Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de la Fundación Familia Iacocca, Rosalind Franklin University fondos iniciales, y los Institutos Nacionales de Salud Grant DK092721 (a RVI). Los autores desean dar las gracias a Nikki intina para la ayuda en la preparación de manuscritos.

Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las pautas descritas en &quot;Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio&quot; (Institutos Nacionales de la Salud de la publicación no. 85-23, revisado 1985) y la aprobación Universidad Rosalind Franklin Cuidado de Animales institucional y el uso de animales Comité de protocolo 08-19. Hay 2 abreviaturas importantes que se utilizan en este manuscrito. 1) DM: se refiere a los peces que se encuentran en un estado de hiperglucemia aguda (300 mg / dl) y han sido por lo menos 3 semanas. 2) MM: se refiere a los peces que fueron 21 días (ver protocolo) DM pescado y se deja restaurar el control glucémico mediante la regeneración del páncreas. Esto se logra dentro de (14) días a partir de la eliminación del fármaco. Los peces se consideran peces MM desde este punto en adelante. También es importante tener en cuenta que el pescado que se conoce como control se tratan de manera idéntica como pescado DM o MM en términos del número de inyecciones (solución salina solamente), los tiempos de incubación a las temperaturas diferentes y el número y el momentode las amputaciones de la aleta caudal. 1. Generación de pez cebra con diabetes mellitus, Fish DM <ol><li> Preparar la recuperación y tanques de agua anestésicos. La recuperación es agua peces de agua normal. Para agregar suficiente agua anestésico 2-fenoxietanol para que una dilución 1:1.000 en los peces de agua normal se alcanza. </li><li> Preparar una solución de 0,3% (en una campana de humos) de estreptozocina (STZ) mediante la adición de 6 mg de STZ a 2 ml de cloruro de sodio 0,09% e inmediatamente colocar la solución en hielo. Esto proporcionará suficiente solución de inyección para la inyección de aproximadamente 20 peces en 20 min. Si supera los 20 minutos, detener y hacer una nueva solución STZ antes de continuar. En una alícuota separada tubo suficiente solución salina para peces de control. Una vez que la STZ se solubiliza todos los pasos subsiguientes no requieren el uso campana de humos. </li><li> Llene una jeringa de ½ cc equipada con una aguja de calibre 27 1/2 con las soluciones de STZ o control que garantice que no haya burbujas de aire atrapadas. </li><li> AnestesiaTize cada pez individual colocando el pez en el agua anestésico, y espere hasta que su movimiento de natación cesa (1-2 min). </li><li> Una vez anestesiaron brevemente colocar el pescado sobre una toalla de papel para absorber el exceso de agua, colocar el pescado en peso barco y medir la masa de los peces. </li><li> Coloque el pescado en una superficie firme (tapa plato Petri) para inyección. </li><li> Inyectar la STZ o solución de control en la cavidad peritoneal de los peces mediante la inserción de la aguja más allá del bisel en la cara posterior del peritoneo ventral. </li><li> 0,35 mg / g (350 mg / kg) de STZ deben ser entregados a cada pez y el volumen de la solución de 0,3% requerido se puede calcular de la siguiente manera. <ol class="lalpha"><li> Multiplicar la masa de pescado (g) por 0,35 para obtener la cantidad de STZ en mg requerida. </li><li> dividir el producto generado por encima de 3 para producir el volumen de la solución de 0,3% requerido para la inyección en l. Muestra: Para un pez 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 0,058 = 3 ml= 58 l. El mismo volumen sin la STZ sería inyectado para un control de los peces. Una hoja de volúmenes a inyectar por masa de pescado se genera y se utiliza como referencia rápida. </li></ol></li><li> Después de la inyección colocar los peces en el tanque de recuperación de agua y supervisarlos para la actividad de natación normal. Una vez que esto se ha logrado el pescado se transfiere a un tanque vida normal que se mantiene en el intervalo de temperatura reducida de 22 ° C - 24 ° C. Esta reducción de temperatura es crítico para la inducción eficiente de la hiperglucemia (diabetes mellitus, DM). </li><li> Aunque la hiperglucemia se detecta dentro de 24 horas de la primera inyección, con el fin de inducir un estado de hiperglucemia prolongada muy alto el pez cebra requieren una fase de inyección frecuente inducción seguida de inyecciones semanales de mantenimiento tal como se muestra a continuación. </li></ol> Semana 1: 3 inyecciones (día 1, 3, 5), Semana 2: 1 inyección (día 12), Semana 3: 1 inyección (día 19), Semana 4 (Día 21) Realizarensayo de interés. En este punto, el pez cebra se considera que han estado en un estado de hiperglucemia prolongada y mostrar las complicaciones diabéticas de la retinopatía, la nefropatía y la regeneración también se deteriora la aleta. Estos se conocen como peces DM. Además, si se desea, el pescado se puede mantener en el estado hiperglucémico con inyecciones semanales de mantenimiento. Aproximadamente el 5% la muerte durante este proceso se debe esperar. 2. Extracción de sangre y el nivel de glucemia en ayunas (FBGL) Determinación <ol><li> Cada grupo de peces DM y control debe incluir suficiente pescado para determinar con precisión la FBGL promedio del grupo en este ensayo requiere que estos peces que ser sacrificado. </li><li> Preparar una etiqueta tubo de PCR para cada muestra de sangre que contiene 5 l de solución salina normal estéril. </li><li> Para la recolección de sangre, anestesiar los peces que el anterior, retire toda el agua, colocar el pescado sobre un portaobjetos de microscopio y utilizando un bisturí, quitar la cabeza de los pecesen la base del opérculo. </li><li> Recoger la sangre (hasta 2 l) que se libera de los peces en la diapositiva y rápidamente añadirlo a la 5 l de solución salina normal estéril pipeteando arriba y abajo para asegurarse de que la sangre no obstruye. Colocar inmediatamente la muestra en hielo. </li><li> Determinar el volumen de muestra de sangre mediante la medición del volumen total del líquido (solución salina + sangre) y después de restar la 5 l de solución salina. </li><li> Transferir 5 l de la sangre diluida a partir de cada tubo de PCR en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y determinar la concentración de glucosa en sangre usando el Kit de Ensayo de Glucosa QuantiChrome. Esto se realiza siguiendo el protocolo del fabricante, sin excepción. Resultados esperados: normal / pescado de control 60 mg / dl y DM pescado 310 mg / dl. </li></ol> 3. Aleta caudal Regeneración Estudios <ol><li> Anestesiar pescado que se describe en 1.0-1.4. </li><li> Coloque el pescado en una tapa de la placa Petri y amputar la aleta caudal en una línea recta con un tamaño estéril10 escalpelo proximal a la primera lepidotrichia punto de ramificación durante la visualización de la aleta a través de un microscopio de disección. </li><li> Permiten a los peces recuperar como en 1,10 pero colocar el pescado a 33 º C para la fase de crecimiento regenerador del ensayo. Esta es una temperatura establecida para el análisis acelerado de la regeneración de la aleta. </li><li> Las aletas se pueden obtener imágenes en cualquier momento posterior a la amputación sin embargo que examinan rutinariamente el crecimiento regenerador a las 24, 28 y 72 horas después de trans-sección. </li><li> Anestesie pescado como antes (ver 1,0-1,4), coloque el pescado en un microscopio equipado con una cámara (nosotros usamos una Nikon SMZ-1500 equipado con una cámara Q-imagen) y recoge todas las imágenes de la aleta con una ampliación 1X con NIS elementos software . La aleta debe extenderse para formación de imágenes de modo que se extienda totalmente sin estirar o dañar el tejido y debe estar libre de cualquier gota de agua. Por consistencia siempre colocar el lado dorsal hacia la derecha. </li><li> Imprime imágenes y medir el gro regenerativaárea wth utilizando software Image J y el uso de una almohadilla de dibujo. Trace alrededor de toda el área de nuevo crecimiento y determinar el área. Cada medición se realizó cinco veces y se promediaron para asegurar la precisión de localización. Es importante que las imágenes utilizadas no tienen sombras o gotitas de agua dado que contribuyen a errores en la medición de la zona de derivación. </li><li> Medir la longitud de la zona de la amputación a lo largo del eje dorsal-ventral y dividir la superficie determinada en un 3,6 por esta medida. Esto permite que los peces de diferentes tamaños para ser comparados directamente. </li></ol> 4. Generación de Memoria Metabólica (MM) El pez cebra <ol><li> Iniciar un grupo de peces DM y sus controles apropiados como se describe en la sección 1. </li><li> A los 21 días determinar la FBGL para un subconjunto del grupo y dividir el pescado DM en 2 subgrupos. Continuar con inyecciones semanales STZ para uno de los grupos como los controles de DM para la duración del experimento. Cesar la inyección de STZ para el segundo grupo y incue el pescado a temperatura normal. Dentro de los 14 días estas pez cebra restaurará la insulina y la glucosa sanguínea normal de control a través de la regeneración del páncreas. Estos peces se llaman ahora MM (pescado memoria metabólica). </li><li> En el día 30 después de la eliminación del fármaco amputar las aletas caudales de control, DM y MM pescado a través del método descrito en el punto 3.2. </li><li> Volver pescado a las condiciones normales de agua para la regeneración de aleta durante 30 días. Esto permite el crecimiento de lo que el tejido plazo, memoria metabólica. </li><li> Al día 60 realizar una amputación segundos (como se describe en 3,2) en el tejido que se regenera en el período de 30 a 60 días y realizar el ensayo de regeneración aleta caudal (03.01 a 03.07) Figura 1. </li><li> Aislar tejido y realizar el ensayo de interés. Véase la Tabla 1 para un resumen de protocolo. </li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La diabetes mellitus es una enfermedad de desregulación metabólica, diagnosticado inicialmente como la hiperglucemia, que finalmente resulta en daño del vaso sanguíneo que conduce a muchas complicaciones que todos persistir incluso después de la euglucemia se logra mediante la intervención farmacéutica. Esta persistencia de las complicaciones que se conoce como memoria metabólica y varios estudios recientes han examinado el papel que juegan los mecanismos epigenéticos en este fenómeno. Aquí se han detallado u...

La diabetes mellitus (DM) es un problema de salud grave y creciente que da lugar a la esperanza de vida reducida debido a la enfermedad microvascular específica (retinopatía, nefropatía, neuropatía, curación lenta de heridas) y macrovasculares (enfermedad cardiaca y accidente cerebrovascular) Complicaciones 1. Una vez iniciadas, las complicaciones diabéticas continuará progresando sin interrupciones, incluso cuando el control glucémico se consigue 2,3 y este fenómeno se ha denominado memoria metabólica o el efecto legado. La presencia de este fenómeno fue reconocido clínicamente durante la década de 1990 como el &quot;The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)&quot; progresado y ya ha recibido el apoyo de múltiples ensayos clínicos adicionales 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Los modelos animales de DM han sido críticos para los descubrimientos relacionados con la fisiopatología de las complicaciones diabéticas y la memoria metabólica. De hecho, la persistencia de las complicaciones diabéticas se documentó por primera vez en un modelo canino de diabéticaretinopatía que desde entonces ha sido apoyado por varias líneas de evidencia experimental utilizando una variedad de sistemas de cultivo in vitro y modelos animales 15,16,17,18,19,20,21. Estos estudios muestran claramente que un período inicial de resultados hiperglucémicos en anomalías permanentes (incluyendo la expresión génica aberrante) de los órganos diana y / células mecánicamente sugiere la participación del epigenoma. Epigenomas consistirá en todas las modificaciones de la cromatina para un determinado tipo de células y son responsables de perfil único gen de una célula de expresión. Las modificaciones cromosómicas son dinámicos durante el desarrollo, la diferenciación de células de soporte, responden a estímulos externos, están mitóticamente establemente heredados 22,23 y puede ser alterado en la enfermedad 24,25,26. Estos mecanismos epigenéticos incluyen: después de la traducción modificaciones de las histonas y no histonas variante canónica de inclusión en octomers, cambios en la cromatina de acceso a través de la metilación del ADN y los genescontrol de la expresión a través de no codificante RNAs micro 27,28,29,30. En conjunto, los procesos epigenéticos permitir que las células / organismos para responder rápidamente a las cambiantes estímulos ambientales 31,32,33, también confieren la capacidad para la célula &quot;aprende&quot; estos encuentros, una vez que el estímulo se retira 23,22. Por lo tanto, como alteración de perfiles de expresión génica que resultan de los procesos epigenéticos son estables en ausencia de la señal (s) que los inició y se heredables a través de la división celular, que han adquirido gran interés como mecanismos moleculares subyacentes de patologías humanas, incluyendo la memoria metabólica. Los resultados que surgen en el contexto de la MS y la epigenética avances paralelos en otras enfermedades en las que una gran cantidad de cambios epigenéticos inducidos por la hiperglucemia producen notables cambios persistentes en las redes transcripcionales de las células (revisado en 34,35,36,37,38). El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo principal para estudiantesdy desarrollo de los vertebrados sin embargo en los últimos 15 años ha experimentado un crecimiento exponencial en la utilización de este organismo para el estudio de las enfermedades humanas. 39. Modelos de pez cebra de la enfermedad humana han establecido que abarca una amplia gama de patologías humanas, incluyendo trastornos genéticos y las enfermedades adquiridas 40,41,42. Las muchas ventajas del pez cebra con respecto a otros organismos vertebrados modelo incluyen alta fecundidad, corto tiempo de generación, la transparencia a través de la edad adulta temprana, la reducción de los costos de vivienda y una serie de herramientas para la manipulación de genes. Además, debido a la conservación extensa de las vías genéticas y la fisiología celular entre los vertebrados y de la capacidad para llevar a cabo exámenes de drogas de alto rendimiento, el pez cebra se ha utilizado con éxito para el descubrimiento farmacéutico. Hemos desarrollado un modelo de pez cebra adulto de diabetes mellitus tipo I que usaban el medicamento diabetogénico, estreptozocina. Hemos caracterizado este modelo para mostrar que el pez cebra diabético not sólo muestran las conocidas complicaciones secundarias humanos pero, además, exponer regeneración extremidad afectada (regeneración aleta caudal) como consecuencia del medio ambiente hiperglucémico. Además, se ha informado que el pez cebra hiperglucémico volver a normalizar la glucemia dentro de las 2 semanas de eliminación del fármaco debido a la regeneración de células beta pancreáticas endógenas resultantes en un estado glucémico fisiológicamente normal. Sin embargo, en contraste, la regeneración de miembros en estos peces sigue siendo afectada en la misma medida que en el estado diabético agudo indicando esta complicación persiste y es susceptible a la memoria metabólica. El principal impulso para la generación de este modelo era proporcionar un sistema para estudiar los componentes epigenéticos mitóticamente estables que soportan el fenómeno de memoria metabólica en ausencia del ruido de fondo del entorno hiperglucémico anterior. A la conclusión del protocolo al que aquí los tejidos de pez cebra o selectivos y pueden ser procesados ​​por cualquier ensayo adecuado para la researchers necesita. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para identificar los cambios persistentes en todo el genoma en la metilación del ADN inducidos por la hiperglucemia que se mantienen en la memoria de estado metabólico 21. Creemos que este modelo de pez cebra de diabetes mellitus tipo I tiene varias ventajas sobre los sistemas innovadores de otros modelos de examen de memoria metabólica. 1) Todos nuestros estudios pueden llevarse a cabo in vivo y como el pescado hiperglucémico anterior volver a la euglucemia a través de la regeneración de la producción de insulina endógena, que no requieren inyecciones de insulina exógena. Por lo tanto, esto evita los picos y valles de complicación en el control glucémico que pueden ocurrir en los animales que necesitan insulina exógena. 2) Como se ha descrito anteriormente, la estimulación de fondo desde el estado diabético anterior (es decir, la presencia continuada de la glucosilación avanzada de productos finales y reactivos marcadores de especies de oxígeno) son eliminados y por lo tanto, se puede examinar el puramente epigfactores Enetic de memoria metabólica. 3) Los experimentos se pueden realizar rápidamente, ya que toma aproximadamente 80 días a partir de la inducción de diabetes hasta que el examen memoria metabólica. 4) la regeneración Aleta caudal es experimentalmente muy accesible y permite una fácil manipulación genética y experimental para el que hay una gran variedad de herramientas. 5) la regeneración Aleta caudal proporciona un método muy simple y cuantificables para evaluar la memoria metabólica y por lo tanto permitirá el descubrimiento de fármacos futuro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Estreptozocina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2 fenoxietanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturí (tamaño 10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> Platos de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> ½ cc jeringa, con una aguja de calibre 27 1/2 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome glucose kit de ensayo. </td><td> Sistemas de bioensayo </td><td> DIGL-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Nikon </td><td> TMZ-1500 </td><td> Cualquier microscopio de disección está bien. </td></tr><tr><td> Cámara de Imagen </td><td> Nikon </td><td> Q imágenes </td><td> Cualquier cámara es adecuada. </td></tr><tr><td> Image J software </td><td> Los Institutos Nacionales de la Salud </td><td> NIH Image </td><td></td></tr><tr><td> Elementos NIS </td><td> Nikon </td><td></td><td> Cualquier software de imágenes es adecuado. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

La diabetes mellitus afecta actualmente a 346 millones personas y se prevé que aumente a 400 millones para el 2030. Evidencia desde el laboratorio y ensayos clínicos grandes escala ha revelado que el progreso complicaciones diabéticas sin obstáculos a través del fenómeno de la memoria metabólica incluso cuando el control glucémico se logra farmacéuticamente. La expresión génica puede ser alterada de forma estable a través de cambios epigenéticos que no sólo permiten a las células y los organismos para responder rápidamente a las cambiantes estímulos ambientales pero también confieren la capacidad de la célula de &quot;memorizar&quot; estos encuentros, una vez que el estímulo se retira. Como tal, los papeles que desempeñan estos mecanismos en el fenómeno de memoria metabólica se están estudiando actualmente. Hemos informado recientemente el desarrollo de un modelo de pez cebra de tipo I diabetes mellitus y caracterizado este modelo para demostrar que el pez cebra diabético no sólo mostrar las complicaciones conocidas secundarias, incluyendo los cambios asociadoscon la retinopatía diabética, nefropatía diabética y curación de la herida, pero también presentan regeneración afectada aleta caudal. Este modelo es único en que el pez cebra es capaz de regenerar su páncreas dañada y restaurar un estado euglucémico similar a lo que sería de esperar en post-trasplante de pacientes humanos. Además, múltiples rondas de amputación aleta caudal permiten la separación y el estudio de los efectos epigenéticos puros en un sistema in vivo sin posibles factores de complicación desde el estado diabético anterior. Aunque la euglucemia se consigue después de la regeneración de páncreas, la complicación de la diabetes secundaria de la regeneración de la aleta y la curación de heridas de piel persiste indefinidamente. En el caso de la regeneración de aleta alterada, esta patología se conserva incluso después de múltiples rondas de regeneración de aleta en los tejidos hija de aleta. Estas observaciones apuntan a un proceso subyacente epigenética existente en la memoria de estado metabólico. A continuación se presentan los métodos necesarios para pasar satisfactoriamente geneRate los grupos de memoria diabéticos y metabólicos de los peces y discutir las ventajas de este modelo.

El tipo I de pez cebra diabético no sólo muestran las complicaciones secundarias conocidas de la retinopatía y nefropatía, sino también, exhiben una complicación adicional: la regeneración alteración aleta caudal. Esta complicación más tarde persiste debido a la memoria metabólica en los peces que han restaurado el control normal de la glucosa después de un período de hiperglucemia. En la Figura 2A (control) y la Figura 2B (memoria metabólica) imágenes representativas de ...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Memoria metabólica es el fenómeno por el cual las complicaciones diabéticas persistir y progresar sin obstáculos, incluso después de euglucemia se logra farmacéuticamente. Aquí se describe un modelo de pez cebra diabetes mellitus, que es la única que permite el examen de los componentes epigenéticos mitóticamente transmisibles de memoria metabólica<em&gt; In vivo</em&gt;.

Un modelo de pez cebra de la diabetes mellitus y la memoria metabólica

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

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Research

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Medicine

25.5K vistas.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Memoria metabólica es el fenómeno por el cual las complicaciones diabéticas persistir y progresar sin obstáculos, incluso después de euglucemia se logra farmacéuticamente. Aquí se describe un modelo de pez cebra diabetes mellitus, que es la única que permite el examen de los componentes epigenéticos mitóticamente transmisibles de memoria metabólica In vivo.

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Investigación

Medicina

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

Un modelo de infusión de nutrientes crónica en la rata

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Causas Los quistes en el pez cebra Riñones

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesión quirúrgica del páncreas del ratón a través de la ligadura del conducto pancreático como un modelo para el endocrino y exocrino Reprogramación y proliferación

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Trombosis modelo de ratón de la arteria carótida y Mesenterio Embarcaciones inducida por cloruro férrico-

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Disección del páncreas de ratón para análisis histológico y perfiles metabólicos

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Composición corporal y análisis jaulas metabólico en ratones de reserva grasa alta

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.