이 작품은 Iacocca 가족 재단, 로잘린 프랭클린 대학 시동 기금 및 건강 그랜트 DK092721 국립 연구소 (RVI까지)에서 연구 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 원고 준비에 도움을 니키 Intine 감사하고 싶습니다.

모든 절차는 &quot;실험실 동물 관리의 원칙&quot;에 설명 된 지침 (보건 간행물의 국립 연구소 안돼. 85-23, 1985 개정) 및 승인 로잘린 프랭클린 대학 기관 동물 케어에 따라 수행하고위원회 동물에게 프로토콜 08-19을 사용하고 있습니다. 이 원고에 사용되는이 중요한 약어가 있습니다. 1) DM은 : 급성 (300 MG / DL) hyperglycemic 상태에 있고 적어도 3 주되었습니다 물고기를 의미합니다. 2) MM은 : (참조 프로토콜) DM 생선 21일 있었고, 췌장 재생을 통해 글루 세믹 제어를 복원 할 수 물고기를 의미합니다. 이것은 약물 제거의 (14) 일 이내에 이루어집니다. 생선이 시점 이후의 MM 물고기로 간주됩니다. 제어라고합니다 그 물고기에 유의하는 것도 중요 것은 DM 또는 MM 주사의 수 측면에서 물고기 (단 염분), 다양한 온도에서 배양 시간 및 번호와 타이밍으로 동일하게 처리됩니다꼬리 지느러미 절단의. 1. 당뇨병, DM 생선과 Zebrafish의 생성 <ol><li> 복구 및 마취 물 탱크를 모두 준비합니다. 복구 물은 일반 생선 물입니다. 2 phenoxyethanol 너무 평범 물고기 물에 1:1,000 희석이 달성되는 충분한 추가 마취 물하십시오. </li><li> 0.09 %의 나트륨 염화물의 2 ML에 STZ 6 MG를 추가하고 즉시 얼음에 솔루션을 배치하여 streptozocin (STZ)의 0.3 % 솔루션을 (퓸 배출 후드에서) 준비합니다. 이 20 분에서 약 20 생선의 분사에 대한 충분한 주입 솔루션을 제공 할 것입니다. 당신이 20 분 마르크를 초과하는 경우, 중지, 그리고하기 전에 새로운 STZ 솔루션을합니다. 제어 물고기에 대한 별도의 관 나누어지는만큼 생리 식염수합니다. STZ이 solubilized되면​​ 이후의 모든 단계는 연기 후드 사용을 요구하지 않습니다. </li><li> 기포가 갇힌되지 않습니다 보장 STZ 또는 제어 솔루션과 27 2분의 1 게이지 바늘을 갖추고 ½의 CC의 주사기를 채우십시오. </li><li> Anesthe마취 물에 물고기를 배치하여 개별적으로 물고기를 tize, 그들의 수영장 움직임이 (1-2 분) 중단 될 때까지 기다리십시오. </li><li> 일단 anesthetized 간략하게 어떤 초과 물을 흡수하기 위해 종이 타월에 고기를 놓고, 보트의 무게에 생선을 넣고 생선의 질량을 측정합니다. </li><li> 분사에 대한 확고한 표면 (페트리 접시 뚜껑)에 생선을 놓으십시오. </li><li> 복부 복막의 뒤쪽 측면에 베벨 통과 바늘을 삽입하여 생선의 복막 캐비티에 STZ 또는 제어 솔루션을 주사. </li><li> 0.35 MG / g는 STZ의 (350 밀리그램 / kg)은 각 생선 다음과 같은 방식으로 계산 될 수있다 필요한 0.3 % 솔루션의 볼륨으로 전달해야합니다. <ol class="lalpha"><li> 필요 MG에서 STZ의 양을 산출하기 위해 0.35에 의해 물고기의 대량 (g)를 곱합니다. </li><li> μl의 분사에 필요한 0.3 % 솔루션의 볼륨을 얻을 수 있도록 (3)에 의해 위에 생성 된 제품을 나눕니다. 샘플 : 0.5 g 물고기를 들면 다음과 같습니다) 0.5 X 0.35 = 0.175 B) 0.0175 / 3 = 0.058 ML= 58 μl. STZ없이 동일한 볼륨 컨트롤 물고기 주입 될 것입니다. 생선 질량 당 삽입 할 볼륨에 대한 시트가 생성 및 빠른 참조를 사용해야합니다. </li></ol></li><li> 다음 주입은 복구 물 탱크에 물고기를 넣고 일반 수영장 활동을 모니터링 할 수 있습니다. 일단이는 물고기를 달성 한 22의 감소 온도 범위에서 관리하고 있습니다 정상적인 생활 탱크에 전송됩니다 ° C - 24 ° C. 이 감소 온도는 고혈당증의 효율적인 유도 (당뇨병, DM)에 대한 중요합니다. </li><li> 고혈당증은 매우 높은 고혈당증의 연장 상태를 유도하기 위해, 첫 번째 주사 후 24 시간 이내에 감지되지만 zebrafish는 아래 그림과 같이 자주 주입 유도 단계는 매주 유지 보수 주사 다음이 필요합니다. </li></ol> 주 1 : 3 주사 (일 1, 3, 5), 주 2 : 1 분사 (일 12), 주 3 : 1 분사 (일 19), 주 4 : (21 일째)가 수행관심 검정. 이 시점에서 zebrafish는 고혈당증의 연장 상태에 빠진 것으로 간주하고 성 망막증, nephropathy 있으며, 장애인 지느러미 중생의 당뇨 합병증을 전시하고 있습니다. 이러한 DM 물고기라고합니다. 원하는 경우 또한 생선은 매주 유지 보수 주사로 hyperglycemic 상태에서 유지 될 수 있습니다. 이 과정에서 약 5 %의 사망이 예상됩니다. 2. 혈액 수집 및 금식 혈당 수준 (FBGL) 결정 <ol><li> DM 및 제어 물고기의 각 그룹이 분석이 물고기가 희생 될 필요로 정확하게 그룹의 평균 FBGL을 결정하기에 충분한 물고기를 포함해야합니다. </li><li> 멸균 정상적인 생리의 5 μl를 포함하는 각 혈액 샘플에 대한 표시 PCR 튜브를 준비합니다. </li><li> 혈액 수집를 들어, 위와 같이 물고기를 마취, 모든 물을 제거 현미경 슬라이드에 물고기를 넣고 메스를 사용하여 생선의 머리를 제거operculum의 기초에서. </li><li> 슬라이드로 생선 출시 신속하게 혈액이 방해하지 않도록하고를 아래로 pipetting 멸균 정상적인 생리의 5 μl에 추가되어있는 피를 (최대 2 μl)를 수집합니다. 즉시 얼음에 샘플을 배치합니다. </li><li> 액체의 총 양을 측정하여 혈액 샘플 량 (생리 + 피를) 결정하고 염분의 5 μl를 빼는. </li><li> 1.5 ML의 microfuge 튜브에 각 PCR 튜브로부터 희석 혈액의 5 μl를 전송하고 QuantiChrome 혈당 분석 키트를 사용하여 혈당 농도를 결정한다. 이것은 예외없이 제조업체의 프로토콜에 따라 수행됩니다. 예상 결과 : 일반 / 제어 물고기 60 MG / DL 및 DM 물고기 310 MG / DL. </li></ol> 3. 꼬리 핀 재생 연구 <ol><li> 1.0-1.4에 설명 된대로 물고기를 마취. </li><li> 살균 크기를 사용 장소 페트리 접시 뚜껑에 생선과 직선의 꼬리 지느러미를 절단10 해부 현미경을 통해 지느러미를 보는 동안 첫 번째 lepidotrichia 브랜칭 지점에 인접 메스. </li><li> 물고기는 1.10에서와 같이 복구하지만 분석의 재생 성장 단계에 대해 33 ° C에서 물고기를 게재 할 수 있습니다. 이 가속 지느러미 재생 분석을위한 설립 온도입니다. </li><li> 핀은 그러나 우리가 일상적으로 횡단 섹션에 따라 24, 28, 72 시간에서 재생 성장을 검토하는 시간 후 절단에 이미징 할 수 있습니다. </li><li> (1.0-1.4 참조) 이전처럼 생선을 마취, 카메라 (우리는 Q-이미징 카메라가 장착 된 니콘 SMZ-1500 사용)가 장착 된 해부 현미경으로 물고기를 넣고 NIS 요소 소프트웨어 1X 배율의 모든 지느러미 이미지를 수집 . 지느러미가 완전히 조직을 스트레칭하거나 손상시키지 않고 확장하고 물방울이 무료로해야합니다 있도록 이미지에 보급해야합니다. 일관성 항상 오른쪽에있는 등쪽면을 넣습니다. </li><li> 이미지를 인쇄하여 재생 촉진제를 측정wth 지역 이미지 J 소프트웨어 및 그리기 패드의 사용을 사용합니다. 새로운 성장의 전체 주변 추적 및 지역을 결정합니다. 각 측정은 다섯 번 만들어 추적의 정확성을 보장하기 위해 평균해야합니다. 그것은 이러한 가지 영역을 측정 오류에 기여로 사용 이미지가 그림자 나 물방울이없는 것이 중요합니다. </li><li> 등쪽 - 복부 축을 따라 절단 사이트의 길이를 측정하고이 측정에 의해 3.6에서 결정된 지역을 나눕니다. 이 다양한 크기의 물고기를 직접 비교 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 신진 대사 메모리 (MM) Zebrafish의 생성 <ol><li> DM 물고기와 제 1 절에 설명 된대로의 적절한 컨트롤의 그룹을 시작합니다. </li><li> 21일에서 그룹의 하위 집합에 대한 FBGL를 결정하는 2 하위 그룹에 DM 물고기를 나눕니다. 실험 기간 동안 DM 컨트롤 같은 그룹 중 하나에 매주 STZ 주사를 계속합니다. 두 번째 그룹과 incubat에 대한 STZ 주입을 중지전자 정상 온도에서 생선. 14 일 이내에 다음과 zebrafish는 정상적인 혈액 인슐린과 포도당 췌장 재생을 통해 제어를 복원합니다. 이 물고기는 현재 MM (대사 메모리 물고기)라고합니다. </li><li> 일 30 후 약물 제거 3.2에 설명 된 방법을 통해 물고기 DM 및 MM 관리의 꼬리 지느러미를 절단. </li><li> 30 일 동안 지느러미 재생을위한 정상적인 물 조건에 생선을 반환합니다. 이 우리 용어, 대사 메모리 조직의 성장을 할 수 있습니다. </li><li> 하루에 60 30~60일에서 시대에 생성 된 조직 내에서 두 번째 절단합니다 (3.2에서 설명)을 수행하고 꼬리 지느러미 재생 분석 (3.1-3.7) 그림 1을 수행합니다. </li><li> 조직을 분리하고 관심 검정을 수행합니다. 프로토콜 요약에 대한 표 1을 참조하십시오. </li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

당뇨병은 처음 궁극적으로 euglycemia이 제약 개입 불구하고 달성 한 후 모든에도 계속 많은 합병증으로 이어지는 혈관 손상에 결과 고혈당증로 진단 신진 대사 dysregulation의 질병입니다. 합병증의 지속성은 신진 대사 메모리와 여러 가지 최근의 연구 epigenetic 메커니즘이 현상에서 재생하는 역할을 검토 한라고도합니다. 여기 급성 당뇨병과 신진 대사 메모리 (복원 포도당 제어) zebrafish 모두의 세대?...

당뇨병 (DM)은 심각한 성장하는 건강 문제입니다 질병 특정 microvascular (성 망막증, nephropathy, 신경 장해, 장애 상처 치유)와 macrovascular (심장 질환과 뇌졸중) 합병증이 1 인해 감소 수명 결과입니다. 일단 시작, 당뇨 합병증은 글루 세믹 컨트롤이 2,3를 달성 경우에도 중단 발전을 계속하고 이러한 현상은 신진 대사 메모리 또는 기존 효과를 칭했다되었습니다. 이러한 현상의 존재는, &quot;당뇨병 관리 및 합병증 시험 (DCCT)&quot;진행하고 있기 때문에 여러 추가 임상 시험 4,5,6,7,8,9,10에 의해 지원 된과 1990 년대 초반 동안 임상 적으로 인정 받았습니다 11,12,13,14. DM의 동물 모델은 당뇨병 합병증 및 신진 대사 메모리의 patho - 생리학에 관한 발견에 중요했습니다. 사실, 당뇨병 합병증의 지속성 먼저 당뇨병의 개 모델에 문서화 된어떤 성 망막증은 이후 체외 문화 시스템 및 동물 모델 15,16,17,18,19,20,21에서 다양한을 사용하여 실험 증거의 여러 라인에 의해 지원되었습니다. 이러한 연구는 명확 대상 기관 / 세포의 영구적 인 이상 (비정상 유전자 발현 포함)과 mechanistically 초기 hyperglycemic 기간 결과가 epigenome의 참여를 제안하는 보여줍니다. Epigenomes는 특정 세포 유형에 대한 모든 염색질 수정으로 구성되어 있으며 세포의 독특한 유전자 발현 프로파일에 대한 책임을 져야합니다. 염색체 개조, 개발, 지원 세포 분화 동안 동적 외부 자극에 민감하게 반응, mitotically 안정적으로 22,23을 계승하고 질병 24,25,26에서 변경 될 수 있습니다. 이러한 epigenetic 메커니즘은 다음과 같습니다 : 병진 히스톤 수정, octomers의 비표준 히스톤 변형 포함, DNA의 methylation을 통해 염색질 액세스 변경, 유전자를 게시마이크로 RNAs에게 27,28,29,30을 비 코딩을 통해 표현 제어 할 수 있습니다. 개의 epigenetic 프로세스가 세포 / 유기체를 신속하게 환경 자극 할 31,32,33 변화에 대응 할 수 있도록, 그들은 또한 이러한 자극은 23,22을 제거 한 번 발생 &quot;기억&quot;할 수있는 셀에 대한 능력을 부여. epigenetic 과정에서 발생하는 변경된 유전자 발현 프로필을 시작한 신호의 부재 (들)에 안정되어 있으며 세포 분열을 통해 물려 전할 수있는 아르 그러므로, 그들은 신진 대사 메모리를 포함한 인간 pathologies의 분자 메커니즘을 근간으로 큰 관심을 받고있다. DM 및 epigenetics 고혈당증에 의해 유도 epigenetic 변화의 과다는 세포의 전사 네트워크에서 놀라운 영구적 인 변경 사항 (34,35,36,37,38에서 검토)의 원인이 다른 질병에서 병렬 발전의 맥락에서 등장하고 결과를 표시합니다. zebrafish은 오래 스튜에 최고의 모델 생물되었습니다마구 척추 개발하지만 지난 15 년은 인간의 질병 연구를 위해이 유전자를 활용의 기하 급수적 성장. 39 보여줬습니다. 인간의 질병의 Zebrafish 모델은 유전 적 장애와 획득 질병 40,41,42 등의 인간 pathologies의 다양한 걸쳐 설립되었습니다. 다른 척추 동물 모델 생물을 통해 zebrafish의 많은 장점은 높은 생산력, 짧은 세대 시간, 초기 성인기를 통해 투명성, 감소 주택 비용과 유전자 조작 도구의 배열이 포함되어 있습니다. 또한, vertebrates 높은 처리량 약물 검사를 수행 할 수있는 능력 간의 유전 적 경로 및 세포 생리학의 광범위한 보존으로 인해, zebrafish이 성공적으로 제약 검색에 사용되었습니다. 우리는 diabetogenic 약물, streptozocin을 사용하여 유형 I 당뇨병의 성인 zebrafish 모델을 개발했습니다. 우리는 당뇨병 zebrafish 께를 표시하려면이 모델을 특징 없습니다t는 알려진 인간의 보조 합병증을 표시하지만,뿐만 아니라, hyperglycemic 환경의 결과로 장애인 사지 재생 (꼬리 지느러미 재생)을 나타냅니다. 또한, 우리는 hyperglycemic의 zebrafish는 생리 학적으로 정상 글루 세믹 상태의 결과로 내생 췌장 베타 세포의 재생으로 인해 약물 제거의 2 주 이내에 정상으로 glycemia으로 되돌아 것으로보고있다. 이 합병증은 계속하고 신진 대사 메모리에 민감합니다 나타내는 급성 당뇨병 상태에서 그러나 반면,이 물고기의 사지 재생은 동일한 범위에 장애인 남아있다. 이 모델을 생성하기위한 주요 원동력은 이전 hyperglycemic 환경의 배경 소음이없는 상태에서 신진 대사 메모리 현상을 지원하는 mitotically 안정적인 epigenetic 구성 요소를 연구하는 시스템을 제공하는 것이 었습니다. 프로토콜의 결론에서 zebrafish 혹은 선택적 조직이 resea에 적합한 모든 분석에 의해 처리 될 수 있습니다 여기에 제공된rchers이 필요합니다. 우리는 성공적으로 신진 대사 메모리 상태 21 유지 고혈당증에 의해 유도 DNA의 methylation의 게놈 전체의 영구적 인 변경 사항을 확인하려면이 절차를 사용했습니다. 우리는 유형 I 당뇨병이 zebrafish 모델은 신진 대사 메모리를 검사에 대한 다른 모델 시스템을 통해 여러 가지 혁신적인 장점을 가지고 있다는 느낌이 듭니다. 1) 우리의 연구는 모두 생체 실시 할 수 있으며, 이전 hyperglycemic 물고기는 내생 인슐린 생산의 재생을 통해 euglycemia로 돌아갑니다으로, 그들은 외인성 인슐린 주사를 필요로하지 않습니다. 따라서이 외인성 인슐린을 필요로하는 동물에서 발생할 수있는 글루 세믹 컨트롤에서 복잡 스파이크와 계곡을 방지합니다. 2) 위의 설명에 따라 이전 당뇨병 상태 (즉, 고급 glycation 최종 제품과 반응성 산소 종 마커의 지속적인 존재)에서 배경 자극이 제거되며 따라서 하나는 순수 epig을 검사 할 수 있습니다으로신진 대사의 메모리 enetic 요인. 이 대사 메모리 검사까지 당뇨병 유도에서 약 80 일이 소요으로 3) 실험은 빠르게 수행 할 수 있습니다. 4) 꼬리 지느러미 재생이 실험적으로 매우 가까이 있으며, 도구의 광대 한 배열이되는 쉬운 유전 및 실험 조작 할 수 있습니다. 5) 꼬리 지느러미 재생는 신진 대사가 기억을 평가하고 따라서 미래의 약물 발견을위한 수있는 매우 간단하고 객관적 방법을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 이 phenoxyethanol </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 (크기 10) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> 27 2분의 1 게이지 바늘로 ½ 참조 용 주사기, </td><td> 피셔 과학 </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome glucose 분석 키트. </td><td> Bioassay 시스템 </td><td> DIGL-100 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경을 해부 </td><td> 니콘 </td><td> TMZ-1500 </td><td> 모든 해부 현미경은 유효합니다. </td></tr><tr><td> 이미징을위한 카메라 </td><td> 니콘 </td><td> Q 이미징 </td><td> 모든 카메라가 적합합니다. </td></tr><tr><td> 이미지 J 소프트웨어 </td><td> 건강의 국립 연구소 </td><td> NIH 이미지 </td><td></td></tr><tr><td> NIS 요소 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 모든 이미징 소프트웨어가 적합합니다. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

당뇨병은 현재 346,000,000 개인에 영향을 미치는이는 2030 년까지 400,000,000로 증가 할 것으로 예상된다. 실험실과 대규모 임상 시험 모두에서 증거가 당뇨병 합병증이 진행이 글루 세믹 컨트롤이 약물 달성에도 신진 대사 메모리의 현상을 통해 unimpeded 것을 밝혔다. 유전자 발현이 안정적으로 세포와 생물 신속하게 환경 자극 변화에 대응하는 것을 허용하지 만 epigenetic 변화를 통해 변경뿐만 아니라 이러한 자극이 제거 한 번 발생 &quot;기억&quot;할 수있는 세포의 기능을 부여 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 메커니즘은 신진 대사 메모리 현상에서 재생하는 역할은 현재 검토되고있다. 우리는 최근 유형 I 당뇨병의 zebrafish 모델의 개발을보고와 관련 변경 사항을 포함 알려진 보조 합병증을 표시하지 해당 당뇨병 zebrafish를 표시하려면이 모델을 특징으로 한당뇨병 성 망막증, 당뇨병 nephropathy 및 장애자 상처 치유와뿐만 아니라 장애인 꼬리 지느러미 재생을 나타냅니다. 이 모델은 zebrafish가 손상된 췌장을 다시 생성 및 사후 이식 인간 환자에 예상되어지는 것과 유사한 euglycemic 상태를 복원 할 수 있다는 특징이다. 또한, 꼬리 지느러미 절단의 여러 라운드는 이전의 당뇨병 상태에서 잠재적 복잡한 요인이없는 생체 시스템에서의 순수한 epigenetic 효과의 분리 및 유학 수 있습니다. euglycemia은 췌장 재생에 따라 달성 있지만, 지느러미 재생 및 피부 상처 치유의 당뇨병 차 합병증이 무한정 지속된다. 장애인 지느러미 재생의 경우,이 병리학도 딸의 지느러미 조직의 지느러미 재생의 여러 라운드 후 유지됩니다. 이러한 관찰은 신진 대사 메모리 상태에서 기존의 기본 epigenetic 프로세스를 가리 킵니다. 여기 성공적으로 세대에게 필요한 방법을 제시생선의 당뇨병과 신진 대사 메모리 그룹을 제거했다이 모델의 장점에 대해 설명합니다.

장애인 꼬리 지느러미 재생 : I 당뇨병 zebrafish뿐만 아니라 성 망막증과 nephropathy의 알려진 보조 합병증을 표시뿐만 아니라, 추가 합병증을 전시를 입력합니다. 이 후 합병증은 hyperglycemic 기간에 따라 정상적인 포도당 통제를 복원 한 물고기의 신진 대사 메모리로 인해 지속된다. 그림 2A (제어) 및 그림 2B (신진 대사 메모리) 72 시간의 포스트 절단에 캡처 된 재생 핀들의 대?...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

신진 대사 메모리는 당뇨병 합병증이 지속하고 euglycemia이 약물 달성 후에도 unimpeded 진행되는이 현상이다. 여기 우리는 신진 대사 메모리의 mitotically 보낼 수있는 epigenetic 구성 요소의 시험을 할 수 있다는 점에서 고유 한 당뇨병 zebrafish 모델을 설명<em&gt; 생체 내</em&gt;.

당뇨병과 신진 대사 메모리의 Zebrafish 모델

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.5K 조회수.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. 신진 대사 메모리는 당뇨병 합병증이 지속하고 euglycemia이 약물 달성 후에도 unimpeded 진행되는이 현상이다. 여기 우리는 신진 대사 메모리의 mitotically 보낼 수있는 epigenetic 구성 요소의 시험을 할 수 있다는 점에서 고유 한 당뇨병 zebrafish 모델을 설명 생체 내.

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

연구

의학

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

쥐의 만성 영양 주입의 모델

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

수정 된 침전 법은 요도 엑소 좀을 분리

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운<em&gt; wnt5a</em&gt; Zebrafish의 신장의 낭종 원인

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

내분비 및 외분비 리 프로그래밍과 대량 살상 무기 확산 모델로 췌관의 결찰을 통해 마우스 췌장 외과 부상

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

철 염화물에 의한 경동맥 및 장간막 용기에 혈전증 마우스 모델

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

조직학 분석 및 대사 프로 파일링에 대 한 마우스 췌의 해 부

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

신체 구성 및 높은 지방 연 준 쥐에서 대사 배우면 분석

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.