המחברים מודים משפחות של תורמים איברים הרכש ארגונים העוסקים במחקר זה ומריה מרטינו ואירינה Kusmartseva לסיוע המומחה שלהם. עבודה זו מומנה על ידי Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) בתמיכה של רשת לעוגב תורמים הלבלב עם סוכרת.

1. הגדרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל הקלטות עבור אבני פרפין ידנית בעיפרון, או באופן אוטומטי עם המדפסת קלטת. כלול את מזהה התורם (CaseID), סוג הדוגמה, מספר aliquot, וכל זיהוי ייחודי נוסף (גליון מקרה, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">נספח 1</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית אוקטובר תבניות כמו על קלטות עם סמן קבע. לגזור מלבנים 5-10 ס&quot;מ של נייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדפיס או באופן ידני תווית עם סמן קבע את כל צלוחיות ואבובים. כלול צלוחיות מספיק דגימות עבור הצמד קצוצים צינורות קפואים עם התקשורת RPMI עבור משלוחים טריים. על צלוחיות קפואים חפוז עם RNAlater, להוסיף 1 מ&quot;ל RNAlater כדי cryovial כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לוחות הנתיחה של בטיחות ביולוגית מכסה המנוע ואת צמרות הדלפק עם מכשירים הנתיחה מעוקרות (מלקחיים, אזמלים, להבים, פדי גזה (4x4)), כמו גם קלטות ותבניות אוקטובר מסודרים לפי סדר השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין אמבטיה קפוא על ידי הצבתקרח יבש בתוך קופסת קלקר בגודל בינוני (10x10 ס&quot;מ) עד לעומק של לפחות 3 ס&quot;מ ומוסיפים isopentane עד קרח יבש מכוסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: מילוי מיכל קטן דיואר עם חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הלבלב דרוש במיקרוסקופ אלקטרונים (EM), להכין מקבע TAAB ידי הוספת 1.25 paraformaldehyde מ&quot;ל 16%, 1.25 glutaraldehyde מ&quot;ל 8% ו 7.5 מ&quot;ל 0.1M PBS. הכן מקבע Lowicryl ידי הוספת 2.5 מ&quot;ל paraformaldehyde 16% עד 7.5 מ&quot;ל 0.1M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין פתרונות המשמשים לבידוד תאים. בקבוק 500 מ&quot;ל של DMEF (עם גלוטמין), בצע את טכניקות אספטיים תוך הוספת הבאה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסרום שור עוברית (FBS): הוסף 50 מ&quot;ל, 10% הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פניצילין / סטרפטומיצין (עט / דלקת, 10,000 יח&#39; / מ&quot;ל ​​/ 10000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​המלאי) - להוסיף 5 פן / דלקת המניות מ&quot;ל כדי RPMI ריכוז סופי של 100 U / mL / 100ug/mL. גם להוסיף 5 מ&quot;ל בקבוק 500 מ&quot;ל של DPBS כאשר נעשה שימוש לקיום קשרי הלימפה או דוגמאות הטחול. </li></ol></li></ol> 2. כוח אדם <oאני&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההליך מתבצע בצורה אופטימלית עם שלושה אנשי צוות יחד עם זאת ההליך יכול להתנהל עם אדם אחד מאומנים היטב. שני אנשים יכולים בדרך כלל, להשלים את ההליך ב -90 דקות. משך בפועל תלויה במספר רקמות שהתקבלו וקלות מציאת בלוטות הלימפה הלבלב. דוגמאות עבור isolations התא מתקיימים 4 ° C עד תום לנתיחה רקמות תוך דגימות סרום מעובדים במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , הפתולוג עוזר פתולוגיה, או שווה ערך, חבר צוות מנוסה מוביל טיפול רקמות ומבצע והניתוחים הגדולות, כולל חלוקה (ים) של ראש הלבלב והקציר בלוטות הלימפה הלבלב. המאמצים הראשונים מכוונים הלבלב ואחריו בדיקה של שומן פרי, הלבלב עבור בלוטות הלימפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכנולוג מעבדה או שווה ערך, חבר צוות מאומן רקמות זמירה שאת האחריות העיקרית יש לשקול הלבלב אזורים ורקמות לקצץ עבור בלוקים קבועים קפוא עבור הצמד V קפואials. התריסריון מקבל והטחול מ עוזר פתולוגיה תהליכים אלה איברים תוך עוזר הפתולוגיה הוא עיבוד הלבלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוזרו, צוות המעבדה חבר המסייע השאר, כולל גוש וסימון הבקבוקון, מדגם המכובדת של cryovials, ועיבוד בסרום. </li></ol> 3. הלבלב Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התריסריון והטחול ולנקות את הלבלב של שומן, כלי זרים, והעצבים באמצעות דיסקציה בוטה וחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הלבלב ניקה על לוח לנתח מכוסה במגבות נייר. טובלים צמר גפן המוליך שקצהו בדיו התפשטות כחול על פני השטח הקדמי של הלבלב. למחוק את העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: טובלים המוליך החדש בדיו התפשטות שחור על פני השטח האחורי של הלבלב. חזור הלבלב לכיוון הרגיל עם השטח הקדמי מול prosector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הלבלב ל 3 אזורים: ראש, גוף וזנב (איור 1). חותכים את הצומת בין heaד והגוף מכן לחלק את החלק הנותר ~~~HEAD=NNS חלקים שווים של הגוף והזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את כל האזור של משקולות הלבלב שיא (מקרה הבדיקות גיליון ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">נספח 1</a> )). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף (~~~HEAD=NNS 0.5 ס&quot;מ) כל האזור של הלבלב ב באופן רוחבי &quot;כיכר הלחם&quot; (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסעיפים משני צמתים בין אזורים עבור דגימות טחון. בהתאם לגודל הלבלב, מדגם מאזור גוף זנב בצומת עלול להיות קשה להשיג במקרה זה את מספר אבני פרפין יכול להיות ירידה להשיג דגימות קצוצים או דוגמאות בלבד מאזור הלבלב ראש הגוף ניתן להשיג. תווית cryovials לפי ראש או גוף לציון באזור הפרוקסימלי בצומת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר טחון החלקים ולחלק שווה בשווה בין cryovials (≥ 1 גרם לכל בקבוקון). במהירות להקפיא צלוחיות ללא RNALater בחנקן נוזלי או קרח יבש - slurry isopentane מכן להעביר tOA -80 מעלות במקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צלוחיות עם RNALater בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, כדי לאפשר איזון, רמיקס במהירות להקפיא בחנקן נוזלי או slurry קרח יבש isopentane מכן להעביר את המקפיא -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של חלקים מתחלפים עבור פרפין וחוסם אוקטובר החל פרפין (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להישען על כל הסעיפים רוחביים ימינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ~ 1.5 x 1.5 x 0.5 ס&quot;מ סעיפים הקלטות. אם בסעיפים רוחביים הם גדולים מדי, בחצי (איור 2b). לייבל הקלטות למחצית הקדמי כחול &quot;&quot; וחצי האחורי כמו &quot;B&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החלקים עדיין גדול מדי, מנותק מדי בניצב סעיף לקיצוץ הקודם (איור 2 ג). קלטות תווית לספירה באופן כיוון השעון. חתוך לחתיכות הדרושים נוספת כדי להתאים קלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר בלוקים ברצף בתוך האזור, החל בחלק המדיאלי ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בלוקים פרפין, עמדה גassettes כך התווית היא שמאלה במקום רקמות לתוך קלטת, שמירה על האוריינטציה שלו. המכסה סגור קלטת והעברת למיכל עם ~ 500 מ&quot;ל 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין (NBF). התחל קיבעון העיתוי כאשר את הקלטת האחרונה ממוקם מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בלוקים לאוקטובר, יוצקים שכבה דקה של אוקטובר מדיה לתוך תבנית prelabeled ואז להניח את רקמות עובש להיות בטוח כדי לשמור על האוריינטציה ומכסים רקמות עם אוקטובר לטבול במהירות את תבניות אוקטובר בקרח יבש - slurry isopentane דקה 1 ~. הסר slurry ומניחים על קרח יבש לאחסון זמני או -80 ° C במקפיא לאחסון ארוך טווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ~~~HEAD=NNS 0.5 x 0.5 ס&quot;מ פרוסות מצומת ראש הגוף של מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM). מקום אחד פרוסה מקבע TAAB ו פרוסה אחר מקבע Lowicryl. אחסן את שני סוגי מקבע עם דגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 48 שעות ו / או ללא הגבלת זמן עד עיבוד נוסף עבור EM. </li></ol> 4. , טחול לימפה הצומת Dissecולהמליץ ​​רירית התריסריון והניתוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את בלוטות הלימפה הלבלב (PLN) משומן לקצץ את כל רקמת החיבור אל הקפסולה הצומת. מקום בצלחת סטרילית התרבות התא המכיל DMEF. בהתאם המספרים הכוללים מבודדים, לחלק PLN אל aliquots עבור משלוחי טריים, isolations סלולריים cryopreserved, פרפין / או בלוקים לאוקטובר, ואת צלוחיות. בשר טחון צמתים גדולים לחתיכות לא גדולות יותר מ -0.5 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר טחון הלבלב ללא בלוטות לימפה וטחול אל ~~~HEAD=NNS (0.5 ס&quot;מ) לקוביות קטנות. מקום מקבע, אוקטובר מדיה, או DMEM למשלוחים מדגם טריים או isolations סלולריים cryopreserved לפי כמויות של חומרי המוצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התריסריון בעדינות לנגב את רירית התריסריון נקי של ריר עם כרית גזה לח. לחתוך קטעים של רירית עבור פרפין ו / או קפואים אבני אוקטובר דגימות טחון על צלוחיות, עם ובלי RNAlater. להקפיא כמו דוגמאות אחרות. </li></ol> 5. לעטוף בנייר כסף אוקטובר בלוקים מראש שכותרתו אלומיניום ומניחים אבני אוקטובר ו<html> צלוחיות בתיבות עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות ג 6. שלח דוגמאות קבוע עבור עיבוד פרפין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון רקמות במשך 16 שעות (טווח של 20 ± 4 שעות) באמצעות מעבד פרפין אוטומטית או ידנית באמצעות תזמון. תהליך רחובות פרפין באמצעות מעבד אוטומטי ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">נספח 2</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ סעיפים בכיוון המדויק כפי שבוצעה על ידי prosector עם תווית קלטת משמאל. להטביע את רירית התריסריון עם משטח חיתוך למטה על מנת לאפשר בדיקה של ניצב רירית כדי submucosa. </li></ol> 7. יש לנקות ולחטא תחומים הנתיחה. לשטוף כלים הנתיחה מחדש לחטא. מניחים רקמות שריד האדם מקבע פורמלין לאחסון כפסולת ביו. מחק פסולת ביו פי התקנות המקומיות תוך חודש. 8. לעדכן את מערכת מלאי לדוגמא ve_title &quot;&gt; 9. נציג תוצאות הליך זה יהיה תהליך הלבלב האנושי שלם עם מדגם מייצג לאורך כל איבר כולל סימון של שלושה אזורים מרכזיים, כלומר, הראש, הגוף והזנב תוך 2 שעות. האזור אונקלי, נמצא באזור הראש האחורי, נכלל לנתיחה הראש. משקל הלבלב החציוני תורמים איברים ללא סוכרת היה 82.4 גרם (52.7 - 139.0 גרם). משקולות הלבלב אזוריות היו שווים כ (איור 3). הליך זה יכול גם לאפשר את שיקומה של הלבלב כולו באמצעות שקופיות מוכתמים מן פרפין רציף וחוסם אוקטובר. בפורמטים מרובים הם ריאלי המאפשר ניצול מרבי של טכנולוגיות הנוכחיים והעתידיים. בגליון הנוכחי במקרה nPOD מסופק ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">נספח 1</a> ) המשמש לתעד דוגמאות התאושש proc לאחר מכןessing ידי aliquot סוגים וכמויות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> באיור 1. התוכנית הכוללת של ההליך. הלבלב כולו מעובד תוך שמירה על נטיות אנטומיים. באזור הראש ארוך בציר מעולה, נחות בשל נוכחותם של האונה הלבלב הגחון באזור האחורי הכולל את האזור אונקלי. אזור בקעו בצמתים לציין אזורים המשמשים דגימות קצוצים cryovials. P, פרפין, O, אוקטובר <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> איור 2. ערכת האותיות של סעיפים הלבלב. פרוסות הלבלב רוחביים ניתן לחלק לחצאים או לרבעים ו בכתב בצורה כיוון השעון. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> איור 3. הלבלב משקולות איברים מתורמים ללא סוכרת. אתהלבלב שלם מתורמים מבוגרים (&gt; 17 שנים) נשקל מכן מחולקים לאזורים ומשקולות אזוריים שהתקבלו. הנתונים הם ממוצעים ± SEM (N = 15).

<ol>
	<li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li><li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas:+the+effects+of+age+and+diabetes.">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li><li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas:+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development.">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li><li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+concentration+in+the+head,+body,+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas.">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li><li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas.">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li><li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources.">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li><li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies.">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li><li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hy&#246;ty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+&#946;-cell+autoimmunity.">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of &#946;-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li><li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors.">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li><li>T&#246;ns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans.">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

מטרת נוהל זה היא להגדיר עיבוד הלבלב הרגיל יכול להיות המתואמת פני אתרים מרובים איסוף ובכך לאפשר השוואה של התוצאות שהושגו על ידי קבוצות שונות. שיטת לנתיחה מבוסס על תקן נהלי הפתולוגיה כירורגית עם צעדים נוספים ביאור האזורים הלבלב העיקריים ואחריו התוך אזוריים יחידות משנ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> דיסקציה מכשירים כולל אזמלים עם 22 להבים </td><td> שונים </td><td> שונים </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגות מבחנות (15 ו - 50 מ&quot;ל) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 05-539-5, 430828 </td><td> סטרילי </td></tr><tr><td> Cryotubes (1.8 מ&quot;ל) </td><td> VWR בצפון אמריקה </td><td> 89004-300 </td><td> סטריליים, בר קודים אופציונליים </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> דיו פתולוגיה כירורגית </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> קלטות </td><td> מרצדס רפואי </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 10% ניטרלי שנאגרו פורמלין </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> אוקטובר Media הקפאת </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> תבניות </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> בגדלים שונים </td></tr><tr><td> Isopentane </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> O3551-4 </td><td> אוקטובר מצמרר אמבטיה </td></tr><tr><td> קרח יבש </td><td></td><td></td><td> אוקטובר מצמרר אמבטיה </td></tr><tr><td> חנקן נוזלי בבקבוק ויסקי </td><td></td><td></td><td> הצמד cryovials הקפאת </td></tr><tr><td> תרבות צלחת תא (100 מ&quot;מ) </td><td> קורנינג </td><td> 430167 </td><td> סטרילי </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> חנות סטרילית, בקירור, כולל גלוטמין </td></tr><tr> &lt;td&gt; בסרום שור עוברית </td><td> Cellgro </td><td> 35-010-CV </td><td> סטריליות, aliquots קפואים חנות </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין / פטריות </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> סטריליות, aliquots קפואים חנות </td></tr><tr><td> הקלד 9 פרפין </td><td> ריצ&#39;רד אלן, מדעי </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1X D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> סטרילי </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> EM למדעים </td><td> 15710 </td><td> להפוך את החנות טרי, בקירור </td></tr><tr><td> 8% Glutaraldehyde </td><td> EM למדעים </td><td> 16019 </td><td> להפוך את החנות טרי, בקירור </td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית רמה 2 מכסה המנוע </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נמוך במיוחד במקפיא </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קלטת סאקורה מדפסת </td><td> סאקורה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סאקורה VIP300 </td><td> סאקורה </td><td></td><td> פרפין אוטומטי מעבד </td></tr><tr><td> הטבעה פרפין תחנה </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים ספציפיים וציוד.

collection protocol for human pancreas

דיסקציה זה הליך הדגימה שפותח עבור רשת לעוגב תורמים הלבלב עם תוכנית (nPOD) סוכרת לתקנן הכנת הלבלב התאושש תורמי איברים מוות. הלבלב מחולק ל -3 אזורים עיקריים (ראש, גוף, זנב) ואחריו חלקים רוחביים סדרתי ברחבי המדיאלי על ציר לרוחב. חלקים מתחלפים משמשים פרפין קבוע בלוקים קפואים טריים דגימות שריד הם טחון עבור הצמד ההכנות מדגם קפואים, עם או בלי RNAse מעכבי, כי ה-DNA, RNA, או בידוד חלבון. המטרה הכללית של ההליך לנתיחה הלבלב הוא לדגום את הלבלב כולו, תוך שמירה על הכיוון אנטומי. תא האנדוקרינית הטרוגניות מבחינת הרכב גודל איון,, ומספרים מדווח על איים אדם לעומת איים מכרסמים 1. רוב איים אדם מן הראש הלבלב, אזורי הגוף והזנב מורכבים containin אינסוליןגרם בטא תאים ואחריו פרופורציות נמוכות יותר של גלוקגון, המכיל אלפא-תאים ו somatostatin המכילים δ-תאים. פוליפפטיד המכיל תאים בלבלב PP ו גרלין המכילים תאים אפסילון גם כיום, אך במספרים קטנים. לעומת זאת, האזור מכיל אונקלי איים אשר מורכב ברובו פוליפפטיד המכיל תאים בלבלב עמ &#39;2. אלה וריאציות אזוריות איון נובעים הבדלים התפתחותיים. הלבלב מתפתחת ניצנים הלבלב הגחון ועל הגב ב במעי הקדמי ואחרי סיבוב של הקיבה והתריסריון, המהלכים באונה הגחון ומתאחה עם הגב 3. האונה הגחון מהווה את החלק האחורי של הראש כולל את תהליך אונקלי בעוד האונה הגב מעורר שאר האיברים. וריאציה הלבלב האזורית מדווח גם באזור הזנב בעל צפיפות גבוהה יותר איון בהשוואה לאזורים אחרים באונה הגבית הנגזרות רכיבים שעברו ניוון סלקטיבית של סוכרת מסוג 1 <sאת&gt; 4,5. איברים ורקמות נוספות הם התאוששו לעתים קרובות התורמים איברים וכוללים הלבלב בלוטות לימפה, טחול שאינם הלבלב בלוטות הלימפה. דוגמאות אלה הם התאוששו עם תבניות דומות של הלבלב עם תוספת של בידוד של תאים cryopreserved. כאשר התריסריון הפרוקסימלי כלול הלבלב, רירית התריסריון ניתן לאסוף עבור חוסם פרפין קפוא ותכשירים הצמד טחון קפוא.

Watch this Scientific Journal Video about Collection Protocol for Human Pancreas at JoVE.com

Collection Protocol for Human Pancreas

סרט הווידאו הזה מדגים הליך לנתיחה לעיבוד הלבלב האנושי לתוך תבניות אחסון מרובים. אוריינטציה אנטומי נשמר לאורך כל האזורים הלבלב כדי לאפשר הגדרת הרכב איון הצפיפות באזור.

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Research

JoVE Journal

Medicine

14.7K Views.  University of Florida. סרט הווידאו הזה מדגים הליך לנתיחה לעיבוד הלבלב האנושי לתוך תבניות אחסון מרובים. אוריינטציה אנטומי נשמר לאורך כל האזורים הלבלב כדי לאפשר הגדרת הרכב איון הצפיפות באזור.

Video: Collection Protocol for Human Pancreas

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

פרוטוקול מפורט עבור ניטור זיעה באמצעות רומן, קטן, מכשיר אלחוטי

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

העכבר מודל עבור השתלת לבלב בטכניקה השינוי הצמיד

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

דיסקציה של הלבלב העכבר עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The recent rise of robotic and laparoscopic pancreatic surgery has found benefits such as reduced time to functional recovery. Few studies have reported on the feasibility, technique and outcome of robotic LPJ, especially including transection of the gastroduodenal artery. The present study describes the main steps for robotic LPJ in a patient with painful chronic pancreatitis with a dilated main pancreatic duct. The patient underwent robotic LPJ. The LPJ anastomosis is performed using a running suture technique in a longitudinal side-to-side manner. Routinely, the gastroduodenal artery is transected to drain the entire length of the main pancreatic duct. The patient is in French position; 7 trocars are placed (4 robotic, 2 laparoscopic assistants, 1 liver-retractor). After docking of the robot system, the omental bursa is opened, and the right gastroepiploic artery and vein are ligated at their base at the lower border of the pancreas. Intraoperative ultrasonography is performed in order to determine trajectory of the dilated main pancreatic duct which is opened for its entire length after the gastroduodenal artery has been suture ligated both cranially and caudally from the main pancreatic duct. A Roux limb is created, and a latero-lateral PJ is fashioned using several 3-0 barbed sutures. A stapled jejuno-jejunostomy is created at sufficient distance from the pancreatic anastomosis, aided by a 50 cm suture. The described technique for robotic LPJ is a complex but feasible operation for patients with treatment refractory CP and a dilated main pancreatic duct. Due to its complexity, implementation in high volume centers with extensive experience with CP surgery may improve outcomes.

Robotic lateral pancreaticojejunostomy (RLPJ) may be used in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis and a dilated main pancreatic duct. We describe a standardized and reproducible technique for RLPJ, which includes transection of the gastroduodenal artery.

Pancreaticojejunostomy לרוחב רובוטיים עבור דלקת לבלב כרונית

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Laparoscopic Radical Left Pancreatectomy for Pancreatic Cancer: Surgical Strategy and Technique Video

Radical resection margins, resection of Gerota&#8217;s (perirenal) fascia, and adequate lymph node dissection are crucial for an adequate oncological resection of left-sided pancreatic cancer. Several surgical techniques have been described in recent years, but few were specifically designed for minimally invasive approaches. This study describes and demonstrates a standardized and reproducible technique for an adequate oncological resection of pancreatic cancer: laparoscopic radical left pancreatectomy (LRLP).
A 61-year-old woman presented with an incidental finding of a 3 cm mass in the left pancreas suspect for malignancy. Imaging did not reveal distant metastases, central vascular involvement, or morbid obesity, hence the patient was suitable for LRLP. This study describes the main steps of LRLP for pancreatic cancer. First, the lesser sac is opened by transecting the gastrocolic ligament. The splenic flexure of the colon is mobilized and the inferior border of the pancreas including Gerota&#39;s fascia is dissected down to the inferior border of the spleen. The pancreas is tunneled and hung, including Gerota&#8217;s fascia with a vessel loop. At the pancreatic neck, a tunnel is created between the pancreas and the portal vein, likewise a vessel loop is passed. The pancreas is then transected using the graded compression technique with an endostapler. Both the splenic vein and artery are transected before completing the resection. The entire specimen is extracted in a retrieval bag via a small Pfannenstiel incision.
Duration of the surgery was 210 min with 250 mL blood loss. Pathology revealed a R0-resection (&#62;1 mm) of a well-to-moderately differentiated adenocarcinoma originating from an intraductal papillary mucinous neoplasm. A total of 15 tumor-negative lymph nodes were resected. This is a detailed description of LRLP for left-sided pancreatic cancer as is currently being used within the international, multicenter randomized DIPLOMA (Distal Pancreatectomy Minimally Invasive or Open for PDAC) trial.

Oncologically safe left pancreatectomy requires radical resection (R0), Gerota&#8217;s (perirenal) fascia resection, and adequate lymph node dissection. This study describes the technical details of laparoscopic radical left pancreatectomy (LRLP), used in the first international multicenter randomized trial comparing minimally invasive with open left pancreatectomy for pancreatic cancer, the DIPLOMA trial.

לפרוסקופ שמאל רדיקלי ריתה לסרטן הלבלב: אסטרטגיה כירורגית טכניקה וידאו

Radical resection margins, resection of Gerota&#8217;s (perirenal) fascia, and adequate lymph node dissection are crucial for an adequate oncological ...

Robot-Assisted Kidney Transplantation

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed in the supine Trendelenburg position. Kidney allografts are provided by a living donor. Before vascular anastomosis, the kidney allograft is prepared by inserting a double-J stent in the ureter, and the temperature for the anastomosis is lowered by wrapping it in an ice-packed gauze. A 12 mm or 8 mm port for the robotic camera and three 8 mm ports for robotic arms are placed. A peritoneal pouch is created for the kidney allograft by raising the peritoneal flaps on both sides over the psoas muscle before dissecting the iliac vessels and bladder. A 6 cm Pfannenstiel incision is made to insert the kidney into the peritoneal pouch, lateral to the right iliac vessels. 
After clamping the external iliac vein with Bulldogs clamps, a venotomy is performed, and the graft renal vein is anastomosed to the external iliac vein in an end-to-side continuous manner with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture. After clamping the graft renal vein, the iliac vein is declamped. This is followed by clamping of the external iliac artery, arteriotomy, arterial anastomosis with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture, clamping of the graft renal artery, and declamping of the external iliac artery. Reperfusion is then carried out, and ureteroneocystostomy is performed using the Lich-Gregoir technique. The peritoneum is closed at a few locations with polymer locking clips, and a closed-suction drain is placed through one of the working ports. After deflating the pneumoperitoneum, all incisions are closed.

This paper provides technical details for robot-assisted kidney transplantation from a living donor.

השתלת כליה בסיוע רובוט

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ shortages and increasing numbers of patients being listed for PTx, new strategies are needed to increase the number of available grafts for transplantation. 
Static cold storage (SCS) is considered the gold standard for standard criteria organs. However, standard criteria donors (SCD) are becoming scarce and new strategies that can increase the rate of organ acceptance from extended criteria donors (ECD) are urgently needed. 
Normothermic ex vivo perfusion (NEVP) is one of the strategies that has become increasingly popular over the past couple of decades. This preservation method has already been used successfully in other organs (liver, kidneys, and lungs) but has been minimally explored in pancreas transplantation. The few papers that describe the method for pancreas show little success, edema being one of the major issues. The following manuscript describes the successful NEVP method and setup developed by our group to perfuse swine pancreas.

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic ex vivo machine perfusion (NEVP) has scarcely been explored for the preservation of pancreas allografts. We present an innovative preservation technique for pancreas allografts before transplantation.

זילוח לבלב Normothermic Ex Vivo לשימור אלושתלי לבלב לפני השתלה

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...

Surgical Tips and Tricks for Performing Porcine Pancreas Transplantation

Despite the promising results of pancreas transplantation in type 1 diabetes mellitus and metabolic syndrome, the biggest concern around this state-of-the-art technique remains the paucity of organs deemed fit for transplantation. High intravascular resistance, delicate intraparenchymal capillary framework, and complex lobular anatomy around the mesenteric vasculature are what make this organ more susceptible to injury and less tolerant to trivial trauma compared to organs such as the liver and kidney. Meticulous surgical dissection and judicious tissue handling form the cornerstone of the entire exercise of pancreas transplantation. Owing to morphological similarity between the anatomy of the porcine pancreas to the surrounding mesenteric vessels and the organs when compared to the human anatomy, demonstration of the technique in the porcine model could help to most accurately extrapolate this to a human setting. The present article aims to outline the essential surgical tips and tricks that need to be followed, in order to ensure a higher success rate of transplantation of this highly susceptible organ in a porcine 3-day survival model.

The video article summarizes the technique of pancreatectomy and pancreas allotransplantation in a porcine 3-day survival model with a step-by-step description of the method and emphasis on the surgical tips and tricks to deal with the precarious and delicate porcine visceral anatomy.