biyomedikal atık depolama için formalin fiksatif içinde kalan insan dokularında yerleştirin. Bir ay içinde yerel yönetmeliklere göre biyomedikal atık atın. 8. Örnek Envanter Sistemi Güncelleme ve_title &quot;&gt; 9. Temsilcisi Sonuçlar Bu işlem üç büyük yani bölgeler, baş, gövde ve 2 saat içinde kuyruk çizimi de dahil olmak organın her temsili örnekleme bozulmamış bir insan pankreas işleyecek. Posterior kafa bölgesinde bulunan unsinat bölgesi, kafa Diseksiyon dahildir. Diyabeti olmayan organ bağışında bulunan ortalama pankreas ağırlığı 82.4 gram (- 139.0 gram 52.7) idi. Pankreas bölgesel incelme (Şekil 3) yaklaşık eşit düzeydeydi. Bu işlem aynı zamanda sıralı parafin ve OCT bloklardan lekeli slaytlar kullanarak tüm pankreas rekonstrüksiyonu için izin verebilirsiniz. Çoklu biçimleri mevcut ve gelecek teknolojiler için maksimum kullanımı için izin mümkün bulunmaktadır. Mevcut nPOD durumda çalışma (sağlanmaktadır <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Ek 1</a> kurtarıldı örnekleri ve sonraki proc belgelemek için kullanılan)tablet türleri ve miktarları ile Essing. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> Şekil 1.. Anatomik yönelimleri korurken prosedür genel şeması. Tamamı pankreas işlenir. Kafa bölgesinde unsinat bölgesi içerir arka bölgede ventral pankreas lobun varlığı nedeniyle, üstün-inferior eksen daha uzundur. Kavşaklarda çizili alana cryovials içinde kıyılmış numuneler için kullanılan bölgeleri ifade eder. P, Parafin, O, Ekim <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> Şekil 2. Pankreas bölümler için Yazı düzeni. Enine pankreas dilim fazla iki ya da dört ayrılır ve saat yönünde bir şekilde harfli edilebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> Şekil 3. Diyabeti olmayan organ bağışında gelen Pankreas ağırlıkları.yetişkin bağışçılar (&gt; 17 yaş) intakt pankreas edilen bölgeler ve bölgesel incelme ayrılmıştır sonra tartıldı. Veriler ortalama ± SEM (N = 15).

<ol>
	<li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li><li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas:+the+effects+of+age+and+diabetes.">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li><li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas:+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development.">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li><li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+concentration+in+the+head,+body,+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas.">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li><li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas.">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li><li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources.">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li><li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies.">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li><li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hy&#246;ty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+&#946;-cell+autoimmunity.">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of &#946;-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li><li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors.">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li><li>T&#246;ns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans.">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu prosedürün amacı birden toplama siteler arasında uyumlu olabilir standart bir pankreas işleme tanımlamak ve böylece farklı gruplar tarafından elde edilen sonuçları karşılaştırabilme sağlamaktır. Diseksiyon yöntemi bölge-içi alt bölümleri tarafından takip başlıca pankreas bölgelerin açıklama için ek adımlar ile standart cerrahi patoloji uygulamalarına dayanmaktadır. Biospecimen işleme yöntemlerinin standartlaştırılması, Ulusal Kanser Enstitüsü 6 ulusal biobanking kuru...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 22 bıçak neşter dahil Diseksiyon araçları </td><td> Çeşitli </td><td> Çeşitli </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj tüpler (15 ve 50 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-539-5, 430.828 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> Cryotubes (1.8 ml) </td><td> VWR North America </td><td> 89004-300 </td><td> Steril, bar kodları isteğe </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Cerrahi Patoloji Mürekkep </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kasetler </td><td> Mercedes Tıp </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 1Nötr 0% Formalin Tamponlu </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> Ekim Donma Medya </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Kalıplar </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> Çeşitli boyutlarda </td></tr><tr><td> Izopentan </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3551-4 </td><td> Ekim ürpertici banyo </td></tr><tr><td> Donmuş karbondioksit </td><td></td><td></td><td> Ekim ürpertici banyo </td></tr><tr><td> Dewar şişede sıvı azot </td><td></td><td></td><td> Dondurma cryovials çekin </td></tr><tr><td> Hücre kültürü çanak (100mm) </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> Steril, mağaza buzdolabında, glutamin dahil </td></tr><tr> &lt;td&gt; Fetal Bovine Serum </td><td> Cellgro </td><td> 35-010-CV </td><td> Steril, mağaza dondurulmuş alikotları </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin / Antifungal </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> Steril, mağaza dondurulmuş alikotları </td></tr><tr><td> 9 Parafin yazın </td><td> Richard-Allan Bilimsel </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1X D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> % 16 Paraformaldehyde </td><td> EM Bilimleri </td><td> 15710 </td><td> Taze, mağaza buzdolabında olun </td></tr><tr><td> % 8 Glutaraldehyde </td><td> EM Bilimleri </td><td> 16019 </td><td> Taze, mağaza buzdolabında olun </td></tr><tr><td> Biyolojik Güvenlik Seviye 2 başlık </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultra-düşük dondurucu </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura Kaset Yazıcı </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura VIP300 </td><td> Sakura </td><td></td><td> Otomatik parafin işlemci </td></tr><tr><td> Parafin gömülmesi İstasyonu </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özel reaktifleri ve ekipmanları.

collection protocol for human pancreas

Bu diseksiyon ve örnekleme prosedürü kadavradan organ bağışında kurtarıldı pankreas hazırlanması standardize etmek Diyabet (nPOD) programı ile Pankreas Organ Bağış için Ağ için geliştirilmiştir. Pankreas yanal eksene medial boyunca seri enine kesitler ardından 3 ana bölgede (baş, gövde, kuyruk) ayrılmıştır. Alternatif bölümleri sabit parafin ve taze dondurulmuş blokları ve kalıntı numuneler için kullanılan DNA, RNA ve protein izolasyon için olan ya da olmayan RNAse inhibitörleri ya ek dondurulmuş Örnek preparatlar için kıyılmış edilir. Pankreas Diseksiyon işlemin genel amacı anatomik yönelimi korurken tamamını pankreas örneklemek etmektir. Adacık bileşimi, büyüklüğü ve sayısı açısından Endokrin hücre heterojenitesini kemirgen adacıklar 1&#39;e göre, insan adacıkları bildirilmektedir. Pankreas başı insan adacık çoğunluğu, vücut ve kuyruk bölgelerinde insülin containin oluşurg β-hücrelerinin düşük oranlarda takiben glukagon içeren α-hücreleri ve δ-hücreleri somatostatin-içeren. Pankreatik polipeptid içeren PP hücreleri ve ghrelin içeren epsilon hücreleri de mevcut fakat az sayıda bulunmaktadır. Bunun aksine, unsinat bölgesi esas pankreatik polipeptid içeren bir PP hücreleri 2 oluşan adacıklar içerir. Bu bölgesel farklılıklar adacık gelişimsel farklılıkları ortaya çıkar. Pankreas foregut ve mide ve onikiparmak bağırsağı, dorsal 3 ile ventral lobun hamle sigortalar ve dönüşten sonra ventral ve dorsal pankreas tomurcukları gelişir. Ventral lob dorsal lob organ kalanı yol açmaktadır ederken unsinat işlemi de dahil olmak üzere başının arka kısmını teşkil eder. Bölgesel farklar da pankreas kuyruk bölgesi, tip 1 diyabette selektif atrofi geçiren diğer bölge ve dorsal lob kaynaklı bileşenlerine kıyasla daha yüksek adacık yoğunluğuna sahip olan bildirilmektedir <skadar&gt; 4,5. Ek organ ve dokular genellikle organ bağışında kurtarıldı ve pankreatik lenf bezleri, dalak ve non-pankreatik lenf düğümleri içerir. Bu numuneler Kriyoprezerve hücrelerinin izolasyon ilavesi ile pankreas için de benzer biçimleri ile geri kazanılmaktadır. Proksimal duodenum, pankreas dahil edildiğinde, duodenal mukoza parafin ve dondurulmuş bloklar ve kıyılmış ek donmuş hazırlıkları için toplanmış olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Collection Protocol for Human Pancreas at JoVE.com

Collection Protocol for Human Pancreas

Bu video çoklu depolama biçimleri içine insan pankreas işlemek için bir diseksiyon yordam gösterir. Anatomik oryantasyon bölgesel adacık bileşimi ve yoğunluğu tanımı izin pankreas bölgeleri boyunca korunur.

İnsan Pankreas için Toplama Protokolü

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Research

JoVE Journal

Medicine

14.7K Görüntüleme.  University of Florida. Bu video çoklu depolama biçimleri içine insan pankreas işlemek için bir diseksiyon yordam gösterir. Anatomik oryantasyon bölgesel adacık bileşimi ve yoğunluğu tanımı izin pankreas bölgeleri boyunca korunur.

Video: Collection Protocol for Human Pancreas

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Tıp

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

Bir Roman kullanarak Terleme İzleme Detaylı Protokol, Küçük Kablosuz Aygıt

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Fare modeli değiştirilmiş manşet tekniği kullanarak pankreas nakli için

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Fare pankreas diseksiyon histolojik analiz ve metabolik profil oluşturma

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The recent rise of robotic and laparoscopic pancreatic surgery has found benefits such as reduced time to functional recovery. Few studies have reported on the feasibility, technique and outcome of robotic LPJ, especially including transection of the gastroduodenal artery. The present study describes the main steps for robotic LPJ in a patient with painful chronic pancreatitis with a dilated main pancreatic duct. The patient underwent robotic LPJ. The LPJ anastomosis is performed using a running suture technique in a longitudinal side-to-side manner. Routinely, the gastroduodenal artery is transected to drain the entire length of the main pancreatic duct. The patient is in French position; 7 trocars are placed (4 robotic, 2 laparoscopic assistants, 1 liver-retractor). After docking of the robot system, the omental bursa is opened, and the right gastroepiploic artery and vein are ligated at their base at the lower border of the pancreas. Intraoperative ultrasonography is performed in order to determine trajectory of the dilated main pancreatic duct which is opened for its entire length after the gastroduodenal artery has been suture ligated both cranially and caudally from the main pancreatic duct. A Roux limb is created, and a latero-lateral PJ is fashioned using several 3-0 barbed sutures. A stapled jejuno-jejunostomy is created at sufficient distance from the pancreatic anastomosis, aided by a 50 cm suture. The described technique for robotic LPJ is a complex but feasible operation for patients with treatment refractory CP and a dilated main pancreatic duct. Due to its complexity, implementation in high volume centers with extensive experience with CP surgery may improve outcomes.

Robotic lateral pancreaticojejunostomy (RLPJ) may be used in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis and a dilated main pancreatic duct. We describe a standardized and reproducible technique for RLPJ, which includes transection of the gastroduodenal artery.

Kronik Pankreatit için Robotik Lateral Pankreaticojejunostomi

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Robot-Assisted Kidney Transplantation

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed in the supine Trendelenburg position. Kidney allografts are provided by a living donor. Before vascular anastomosis, the kidney allograft is prepared by inserting a double-J stent in the ureter, and the temperature for the anastomosis is lowered by wrapping it in an ice-packed gauze. A 12 mm or 8 mm port for the robotic camera and three 8 mm ports for robotic arms are placed. A peritoneal pouch is created for the kidney allograft by raising the peritoneal flaps on both sides over the psoas muscle before dissecting the iliac vessels and bladder. A 6 cm Pfannenstiel incision is made to insert the kidney into the peritoneal pouch, lateral to the right iliac vessels. 
After clamping the external iliac vein with Bulldogs clamps, a venotomy is performed, and the graft renal vein is anastomosed to the external iliac vein in an end-to-side continuous manner with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture. After clamping the graft renal vein, the iliac vein is declamped. This is followed by clamping of the external iliac artery, arteriotomy, arterial anastomosis with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture, clamping of the graft renal artery, and declamping of the external iliac artery. Reperfusion is then carried out, and ureteroneocystostomy is performed using the Lich-Gregoir technique. The peritoneum is closed at a few locations with polymer locking clips, and a closed-suction drain is placed through one of the working ports. After deflating the pneumoperitoneum, all incisions are closed.

This paper provides technical details for robot-assisted kidney transplantation from a living donor.

Robot Yardımlı Böbrek Nakli

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Primer İnsan Nazal Epitel Hücre Modellerinin Silia Beat Sıklığının Ölçülmesi İçin Toplanması, Genleştirilmesi ve Farklılaştırılması

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ shortages and increasing numbers of patients being listed for PTx, new strategies are needed to increase the number of available grafts for transplantation. 
Static cold storage (SCS) is considered the gold standard for standard criteria organs. However, standard criteria donors (SCD) are becoming scarce and new strategies that can increase the rate of organ acceptance from extended criteria donors (ECD) are urgently needed. 
Normothermic ex vivo perfusion (NEVP) is one of the strategies that has become increasingly popular over the past couple of decades. This preservation method has already been used successfully in other organs (liver, kidneys, and lungs) but has been minimally explored in pancreas transplantation. The few papers that describe the method for pancreas show little success, edema being one of the major issues. The following manuscript describes the successful NEVP method and setup developed by our group to perfuse swine pancreas.

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic ex vivo machine perfusion (NEVP) has scarcely been explored for the preservation of pancreas allografts. We present an innovative preservation technique for pancreas allografts before transplantation.

Transplantasyon Öncesi Pankreas Allogreftlerinin Korunması için Normothermic Ex Vivo Pankreas Perfüzyonu

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...

Surgical Tips and Tricks for Performing Porcine Pancreas Transplantation

Despite the promising results of pancreas transplantation in type 1 diabetes mellitus and metabolic syndrome, the biggest concern around this state-of-the-art technique remains the paucity of organs deemed fit for transplantation. High intravascular resistance, delicate intraparenchymal capillary framework, and complex lobular anatomy around the mesenteric vasculature are what make this organ more susceptible to injury and less tolerant to trivial trauma compared to organs such as the liver and kidney. Meticulous surgical dissection and judicious tissue handling form the cornerstone of the entire exercise of pancreas transplantation. Owing to morphological similarity between the anatomy of the porcine pancreas to the surrounding mesenteric vessels and the organs when compared to the human anatomy, demonstration of the technique in the porcine model could help to most accurately extrapolate this to a human setting. The present article aims to outline the essential surgical tips and tricks that need to be followed, in order to ensure a higher success rate of transplantation of this highly susceptible organ in a porcine 3-day survival model.

The video article summarizes the technique of pancreatectomy and pancreas allotransplantation in a porcine 3-day survival model with a step-by-step description of the method and emphasis on the surgical tips and tricks to deal with the precarious and delicate porcine visceral anatomy.