Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche de la Fondation de la famille Iacocca, Rosalind Franklin University fonds de démarrage et les National Institutes of Health Grant DK092721 (à RVI). Les auteurs tiennent à remercier Nikki intine de l&#39;aide dans la préparation du manuscrit.

Toutes les procédures sont exécutées suivant les directives décrites dans les «Principes de protection des animaux de laboratoire» (National Institutes of Health publication no. 85-23, révisée en 1985) et l&#39;a approuvé Rosalind Franklin University soins aux animaux et l&#39;utilisation des animaux Comité protocole de 08-19. Il ya 2 abréviations importantes qui sont utilisées dans ce manuscrit. 1) DM: se réfère aux poissons qui sont dans un état d&#39;hyperglycémie (300 mg / dl) aiguë et ont été pendant au moins 3 semaines. 2) MM: désigne les poissons qui étaient de 21 jours (voir protocole) poissons DM et a permis de rétablir le contrôle glycémique grâce à la régénération du pancréas. Ceci est réalisé à l&#39;intérieur (14) jours de la suppression de drogue. Les poissons sont considérés comme des poissons MM partir de ce point. Il est également important de noter que les poissons qui sont désignés sous le contrôle sont traitées de manière identique que le poisson DM ou MM en termes de nombre d&#39;injections (solution saline), les temps d&#39;incubation à différentes températures et le nombre et le calendrierdes amputations de la nageoire caudale. 1. Génération de poisson zèbre avec le diabète sucré, le poisson DM <ol><li> Préparer à la fois la récupération et réservoirs d&#39;eau anesthésiques. Eau de récupération de l&#39;eau du poisson normal. Pour l&#39;eau anesthésie ajouter suffisamment de 2-phénoxyéthanol sorte que la dilution 1:1000 dans les poissons d&#39;eau normal est atteint. </li><li> Préparer une solution à 0,3% (sous une hotte) de streptozocine (STZ) par addition de 6 mg de STZ à 2 ml de chlorure de sodium 0,09% et placer immédiatement la solution sur de la glace. Cette solution fournit suffisamment d&#39;injection pour l&#39;injection d&#39;environ 20 à 20 min poisson. Si vous dépassez le seuil des 20 minutes, arrêter et faire une nouvelle solution STZ avant de poursuivre. Dans un tube séparé aliquote solution saline assez pour les poissons témoins. Une fois que la STZ est solubilisé toutes les étapes ultérieures ne nécessitent pas l&#39;utilisation hotte. </li><li> Remplir une seringue ½ cc équipé d&#39;une aiguille de calibre 27 1/2 avec les solutions STZ ou de contrôle assurant qu&#39;aucune bulle d&#39;air emprisonnées. </li><li> AnesthésieTize chaque poisson individuellement en plaçant le poisson dans l&#39;eau anesthésie, et d&#39;attendre jusqu&#39;à ce que leur mouvement de nage cesse (1-2 min). </li><li> Une fois brièvement anesthésiés placer le poisson sur une serviette en papier pour absorber l&#39;excès d&#39;eau, placer le poisson dans pèsent bateau et mesurer la masse du poisson. </li><li> Placer le poisson sur une surface solide (couvercle boîte de Pétri) pour l&#39;injection. </li><li> Injecter la solution de contrôle STZ ou dans la cavité péritonéale du poisson en insérant l&#39;aiguille passée dans le biseau de la face postérieure du péritoine ventrale. </li><li> 0,35 mg / g (350 mg / kg) de STZ devrait être remis à chaque poisson et le volume de la solution à 0,3% requise peut être calculée de la manière suivante. <ol class="lalpha"><li> Multiplier la masse de poisson (g) par 0,35 pour obtenir la quantité de STZ en mg nécessaire. </li><li> diviser le produit généré au-dessus de 3 pour donner le volume de la solution à 0,3% nécessaires à l&#39;injection en pi. Exemple: Pour un poisson 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 pi. Le même volume sans le STZ serait injecté pour un poisson de commande. Une feuille pour des volumes à injecter par masse de poissons doit être généré et utilisé pour une référence rapide. </li></ol></li><li> Après l&#39;injection de placer le poisson dans le réservoir d&#39;eau de récupération et de les surveiller toute activité nager normalement. Une fois ce qui a été réalisé le poisson est transféré à un réservoir de vie normale est maintenue dans la plage de température réduite de 22 ° C - 24 ° C. Cette température réduite est essentielle pour l&#39;induction efficace de l&#39;hyperglycémie (diabète sucré, DM). </li><li> Bien que l&#39;hyperglycémie est détecté dans les 24 heures de la première injection, afin d&#39;induire un état prolongé de l&#39;hyperglycémie très élevé, le poisson-zèbre nécessitent une phase d&#39;injection fréquente d&#39;induction suivie d&#39;injections hebdomadaires d&#39;entretien, comme indiqué ci-dessous. </li></ol> Semaine 1: 3 injections (jours 1, 3, 5), Semaine 2: 1 injection (jour 12), Semaine 3: 1 injection (jour 19), Semaine 4: (Jour 21) Effectuerdosage d&#39;intérêt. A ce stade, le poisson zèbre est considéré comme ayant été dans un état prolongé de l&#39;hyperglycémie et les complications diabétiques présentent de la rétinopathie, la néphropathie et la régénération des nageoires également altérée. Ceux-ci sont considérés comme des poissons DM. De plus, si désiré, le poisson peut être maintenu à l&#39;état hyperglycémique avec des injections hebdomadaires d&#39;entretien. Environ 5% de décès au cours de ce processus devrait être prévu. 2. Collecte de sang et la glycémie à jeun (FBGL) Détermination <ol><li> Chaque groupe de poissons DM et de contrôle doit inclure suffisamment de poisson pour déterminer avec précision la FBGL moyenne du groupe dans ce test nécessite ces poissons à être sacrifié. </li><li> Préparer un tube étiqueté PCR pour chaque échantillon de sang contenant 5 pi de solution saline normale stérile. </li><li> Pour la collecte de sang, anesthésier les poissons comme ci-dessus, enlevez toute l&#39;eau, placer le poisson sur une lame de microscope et à l&#39;aide d&#39;un scalpel, enlever la tête du poissonà la base de l&#39;opercule. </li><li> Prélever le sang (jusqu&#39;à 2 pi) qui est libérée par le poisson sur la lame rapidement et l&#39;ajouter à la ul 5 de solution saline normale stérile pipetage haut et bas pour faire en sorte que le sang ne se bouchent pas. Immédiatement placer l&#39;échantillon sur la glace. </li><li> Déterminer le volume de l&#39;échantillon de sang en mesurant le volume total du liquide (solution saline + sang) et en soustrayant ensuite la pi 5 de solution saline. </li><li> Transférer 5 ul du sang dilué dans chaque tube PCR dans un tube de 1,5 ml et déterminer la concentration de glucose sanguin à l&#39;aide du kit de dosage du glucose QuantiChrome. Ceci est réalisé en suivant le protocole du fabricant, sans exception. Résultats attendus: normal poisson de commande / 60 mg / dl et le poisson DM 310 mg / dl. </li></ol> 3. Nageoire caudale études de régénération <ol><li> Anesthésier les poissons comme décrit dans 1.0 à 1.4. </li><li> Placer le poisson sur un couvercle de boîte de Pétri et l&#39;amputation de la nageoire caudale en ligne droite en utilisant une taille stérile10 scalpel à proximité du premier point de ramification lepidotrichia tout en regardant la fin grâce à un microscope à dissection. </li><li> Permettre aux poissons de se rétablir comme en 1.10, mais placer le poisson à 33 ° C pendant la phase de croissance régénérative de l&#39;essai. Il s&#39;agit d&#39;une analyse de température établi pour fin régénération accélérée. </li><li> Les ailettes peuvent être visualisés à tout moment après l&#39;amputation mais nous examiner systématiquement la croissance régénérative à 24, 28 et 72 heures après trans-section. </li><li> Anesthésier les poissons comme avant (voir 1.0 à 1.4), placer le poisson sous un microscope de dissection équipé d&#39;une caméra (nous utilisons un Nikon SMZ-1500 équipé d&#39;une caméra Q-imagerie) et de recueillir toutes les images à un grossissement de 1X à ailettes avec NIS éléments logiciels . La nageoire devraient être répartis pour l&#39;imagerie de sorte qu&#39;il est complètement sorti sans étirement ou endommager le tissu et doivent être exempts de toute gouttelettes d&#39;eau. Par souci de cohérence, placez toujours le côté dorsal vers la droite. </li><li> Imprimez des images et mesurer le gro régénérativewth zone en utilisant le logiciel Image J et l&#39;utilisation d&#39;une feuille de travail. Tracez le contour de la surface totale de la nouvelle croissance et de déterminer la région. Chaque mesure doit être effectuée cinq fois en moyenne et pour assurer l&#39;exactitude du tracé. Il est important que les images utilisées n&#39;ont pas les ombres ou les gouttelettes d&#39;eau que ceux-ci contribuent à des erreurs dans la mesure de la zone de prolongement. </li><li> Mesurer la longueur de l&#39;emplacement amputation long de l&#39;axe dorsal-ventral et diviser la superficie déterminée en 3,6 par cette mesure. Cela permet poissons de différentes tailles pour être comparés directement. </li></ol> 4. Génération de la mémoire métabolique (MM) Zebrafish <ol><li> Initier un groupe de poissons DM et leurs contrôles appropriés tels que décrits à l&#39;article 1. </li><li> A 21 jours de déterminer la FBGL pour un sous-ensemble du groupe et de diviser le poisson DM en 2 sous-groupes. Continuer hebdomadaire STZ injections pour l&#39;un des groupes que les commandes DM pour la durée de l&#39;expérience. Cessez injection de STZ pour le deuxième groupe et Incubate le poisson à une température normale. Dans les 14 jours ce sera le poisson-zèbre restaurer l&#39;insuline et de glucose sanguin normal de contrôle grâce à la régénération du pancréas. Ces poissons sont maintenant appelés MM (poisson mémoire métabolique). </li><li> Au jour 30 après élimination du médicament amputer les nageoires caudales de contrôle, le SM et MM poissons via la méthode décrite au point 3.2. </li><li> Retour du poisson aux conditions hydrologiques normales pour la régénération des nageoires pendant 30 jours. Cela permet à la croissance de ce que nous appelons, tissus mémoire métabolique. </li><li> Au 60 e jour d&#39;effectuer une deuxième amputation (tel que décrit à la section 3.2) dans le tissu qui a été régénéré dans la période comprise entre 30-60 jours et effectuer le test de la nageoire caudale de régénération (3.1 à 3.7) Figure 1. </li><li> Isoler les tissus et d&#39;effectuer le dosage de l&#39;intérêt. Voir le tableau 1 pour un résumé du protocole. </li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le diabète sucré est une maladie de la dysrégulation métabolique, initialement diagnostiquée comme l&#39;hyperglycémie, qui aboutit finalement à des dommages des vaisseaux sanguins conduisant à de nombreuses complications qui persistent même après tout euglycémie est atteint si l&#39;intervention pharmaceutique. Cette persistance de complications est appelée mémoire métabolique et plusieurs études récentes ont examiné le rôle que jouent les mécanismes épigénétiques dans ce phénomène. Ici, nous av...

Le diabète sucré (DM) est un problème de santé grave et croissant que les résultats de l&#39;espérance de vie réduite en raison de complications microvasculaires maladie spécifique (rétinopathie, néphropathie, neuropathie, la guérison des plaies) et macrovasculaires (cardiopathie et accident vasculaire cérébral) des complications 1. Une fois lancés, les complications diabétiques continuer à progresser sans interruption, même lorsque le contrôle glycémique est obtenu 2,3 et ce phénomène a été appelé mémoire métabolique ou l&#39;effet de l&#39;héritage. La présence de ce phénomène a été reconnu cliniquement début des années 1990 que le «Le Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)« progressé depuis et a été soutenu par plusieurs autres études cliniques 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Les modèles animaux de DM ont joué un rôle crucial pour les découvertes liées à la physiopathologie de complications liées au diabète et à la mémoire métabolique. En effet, la persistance des complications du diabète a d&#39;abord été documentés dans un modèle canin de diabèterétinopathie, qui a depuis été appuyé par plusieurs lignes de données expérimentales en utilisant une variété de systèmes de culture in vitro et des modèles animaux 15,16,17,18,19,20,21. Ces études montrent clairement que les premiers résultats une période d&#39;hyperglycémie dans les anomalies stables (y compris l&#39;expression génique aberrante) des organes / cellules cibles et mécaniste suggère l&#39;implication de l&#39;épigénome. Épigénomes compose de tous les modifications de la chromatine pour un type cellulaire donné et sont responsables de cellule unique d&#39;un profil d&#39;expression génique. Les modifications chromosomiques sont dynamiques au cours du développement, la différenciation des cellules de soutien, sont sensibles à des stimuli externes, sont mitotiquement stabilité héréditaire 22,23 et peuvent être modifiées dans la maladie 24,25,26. Ces mécanismes épigénétiques comprennent: poster traductionnelles des histones, modifications non canonique d&#39;inclusion variant d&#39;histone dans octomers, les changements d&#39;accès grâce à la chromatine, méthylation de l&#39;ADN et des gènescontrôle de l&#39;expression par ARN non codants micro 27,28,29,30. Au total, les processus épigénétiques permettent aux cellules / organismes de réagir rapidement à l&#39;évolution des stimuli environnementaux 31,32,33, ils confèrent également la capacité de la cellule à «mémoriser» ces rencontres une fois que le stimulus est enlevé 23,22. Par conséquent, comme altérées profils d&#39;expression génique résultant de processus épigénétiques sont stables en l&#39;absence du signal (s) qui les a initiées et sont héréditaires par division cellulaire, ils ont acquis un grand intérêt en tant que sous-tendent les mécanismes moléculaires de pathologies humaines comme la mémoire métabolique. Les résultats qui émergent dans le contexte du DM et de l&#39;épigénétique avancées parallèles dans d&#39;autres maladies en ce qu&#39;une pléthore de modifications épigénétiques induites par l&#39;hyperglycémie provoquent remarquables changements persistants dans les réseaux transcriptionnels des cellules (revue en 34,35,36,37,38). Le poisson-zèbre a longtemps été un organisme modèle pour étudiants de premierdy vertébrés développement mais les 15 dernières années ont vu une croissance exponentielle dans l&#39;utilisation de cet organisme pour l&#39;étude des maladies humaines. 39. Modèles de maladies humaines poisson zèbre ont été mis en place couvrant un large éventail de pathologies humaines, y compris les maladies génétiques et les maladies acquises 40,41,42. Les nombreux avantages du poisson zèbre par rapport aux autres organismes modèles vertébrés comprennent une fécondité élevée, le temps de génération court, la transparence grâce à l&#39;âge adulte, les coûts du logement réduit et une gamme d&#39;outils pour la manipulation génétique. En outre, en raison de l&#39;étendue de la conservation des voies génétiques et physiologie cellulaire chez les vertébrés et la capacité d&#39;effectuer des dépistages de drogue débit élevé, le poisson zèbre a été utilisé avec succès pour la découverte pharmaceutique. Nous avons développé un modèle de poisson zèbre adulte du diabète de type I en utilisant le médicament diabétogène, streptozocine. Nous avons caractérisé ce modèle pour montrer que le poisson-zèbre diabétique net n&#39;afficher que les plus connus de l&#39;homme de complications secondaires, mais en plus, présentent des troubles de la régénération des membres (régénération de la nageoire caudale) à la suite de l&#39;environnement hyperglycémique. En outre, nous avons signalé que le poisson-zèbre hyperglycémique revenir à une glycémie normale dans les 2 semaines suivant le retrait du médicament en raison de la régénération des cellules bêta pancréatiques endogènes résultant dans un état glycémique physiologiquement normal. Toutefois, en revanche, la régénération des membres chez ces poissons reste compromise dans la même mesure que dans l&#39;état diabétique aiguë indiquant cette complication persiste et est sensible à la mémoire métabolique. Le principal moteur de la génération de ce modèle est de fournir un système pour étudier les composantes mitotiquement stables épigénétiques qui prennent en charge le phénomène de la mémoire métabolique en l&#39;absence du bruit de fond de l&#39;environnement hyperglycémique précédente. À la conclusion du protocole prévu ici les tissus de poisson zèbre et ou sélectives peuvent être traitées par un essai approprié pour la recherrchers besoin. Nous avons utilisé avec succès cette procédure pour identifier les changements à l&#39;échelle du génome persistantes dans méthylation de l&#39;ADN induites par l&#39;hyperglycémie qui sont maintenus dans l&#39;état de la mémoire métabolique 21. Nous pensons que ce modèle de poisson zèbre de type I diabète présente plusieurs avantages par rapport aux systèmes innovants d&#39;autres modèles pour l&#39;examen de la mémoire métabolique. 1) Tous nos études peuvent être menées in vivo et que le poisson hyperglycémique précédent retour à une glycémie normale grâce à la régénération de la production d&#39;insuline endogène, ils n&#39;ont pas besoin d&#39;injections d&#39;insuline exogène. Par conséquent, ce qui évite les pics et les vallées de complication dans le contrôle glycémique qui peuvent survenir chez les animaux ayant besoin d&#39;insuline exogène. 2) Comme décrit ci-dessus, la stimulation de fond de l&#39;état diabétique précédente (à savoir la présence continue de glycation avancée des produits et réactifs marqueurs des espèces d&#39;oxygène) sont éliminées et par conséquent on peut examiner l&#39;aspect purement EPIGfacteurs enetic de mémoire métabolique. 3) Les expériences peuvent être réalisées rapidement que cela prend environ 80 jours à compter de l&#39;induction du diabète jusqu&#39;à l&#39;examen mémoire métabolique. 4) la régénération caudale est expérimentalement très accessible et permet la manipulation génétique et expérimentale facile pour lesquels il existe une vaste gamme d&#39;outils. 5) la régénération caudale fournit une méthode très simple et quantifiables pour évaluer la mémoire métabolique et donc permettra de découverte de médicaments avenir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Streptozocine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2-phénoxyéthanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpel (taille 10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> Boîtes de Pétri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> ½ cc seringue, 27 1/2 aiguille de la jauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome gluckit de dosage ose. </td><td> Systèmes d&#39;essais biologiques </td><td> Digl-100 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Nikon </td><td> TMZ-1500 </td><td> Toute microscope à dissection est très bien. </td></tr><tr><td> Caméra d&#39;imagerie </td><td> Nikon </td><td> Q imagerie </td><td> N&#39;importe quelle caméra est approprié. </td></tr><tr><td> Image J logiciels </td><td> National Institutes of Health </td><td> NIH Image </td><td></td></tr><tr><td> Éléments NIS </td><td> Nikon </td><td></td><td> N&#39;importe quel logiciel d&#39;imagerie est approprié. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

Le diabète sucré touche actuellement 346 millions personnes et ce nombre devrait passer à 400 millions en 2030. Preuve à la fois de laboratoire et de grands essais cliniques ont montré que les complications diabétiques progrès sans entrave par le phénomène de la mémoire métabolique, même si le contrôle glycémique est pharmaceutiquement atteint. L&#39;expression des gènes peut être modifiée par des modifications de façon stable épigénétiques qui non seulement permettent aux cellules et aux organismes de répondre rapidement à l&#39;évolution des stimuli de l&#39;environnement, mais aussi conférer la capacité de la cellule à «mémoriser» ces rencontres une fois que le stimulus est enlevé. En tant que tel, les rôles que ces mécanismes jouent dans le phénomène de la mémoire métabolique sont actuellement à l&#39;étude. Nous avons récemment rapporté le développement d&#39;un modèle de poisson zèbre de sucré de type I, diabète et caractérisé ce modèle pour montrer que le poisson-zèbre diabétique non seulement afficher les complications connues secondaires, y compris les changements liésla rétinopathie diabétique, la néphropathie diabétique et la guérison des plaies, mais présentent également une déficience de régénération de la nageoire caudale. Ce modèle est unique en ce que le poisson-zèbre est capable de régénérer son pancréas endommagé et restaurer un état euglycémique similaire à ce qui serait attendu en post-transplantation chez des patients humains. En outre, plusieurs séries d&#39;amputation de la nageoire caudale permet la séparation et l&#39;étude de purs effets épigénétiques dans un système in vivo sans potentiels facteurs de complication de l&#39;état diabétique précédente. Bien que euglycémie est atteint après régénération du pancréas, la complication diabétique secondaire de la régénération des nageoires et cicatrisation de la peau persiste indéfiniment. Dans le cas de la régénération des nageoires avec facultés affaiblies, cette pathologie est conservé même après plusieurs cycles de régénération des nageoires dans les tissus ailettes fille. Ces observations indiquent un processus épigénétique sous-jacente existant dans l&#39;état de la mémoire métabolique. Nous présentons ici les méthodes nécessaires à la réussite genlérer la mémoire des groupes diabétiques et métaboliques des poissons et de discuter des avantages de ce modèle.

Type I zèbre diabétique non seulement afficher les complications connues secondaires de la rétinopathie et de la néphropathie, mais aussi, présentent une complication supplémentaire: altération de régénération de la nageoire caudale. Cette complication plus tard persiste en raison de la mémoire métabolique chez les poissons qui ont rétabli le contrôle du glucose normale après une période d&#39;hyperglycémie. Dans la figure 2A (contrôle) et la figure 2B (mémoire métab...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Mémoire métabolique est le phénomène par lequel les complications du diabète persistent et progresser sans entrave, même après euglycémie est atteint pharmaceutique. Nous décrivons ici un modèle de poisson zèbre diabète sucré qui est unique en ce qu&#39;elle permet d&#39;examiner des éléments mitotiquement transmissibles épigénétiques de mémoire métabolique<em&gt; In vivo</em&gt;.

Un modèle de poisson zèbre du diabète sucré et de la mémoire métabolique

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.5K vues.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Mémoire métabolique est le phénomène par lequel les complications du diabète persistent et progresser sans entrave, même après euglycémie est atteint pharmaceutique. Nous décrivons ici un modèle de poisson zèbre diabète sucré qui est unique en ce qu'elle permet d'examiner des éléments mitotiquement transmissibles épigénétiques de mémoire métabolique In vivo.

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Dépistage du mélanome Modificateurs l&#39;aide d&#39;un modèle de tumeur Zebrafish Autochtone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Recherche

Médecine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

Un modèle d&#39;infusion de nutriments chronique chez le rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Un procédé de précipitation modification pour isoler les exosomes urinaire

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Un modèle de poisson zèbre possible de la maladie polykystique des reins: Knockdown de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Causes kystes chez le poisson zèbre reins

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Blessure chirurgicale au pancréas de souris par ligature du canal pancréatique tant que modèle de endocrines et exocrines Reprogrammation et prolifération

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Chlorure ferrique induite souris thrombose type sur l&#39;artère carotide et Mesentery navire

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Dissection du pancréas de souris pour faire une analyse histologique et profilage métabolique

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Composition corporelle et l’analyse mise en cage métabolique in Mice Fed graisse haute

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.