Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação da Fundação Família Iacocca, Rosalind Franklin University fundos de arranque, e os Institutos Nacionais de Saúde Grant DK092721 (a RVI). Os autores agradecem a Nikki intine para ajuda na preparação do manuscrito.

Todos os procedimentos são realizados seguindo as orientações descritas em &quot;Princípios de Laboratório Animal Care&quot; (Institutos Nacionais de Saúde não publicação. 85-23, revisado 1985) e aprovado Rosalind Franklin University Animal Care Institucional e uso de animais protocolo do Comitê 08-19. Existem duas abreviaturas importantes que são utilizadas neste manuscrito. 1) DM: refere-se a peixe, que estão em estado de hiperglicemia aguda (300 mg / dl), e têm, pelo menos, 3 semanas. 2) MM: refere-se a peixes que foram 21 dias (ver protocolo) peixe DM e permitiu a restaurar o controle glicêmico através da regeneração pancreática. Isto é conseguido no interior (14) dias após a remoção da droga. Os peixes são considerados peixes MM partir deste ponto em diante. Também é importante notar que os peixes, que são referidos como controlo são tratados de forma idêntica como o peixe ou DM MM em termos do número de injecções (apenas solução salina), o tempo de incubação às temperaturas diferentes e o número e temporizaçãode amputações nadadeira caudal. 1. Geração de Zebrafish com Diabetes mellitus, peixe DM <ol><li> Prepare tanto a recuperação e tanques de água anestésicos. Água de recuperação é de peixes de água normal. Para a água do anestésico suficiente adicionar 2-fenoxietanol, de modo que uma diluição de 1:1.000 em peixes de água normal, é alcançado. </li><li> Prepara-se uma solução de 0,3% (numa hotte) de estreptozocina (STZ) pela adição de 6 mg de STZ de 2 ml de cloreto de sódio a 0,09% e colocar imediatamente a solução em gelo. Isto irá fornecer a solução de injecção suficiente para a injecção de cerca de 20 peixes em cada 20 min. Se você ultrapassar a marca de 20 minutos, parar e fazer uma solução STZ fresco antes de prosseguir. Em um tubo de solução salina alíquota separada suficiente para os peixes de controle. Uma vez que a STZ é solubilizado todas as etapas subseqüentes não requerem uso coifa. </li><li> Encher uma seringa cc ½ equipado com uma agulha de calibre 27 1/2, com as soluções de controlo ou de STZ, assegurando que não existem bolhas de ar presas. </li><li> Anestesiatize cada peixe individualmente, colocando o peixe na água anestésico, e espere até que seu movimento cessa natação (1-2 min). </li><li> Uma vez anestesiados rapidamente coloque o peixe sobre um papel toalha para absorver o excesso de água, coloque o peixe no barco pesar e medir a massa do peixe. </li><li> Coloque o peixe em uma superfície firme (Petri tampa prato) para injecção. </li><li> Injectar a STZ ou a solução de controlo para a cavidade peritoneal do peixe, por inserção da agulha além do chanfro no aspecto posterior do peritoneu ventral. </li><li> 0,35 mg / g (350 mg / kg) de STZ deve ser entregue para cada peixe e o volume da solução de 0,3% necessário pode ser calculado da seguinte forma. <ol class="lalpha"><li> Multiplicar a massa de peixe (g) de 0,35 para se obter a quantidade de STZ em mg necessário. </li><li> dividir o produto gerado acima por 3 para se obter o volume da solução de 0,3% necessários para a injecção de ul. Exemplo: Para um peixe 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 ul. O mesmo volume sem a STZ seria injectado por um peixe de controlo. Uma folha para volumes de injetar por massa de peixe deve ser gerado e usado para referência rápida. </li></ol></li><li> Injeção seguinte coloque o peixe no tanque de água de recuperação e monitorá-los para a atividade de natação normal. Uma vez que este tenha sido alcançado, o peixe é transferido para um tanque de vida normal, que é mantida no intervalo de temperatura reduzida de 22 ° C - 24 ° C. Esta temperatura reduzida é crítico para a indução eficaz da hiperglicemia (diabetes mellitus, DM). </li><li> Embora a hiperglicemia é detectado dentro de 24 horas da primeira injecção, de forma a induzir um estado de hiperglicemia prolongada muito elevado o zebrafish requerem uma fase de indução de injecção frequente, seguida de injecções semanais de manutenção, como mostrado abaixo. </li></ol> Semana 1: 3 injecções (Dia 1, 3, 5), Semana 2: 1 injeção (dia 12), a Semana 3: 1 injecção (dia 19), Semana 4: (Dia 21) Executeensaio de interesse. Neste ponto, o peixe-zebra são considerados como tendo sido em um estado prolongado de hiperglicemia e exibem as complicações diabéticas de retinopatia, nefropatia e regeneração da barbatana também prejudicada. Estes são referidos como peixes DM. Além disso, se desejado, o peixe pode ser mantido no estado hiperglicémico com injecções semanais de manutenção. Aproximadamente 5% de falecimento durante este processo deve ser esperado. 2. Coleta de sangue e glicemia de jejum (FBGL) Determinação <ol><li> Cada grupo de peixes de MS e de controlo deve incluir peixe suficiente para determinar com precisão a FBGL média do grupo como este ensaio requer estes peixes para ser sacrificado. </li><li> Preparar um tubo rotulado PCR para cada amostra de sangue contendo 5 ul de solução salina normal estéril. </li><li> Para a coleta de sangue, anestesiar peixes como acima, retire toda a água, coloque o peixe sobre uma lâmina de microscópio e utilizando um bisturi, remove a cabeça do peixena base do opérculo. </li><li> Recolher o sangue (até 2 ul), que é libertado a partir do peixe na lâmina e adicionar rapidamente ao 5 ul de solução salina normal estéril pipetando para cima e para baixo para se certificar de que o sangue não entupir. Imediatamente colocar a amostra em gelo. </li><li> Determinar o volume da amostra de sangue medindo-se o volume total do líquido (soro fisiológico + do sangue) e então subtraindo a 5 ul de solução salina. </li><li> Transferir 5 ul do sangue diluído a partir de cada tubo de PCR para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e determinar a concentração de glicose no sangue, utilizando o Kit de Ensaio de Glucose QuantiChrome. Isto é realizado seguindo o protocolo do fabricante, sem excepção. Resultados esperados: peixes controle normal / 60 mg / dl e peixe DM 310 mg / dl. </li></ol> 3. Caudal Fin Regeneração Estudos <ol><li> Anestesiar peixe, tal como descrito em 1,0-1,4. </li><li> Coloque o peixe em uma tampa de placa de Petri e amputar a nadadeira caudal em uma linha reta usando um tamanho de estéril10 bisturi proximal ao primeiro ponto de ramificação lepidotriquia enquanto visualiza o fin através de um microscópio de dissecação. </li><li> Permitir que o peixe se recuperar como em 1.10 mas coloque o peixe a 33 ° C para a fase de crescimento regenerativo do ensaio. Trata-se de uma temperatura estabelecida para a análise acelerada fin regeneração. </li><li> As barbatanas podem ser visualizados em qualquer amputação pós vez, porém rotineiramente examinar o crescimento regenerativo em 24, 28 e 72 horas seguindo-seção trans. </li><li> Anestesiar peixes como antes (ver 1,0-1,4), coloque o peixe sob um microscópio de dissecação equipado com uma câmera (nós usamos uma Nikon SMZ-1500 equipado com uma câmera de Q-imagem) e recolher todas as imagens fin de ampliação 1X com NIS software de elementos . A aleta deve ser espalhado para imagiologia de modo a que ela fique totalmente estendida, sem estiramento ou danificar o tecido e deve estar livre de quaisquer gotas de água. Para consistência coloque sempre o lado dorsal para a direita. </li><li> Imprimir imagens e medir o gro regenerativaárea wth usando o software Image J e o uso de uma almofada de desenho. Trace em torno de toda a área de um novo crescimento e determinar a área. Cada medição deve ser feita cinco vezes e em média para garantir a precisão do traçado. É importante que as imagens utilizadas não têm sombras ou gotículas de água uma vez que estes contribuem para erros na medição da área de crescimento. </li><li> Medir o comprimento do local da amputação ao longo do eixo dorsal-ventral e dividir a superfície determinada em 3,6 por esta medida. Isto permite que os peixes de tamanhos diferentes para ser comparado directamente. </li></ol> 4. Geração de Memória Metabólica (MM) Zebrafish <ol><li> Iniciar um grupo de peixes de MS e seus controles adequados, conforme descrito na seção 1. </li><li> Aos 21 dias a determinar FBGL para um subconjunto de grupo e dividir o peixe DM em 2 subgrupos. Continuar semanalmente injecções de STZ por um dos grupos DM como controlos para a duração da experiência. Cessar STZ injecção para o segundo grupo e incubate peixe a uma temperatura normal. Dentro de 14 dias estes zebrafish irá restaurar insulina e glicose sanguínea normal de controle através de regeneração do pâncreas. Estes peixes são agora chamados MM (peixe memória metabólica). </li><li> No dia 30 de remoção de drogas após amputar as barbatanas caudais de controle, MS e MM peixe através do método descrito em 3.2. </li><li> Retornar peixe às condições de água normal para a regeneração da nadadeira por 30 dias. Isto permite que o crescimento do que nós denominamos, tecido memória metabólica. </li><li> No dia 60 executar uma segunda cirurgia (tal como descrito em 3.2) no interior do tecido que foi regenerado no período de 30-60 dias, e realizar o ensaio de regeneração caudal fin (3,1-3,7) Figura 1. </li><li> Isolar o tecido e fazer ensaio de interesse. Ver Tabela 1 para um resumo protocolo. </li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A diabetes mellitus é uma doença metabólica de desregulação, inicialmente diagnosticada como hiperglicemia, que, finalmente, resulta em danos nos vasos sanguíneos conduz a muitas complicações que persistem mesmo depois de todos euglicemia é alcançado embora intervenção farmacêutica. Esta persistência de complicações é referido como memória metabólica e vários estudos recentes têm examinado o papel que desempenham nos mecanismos epigenéticos este fenómeno. Aqui temos um protocolo detalhado que perm...

O diabetes mellitus (DM) é um problema de saúde sério e crescente que resulta em expectativa de vida reduzida devido a doença específica microvascular (retinopatia, nefropatia, neuropatia, cicatrização deficiente) e macrovasculares (doença cardíaca e acidente vascular cerebral) complicações 1. Uma vez iniciado, complicações diabéticas continuar a progredir ininterrupto mesmo quando o controle glicêmico 2,3 e este fenômeno foi denominado de memória metabólica ou o efeito legado. A presença deste fenômeno foi reconhecido clinicamente durante o início de 1990 como o &quot;A Diabetes Controle e Julgamento Complicações (DCCT)&quot; progrediu e desde então tem sido apoiada por vários estudos clínicos adicionais 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Modelos animais de DM têm sido fundamentais para descobertas relacionadas com a fisiopatologia das complicações da diabetes e da memória metabólica. De facto, a persistência de complicações diabéticas foi documentada em um modelo canino de diabetesretinopatia que desde então foi suportada por várias linhas de evidência experimental utilizando uma variedade de sistemas de cultura in vitro e em modelos animais 15,16,17,18,19,20,21. Estes estudos mostram claramente que o resultado é uma hiperglicêmicos período inicial em anormalidades permanentes (incluindo a expressão génica aberrante) de órgãos / células-alvo e mecanisticamente sugere o envolvimento do epigenoma. Epigenomas engloba todas as modificações da cromatina para um determinado tipo celular e são responsáveis ​​pelo perfil único de uma célula de expressão de genes. As modificações cromossómicas são dinâmicos durante o desenvolvimento de diferenciação celular, o apoio, são sensíveis a estímulos externos, são mitoticamente estavelmente herdada 22,23 e podem ser alterados na doença 24,25,26. Estes mecanismos epigenéticos incluem: postar translacionais modificações de histonas, não-canônico de inclusão variante das histonas em octomers, mudanças de acesso cromatina por metilação do DNA e de genescontrole de expressão através de RNAs não-codificadores micro 27,28,29,30. Ao todo, processos epigenéticos permitir que as células / organismos para responder rapidamente às mudanças estímulos ambientais 31,32,33, eles também conferem a capacidade da célula para &quot;decorar&quot; esses encontros uma vez que o estímulo é removido 23,22. Assim, tal como os perfis de expressão de genes alterados resultantes de processos epigenéticos são estáveis ​​na ausência do sinal (s) que iniciou a eles e são hereditárias através da divisão celular, eles adquiriram grande interesse como subjacente mecanismos moleculares de patologias humanas, incluindo a memória metabólica. Os resultados que surgem no contexto de DM e epigenética avanços paralelos em outras doenças em que uma multiplicidade de mudanças epigenéticas induzidas pela hiperglicemia causam mudanças notáveis ​​persistentes em redes de transcrição de células (revisto em 34,35,36,37,38). O peixe-zebra tem sido um organismo modelo premier para estudantesdy desenvolvimento de vertebrados no entanto nos últimos 15 anos tem visto um crescimento exponencial na utilização deste organismo para o estudo de doenças humanas. 39. Zebrafish modelos de doenças humanas foram estabelecidas abrangendo uma vasta gama de patologias humanas, incluindo as doenças genéticas e doenças adquiridas 40,41,42. As muitas vantagens do peixe-zebra sobre organismos modelo incluem outros vertebrados alta fecundidade, tempo de geração curto, transparência através da idade adulta, os custos da habitação reduzidas e um conjunto de ferramentas para manipulação genética. Além disso, devido à conservação extensa de vias genéticas e da fisiologia celular entre os vertebrados e a capacidade para realizar rastreios de elevada capacidade de droga, o peixe-zebra foi usada com sucesso para a descoberta farmacêutica. Nós desenvolvemos um modelo zebrafish adulto de diabetes mellitus do tipo I, utilizando o fármaco diabetogénico, estreptozocina. Temos caracteriza este modelo para mostrar que zebrafish diabético nãot exibir apenas os humanos conhecidos complicações secundárias mas, além disso, apresentam a regeneração de membros prejudicada (regeneração da nadadeira caudal) como consequência do ambiente hiperglicêmico. Além disso, relataram que zebrafish hiperglicêmico voltar a glicemia normal dentro de 2 semanas da retirada do fármaco, devido à regeneração de células pancreáticas beta endógenos, resultando em um estado glicêmico fisiologicamente normal. No entanto, em contraste, a regeneração de membros destes peixes permanece prejudicada na mesma extensão como no estado diabético aguda, indicando esta complicação persiste e é susceptível à memória metabólica. O principal ímpeto para gerar este modelo foi o de fornecer um sistema para estudar os componentes mitóticos estáveis ​​epigenéticas que suportam o fenómeno de memória metabólica na ausência de ruído de fundo do ambiente hiperglicêmico anterior. Na conclusão do protocolo fornecido aqui os tecidos e peixe-zebra ou selectivos podem ser processadas por qualquer ensaio adequado para a Researchers precisa. Temos utilizado com sucesso este procedimento para identificar as alterações do genoma persistentes na metilação do DNA induzidos pela hiperglicemia que são mantidos no estado de memória metabólica 21. Nós sentimos que este modelo de zebrafish de diabetes mellitus tipo I tem várias vantagens em relação aos sistemas inovadores outro modelo para o exame de memória metabólica. 1) Todos os nossos estudos podem ser realizados in vivo e como o peixe hiperglicémica anterior voltar a euglicemia pela regeneração da produção endógena de insulina, que não requerem injecções de insulina exógena. Portanto, o que evita os picos e vales de complicação no controlo da glicemia que podem ocorrer em animais que requerem insulina exógena. 2) Como descrito acima, a estimulação de fundo a partir do estado diabético anterior (isto é, a presença continuada de glicação avançada produtos finais e os marcadores de espécies reactivas de oxigénio) são eliminadas e, por conseguinte, pode-se examinar o puramente epigfactores enetic de memória metabólica. 3) Os ensaios podem ser realizados rapidamente, uma vez que demora aproximadamente 80 dias a partir da indução da diabetes até serem analisadas memória metabólica. 4) Caudal regeneração da barbatana é experimentalmente muito acessível e permite a manipulação genética e experimental fácil para o qual há uma grande variedade de ferramentas. 5) Caudal fin regeneração proporciona um método muito simples e quantificáveis ​​para avaliar memória metabólica e portanto vai permitir a descoberta de medicamentos futuro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Estreptozocina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2-fenoxietanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturi (tamanho 10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> Os pratos de petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> ½ seringa cc, com 27 1/2 agulha de calibre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome glicose kit de ensaio. </td><td> Sistemas de bioensaio </td><td> DIGL-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Nikon </td><td> TMZ-1500 </td><td> Qualquer microscópio de dissecação está bem. </td></tr><tr><td> Camera for Imaging </td><td> Nikon </td><td> Q imagem </td><td> Qualquer câmara é adequado. </td></tr><tr><td> Image J software </td><td> National Institutes of Health </td><td> NIH Imagem </td><td></td></tr><tr><td> Elementos NIS </td><td> Nikon </td><td></td><td> Qualquer software de imagem é adequado. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

Diabetes mellitus afeta atualmente 346 milhões pessoas e isso deverá aumentar para 400 milhões até 2030. Evidências de laboratório que larga escala ensaios clínicos revelou que o progresso complicações diabéticas desimpedida através do fenômeno da memória metabólica, mesmo quando o controle glicêmico é farmaceuticamente alcançado. A expressão do gene pode ser alterada através de alterações de forma estável epigenéticas que não só permitem que as células e organismos de responder rapidamente a mudanças de estímulos ambientais, mas também conferem a capacidade da célula para &quot;memorizar&quot; estes encontra quando o estímulo é removido. Como tal, os papéis de que estes mecanismos desempenham no fenómeno de memória metabólica estão actualmente a ser examinada. Temos recentemente relataram o desenvolvimento de um modelo de peixe-zebra de tipo I diabetes mellitus e caracterizado este modelo para mostrar que zebrafish diabético não apenas exibem as complicações secundárias conhecidas, incluindo as alterações associadascom retinopatia diabética, nefropatia diabética e a cicatrização de feridas prejudicada, mas também exibem regeneração da barbatana caudal prejudicada. Este modelo é único na medida em que o peixe-zebra é capaz de regenerar o seu pâncreas danificado e restaurar um estado euglicémico semelhante ao que seria de esperar na pós-transplante de pacientes humanos. Além disso, múltiplos ciclos de amputação barbatana caudal permite a separação e estudo dos efeitos epigenéticos puros em um sistema in vivo sem potenciais factores de complicação do estado diabético anterior. Embora euglicemia é alcançada após a regeneração pancreática, a complicação diabética secundário de regeneração e cicatrização de feridas fin pele persistir indefinidamente. No caso de regeneração da barbatana prejudicada, esta patologia é mantida mesmo após vários ciclos de regeneração da barbatana nos tecidos aleta filha. Estas observações apontam para um processo subjacente epigenética existentes na memória de estado metabólico. Aqui apresentamos os métodos necessários para o sucesso gengerar a grupos de diabéticos e de memória metabólica de peixes e discutir as vantagens deste modelo.

Tipo I zebrafish diabético não apenas exibem as complicações secundárias conhecidas de retinopatia e nefropatia, mas também, exibem uma complicação adicional: regeneração da barbatana caudal prejudicada. Esta complicação tardia persiste devido à memória metabólica em peixes que restaurou o controle da glicose normal após um período hiperglicêmicos. Na Figura 2A (controle) e Figura 2B (memória metabólica) Imagens representativas de aletas em regeneração que foram ca...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Memória metabólica é o fenômeno pelo qual complicações diabéticas persistir e progredir sem obstáculos, mesmo depois de euglicemia é alcançado farmacêutico. Descrevemos aqui um modelo de diabetes mellitus do peixe-zebra que é único na medida em que permite que o exame dos componentes mitoticamente transmissíveis epigenéticos de memória metabólica<em&gt; In vivo</em&gt;.

Um modelo Zebrafish de Diabetes Mellitus e Memória Metabólica

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

a-zebrafish-model-of-diabetes-mellitus-and-metabolic-memory

Research

JoVE Journal

Medicine

25.5K visualizações.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Memória metabólica é o fenômeno pelo qual complicações diabéticas persistir e progredir sem obstáculos, mesmo depois de euglicemia é alcançado farmacêutico. Descrevemos aqui um modelo de diabetes mellitus do peixe-zebra que é único na medida em que permite que o exame dos componentes mitoticamente transmissíveis epigenéticos de memória metabólica In vivo.

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Medicina

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

Um Modelo de Infusão Crónica de nutrientes no Rato

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Um método de precipitação de modificação para isolar exossomas urinária

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Faz com cistos no peixe-zebra Rins

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesão cirúrgica para o mouse Pâncreas através da ligadura da pâncreas Duct como um modelo para endócrina e exócrina Reprogramação e Proliferação

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Dissecação do pâncreas Mouse para análise histológica e perfis metabólicos

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Estudando a Diabetes através dos olhos de um peixe: Microdissection, visualização e análise do tg(fli:EGFP) adulto vasculatura da retina de Zebrafish

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Composição corporal e análise de enjaulamento metabólico em ratos de alta gordura Fed

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.