この作品は、アイアコッカファミリー財団、ロザリンドフランクリン大学スタートアップ資金、健康グラントDK092721（RVIまで）の国立研究所からの研究助成金によって支えられている。著者は、原稿作成の援助のためのニッキ内膜に感謝したいと思います。

すべての手順は、（85から23までは、。研究所国立保健出版物のいかなる1985年改訂） &quot;実験動物ケアの原則&quot;で説明したガイドラインに従って実施され、承認ロザリンドフランクリン大学機関動物実験委員会、動物プロトコル08から19を使用しています。 この原稿で使用されている2つの重要な略語があります。 1）DMは、急性（300 mg / dl）は、高血糖状態になっている魚を意味し、少なくとも3週間となっていました。 2）MMは：21日であった魚（プロトコルを参照してください）​​、DM魚を指し、膵臓再生を通じて血糖コントロールを復元することができました。これは薬剤の除去（14）日以内に達成されています。魚はこの時点以降からMM魚とみなされます。コントロールと呼ばれている魚を注意することも重要であることは、DM又はMM注射の数の点で魚（生理食塩水のみ）、様々な温度でのインキュベーション時間数とタイミングと同じように扱われます尾鰭切断の。 1。糖尿病は、DMとゼブラフィッシュの発生<ol><li>回復と麻酔薬の水タンクの両方を準備します。回復水は通常の魚の水である。麻酔薬水は通常の魚の水中で1:1000希釈が達成されるように、2 - フェノキシエタノールを十分追加します。 </li><li> 0.09％塩化ナトリウム2mlにSTZ 6mgのを追加し、直ちに氷上にソリューションを配置することによってストレプトゾシン（STZ）の0.3％溶液（ドラフト内で）を用意します。これは、20分で約20魚を注入するための十分な注射液を提供するでしょう。あなたは20分のマークを超えた場合、停止、続行する前に、新鮮なのSTZ溶液を作る。コントロール魚用に別のチューブアリコート十分な生理食塩水で。 STZが可溶化された後、後続のすべての手順は、ヒュームフードの使用を必要としません。 </li><li>に気泡がトラップされていないことを確実にSTZまたはコントロールソリューションで27 1/2ゲージの針を装備半ccシリンジを埋める。 </li><li> Anesthe麻酔水に魚を置くことによって、個々の魚をtize、およびそれらの水泳の動きは（1-2分）止まるまで待ちます。 </li><li>一度麻酔簡単には余分な水分を吸収するペーパータオルの上に魚を置いて、船の重さで魚を置き、魚の質量を測定する。 </li><li>注入のためのしっかりした面（シャーレのふた）に魚を置きます。 </li><li>腹側腹膜の後面にベベルを過ぎて針を挿入することによって、魚の腹腔内にSTZまたはコントロール溶液を注入する。 </li><li> STZの0.35 mg / gの（350 mg / kgの）はそれぞれの魚に配信されるべきであり、必要な0.3％溶液の体積は次のように計算することができます。 <ol class="lalpha"><li>必要なのmg STZ量を得るために0.35で魚の質量（g）を掛けます。 </li><li> μlの注入に必要な0.3％溶液の体積を得るために3で生成された上記の製品を分割します。 サンプル：0.5グラムの魚の場合：）0.5×0.35 = 0.175 b）は0.0175 / 3 = 0.058ミリリットル= 58μlの。 STZなしで同じボリュームがコントロール魚のために注入されるであろう。魚質量当たりの注入するボリューム用シートが生成され、クイックリファレンスとして使用されるべきである。 </li></ol></li><li>注入後の回復水槽で魚を置き、通常の水泳活動のためにそれらを監視します。 24℃ - この設定が完了すると、22℃での還元温度範囲に維持されている通常の生活タンクに移送された魚を達成されているこの減少温度は、高血糖の効率的な誘導（糖尿病、DM）のために不可欠です。 </li><li>高血糖は、最初の注射の24時間以内に検出されていますが、非常に高血糖の状態が長期化を誘導するために、ゼブラフィッシュでは、下図のように毎週の保守注射続く頻繁な注射誘導段階を必要とします。 </li></ol>第1週：3回の注射（1日目、3、5）、第2週：1注射（12日目）、第3週：1注射（19日目）、 第4週（21日目）を実行関心のアッセイ。 この時点で、ゼブラフィッシュは、高血糖の長期状態になっていると考えられ、網膜症、腎症とも損なわフィン再生の糖尿病合併症を発揮しています。これらは、DMの魚と呼ばれています。必要に応じてさら​​に魚は毎週メンテナンス注射で高血糖状態に維持することができる。このプロセスの間に約5％の死亡が予想されるべきです。 2。採血や空腹時血糖値（FBGL）判定<ol><li> DMとコントロール魚の各グループは、このアッセイは、これらの魚が犠牲にする必要があるため、正確にはグループの平均FBGLを決定するのに十分な魚を含める必要があります。 </li><li>滅菌生理食塩水5μlを含む各血液サンプルのために標識PCRチューブを準備します。 </li><li>採血については、上記のように魚を麻酔し、すべての水を除去顕微鏡スライド上に魚を置いて、メスを用いて、魚の頭を削除蓋の基部にある。 </li><li>スライド上に魚から解放され、迅速に血液が詰まらないことを確認するために上下にピペッティングし滅菌生理食塩水を5μlに追加された血液（最大2μl）を収集します。すぐにサンプルを氷上に置きます。 </li><li>液体（生理食塩水+血液）の総量を測定することにより、血液検体量を決定してから、生理食塩水5μlを差し引く。 </li><li> 1.5 mlのマイクロチューブに各PCRチューブから希釈血液5μlを移し、QuantiChromeグルコースアッセイキットを用いて、血中グルコース濃度を測定します。これは、例外なく、製造業者のプロトコルに従って行われます。期待される結果：制御/通常魚60 mg / dlとし、DM魚310 mg / dlと。 </li></ol> 3。尾びれ再生研究<ol><li> 1.0から1.4で説明したように魚を麻酔。 </li><li>シャーレの蓋の上に魚を置き、無菌のサイズを使用して直線で尾びれを切断10解剖顕微鏡を介してフィンを見ながら第一lepidotrichia分岐点に近接したメス。 </li><li>魚が1.10のように回復するが、アッセイの回生成長期のため33℃で魚を配置することができます。これは、加速されたフィン回生分析のための確立された温度である。 </li><li>フィンは、しかし、我々は日常的にトランス節後24、28および72時間で回生成長を調べ、いつポスト切断で撮像することができる。 </li><li>前と同じように魚を麻酔（1.0から1.4を参照）、カメラ（私たちは、Q-イメージングカメラを搭載したニコンSMZ-1500を使用）を装備した解剖顕微鏡下で魚​​を置き、NISの要素ソフトウェアと1X倍率ですべてのフィン画像を収集。フィンは、それが完全に組織を伸ばしたり、損傷することなく拡張され、また、水滴があってはならないように、イメージングのために分散させる必要があります。一貫性を保つため、常に右側に背側に配置します。 </li><li>画像を印刷すると回生GROを測定イメージJソフトウェアおよび描画パッドの使用を使用してwthのエリア。新たな成長の全体の領域の周りにトレースして、面積を求める。各測定は5回行い、トレースの精度を確保するために平均化されるべきである。それは、これらが伸長面積を測定する際の誤差に寄与として使用されている画像は、影や水滴を持っていないことが重要です。 </li><li>背腹軸に沿って切断部位の長さを測定し、この測定で3.6で決定された領域を分割する。これは、異なるサイズの魚を直接比較することができます。 </li></ol> 4。メタボリックメモリ（MM）ゼブラフィッシュの発生<ol><li>セクション1で説明したように、DM魚とその適切なコントロールのグループを開始します。 </li><li> 21日目にグループのサブセットに対してFBGLを決定し、2つのサブグループにDMの魚を分ける。実験期間中のDMコントロールなどのグループのいずれかのために毎週のSTZ注射を続けています。第二のグループとincubat用STZ注射をやめる電子常温で魚。 14日以内にこれらのゼブラフィッシュは、膵臓の再生を通じて、正常な血中インスリンと血糖コントロールを復元することになります。これらの魚は現在、MM（メタボリックメモリの魚）と呼ばれています。 </li><li>一日で30ポスト薬物除去には、3.2で説明されたメソッドを使ってコントロールの尾鰭は、DMとMM魚を切断。 </li><li> 30日間フィンの再生のための通常の水の条件に魚を戻す。これは、私たちの用語、メタボリックメモリ組織の成長を可能にします。 </li><li>一日で60は30〜60日の期間に再生された組織内で第二切断を（3.2で説明）を実行すると尾鰭再生アッセイ（3.1から3.7） 図1を実行します 。 </li><li>組織を分離し、興味のある検定を実行します。プロトコルの概要については、 表1を参照してください。 </li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

糖尿病は、究極的にはすべての正常血糖値は薬剤介入にもかかわらず達成された後も持続し、多くの合併症につながる血管損傷につながる最初に高血糖と診断された代謝調節異常の病気、です。合併症のこの固執は代謝メモリと呼ばれ、いくつかの最近の研究では、エピジェネティックなメカニズムがこの現象に果たす役割を検討した。ここでは、急性の糖尿病やメタボリックメモリ（復元?...

糖尿病（DM）は、深刻かつ成長健康問題であることを特定の微小血管疾患（網膜症、腎症、神経障害、障害、創傷治癒）および大血管（心臓病や脳卒中）合併症1による平均寿命の低下をもたらす。一度開始されると、糖尿病の合併症は、血糖コントロールが2,3を達成した場合であっても中断せずに進行していき、この現象は、代謝メモリまたはレガシー効果と呼ばれています。この現象の存在は、 &quot;糖尿病コントロールと合併症試験（DCCT）&quot;として、1990年代初頭の間に臨床的に認識され、進行し、複数の追加の臨床試験4,5,6,7,8,9,10によってサポートされているので、 11,12,13,14。 DMの動物モデルは、糖尿病の合併症とメタボリックメモリの病態生理学に関連する発見のために重要であった。実際には、糖尿病合併症の永続性は第一糖尿病のイヌのモデルで記述されていました以来、 体外培養系および動物モデル15,16,17,18,19,20,21 でのさまざまな方法を使って実験的ないくつかの証拠によって支えられてきた網膜症。これらの研究は、はっきり標的臓器/細胞の永久的な異常（異常な遺伝子発現を含む）の初期の高血糖期間の結果ことを示していると機構的エピゲノムの関与を示唆している。 Epigenomesは、指定されたセル·タイプのすべてのクロマチン修飾から構成され、細胞のユニークな遺伝子発現プロファイルを担当している。染色体の変更は、開発、サポート細胞分化の間に動的であり、外部刺激に応答する、有糸分裂的に安定して22,23を継承され、病気24,25,26に変更することができます。これらのエピジェネティックなメカニズムは次のとおり翻訳後ヒストン修飾、octomersにおける非正規ヒストンバリアントの取り込み、DNAメチル化を介してクロマチンアクセスの変更、および遺伝子をノンコーディングRNAはマイクロ27,28,29,30を介して発現制御。要するに、エピジェネティックなプロセスは細胞/生物は速やかに環境刺激に31,32,33の変化に対応できるように、彼らはまた、これらの刺激が23,22を除去され、一度遭遇&quot;暗記&quot;する細胞の能力を付与する。エピジェネティックなプロセスから生じる変化した遺伝子発現プロファイルは、それらを開始し、細胞分裂を介して遺伝している信号（S）の非存在下で安定しているようなので、、彼らは、メタボリックメモリーを含む人間の病態の分子メカニズムの根底として大きな関心を集めている。高血糖によって誘発されるエピジェネティックな変化の茄多細胞（34,35,36,37,38で検討）の転写ネットワークの著しい持続的な変化を引き起こすという点で、他の疾患のDMとエピジェネ平行進化の文脈で出現している結果。 ゼブラフィッシュは、長い学生に最初のモデル生物であったdyは、過去15年間しかし開発を脊椎動物、ヒトの疾患の研究のためにこの生物を利用した指数関数的に成長を遂げている39。ヒト疾患のゼブラフィッシュモデルは遺伝性疾患や後天性疾患40,41,42を含む人間の病理学の広い範囲にまたがる確立されている。他の脊椎動物のモデル生物上ゼブラフィッシュの多くの利点は、高い繁殖力、短い世代時間、早期成人期を通じて透明性、減少住宅費と遺伝子操作のためのツールの配列が含まれています。また、脊椎動物およびハイスループット薬物スクリーニングを実行するための能力の間の遺伝的な経路および細胞生理の広範な保全のため、ゼブラフィッシュが正常医薬品発見のために使用されてきました。 我々は、糖尿病薬、ストレプトゾシンを使用して、I型糖尿病の成人のゼブラフィッシュモデルを開発した。私たちにはその糖尿病ゼブラフィッシュを表示するには、このモデルを特徴付けなかったtは唯一の既知のヒト二次的合併症を表示するが、それに加えて、高血糖環境の結果として障害四肢再生（尾鰭再生）を示す。加えて、我々は高血糖ゼブラフィッシュは、生理学的に正常な血糖状態となる内因性膵β細胞の再生のために薬物除去から2週間以内に正常な血糖に戻すことを報告している。この合併症を示す急性糖尿病の状態が続くとメタボリックメモリに影響されやすいようにしかし、これとは対照的に、これらの魚類における四肢再生が同程度に損なわれたまま。このモデルを生成するための主な原動力は、以前の高血糖環境のバックグラウンドノイズのない状態で代謝メモリ現象をサポートする有糸分裂的に安定したエピジェネティックな成分を研究するためのシステムを提供することでした。プロトコルの結論ではゼブラフィッシュおよびまたは選択組織がreseaに適した任意のアッセイによって処理することができ、ここで提供rchersが必要です。我々は、正常な代謝メモリ状態21に保持され高血糖によって誘発されるDNAメチル化のゲノムワイドな永続的な変更を識別するためにこのプロシージャを使用している。 我々は、I型糖尿病のこのゼブラフィッシュモデルはメタボリックメモリーを調べるため、他のモデルのシステムに比べていくつかの革新的な利点を持っていることを感じています。 1）私たちの研究のすべては 、in vivo で行うことができ、以前の高血糖魚は内因性インスリン産生の再生を通じて正常血糖値に戻すように、彼らは、外因性のインスリン注射を必要としません。したがって、これは外因性のインスリンを必要とする動物で発生する可能性が血糖コントロールの複雑スパイクや谷を回避します。 2）上記のように、前の糖尿病の状態（ すなわち、終末糖化産物および活性酸素種のマーカーの継続的な存在）から、背景刺激が除去されるため、1つは、純粋epigを調べることができますメタボリックメモリのenetic要因。それは糖尿病誘導からメタボリックメモリ検査まで約80日かかるので3）の実験を迅速に行うことができます。 4）尾鰭の再生は、実験的に非常に親しみやすいとツールの広大な配列があるどのやすい遺伝的および実験的な操作を可能にする。 5）尾鰭の再生は、メタボリックメモリーを評価するため、将来の創薬が可能になる非常にシンプルかつ定量方法を提供するものである。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>ストレプトゾシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2フェノキシエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td>スカルペル（サイズ10） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> 27 1/2ゲージニードル付き½ccシリンジ、 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome gluc大証アッセイキット。 </td><td>バイオアッセイシステム</td><td> DIGL-100 </td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> TMZ-1500 </td><td>任意の解剖顕微鏡で結構です。 </td></tr><tr><td>イメージング用カメラ</td><td>ニコン</td><td> Qイメージング</td><td>任意のカメラが適しています。 </td></tr><tr><td>画像Jソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td> NIHのイメージ</td><td></td></tr><tr><td> NISの要素</td><td>ニコン</td><td></td><td>任意のイメージングソフトウェアが適しています。 </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

糖尿病は、現在3.46億個人に影響を与え、これは2030年を400万人に増加すると予測されています。実験室および大規模臨床試験の両方からの証拠は、糖尿病合併症の進行が血糖コントロールは、薬学的に達成されていても代謝のメモリ現象を介して、妨げられないことを明らかにした。遺伝子発現を安定細胞および生物が迅速に環境刺激の変化に対応できるようにするだけでなく、これらは刺激が除去され、一度遭遇 &quot;記憶&quot;する細胞の能力を付与するだけでなく、エピジェネティックな変化によって変更することができます。このように、これらのメカニズムはメタボリックメモリ現象で果たす役割は、現在検討されている。 我々は最近、I型糖尿病のゼブラフィッシュモデルの開発を報告し、関連する変更を含む既知の二次的合併症を表示するだけでなく、その糖尿病のゼブラフィッシュを表示するには、このモデルを特徴づけてきた糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症や障害創傷治癒を持つだけでなく、障害のある尾鰭の再生を示す。このモデルでは、ゼブラフィッシュは、その損傷した膵臓を再生し、移植後のヒト患者で予想されるものと同様の正常血糖の状態を復元することが可能であるという点でユニークです。また、尾鰭の切断の複数のラウンドは、前糖尿病状態からの潜在的な複雑な要因なしで分離し 、in vivo系で純粋なエピジェネティックな効果の研究を可能にします。正常血糖値は、膵臓の再生後に達成されるが、フィンの再生と皮膚創傷治癒の糖尿病二次性合併症は無期限に存続します。障害フィン再生の場合には、この病態であっても娘フィン組織におけるフィンの再生の複数のラウンド後も保持されます。これらの観​​察結果は、メタボリックメモリ状態に存在する基礎エピジェネティックなプロセスを指す。ここで我々は正常の世代に必要な手法を提示魚の糖尿病とメタボリックメモリーグループをerate、このモデルの利点について説明します。

障害尾鰭再生：私の糖尿病だけでなく、ゼブラフィッシュ網膜症や腎症の既知の二次的合併症を表示するだけでなく、追加の合併症を呈するを入力します。この後の合併症は、高血糖期間の後、通常の血糖コントロールを復元した魚の代謝メモリが原因で解決しない。 図2A（コントロール）および図2B（メタボリックメモリ）72時間後に切断で捕獲された再生フィン?...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

メタボリックメモリは、糖尿病合併症が持続し、正常血糖値は、薬学的に達成された後でも妨げられることなく進行する現象である。ここで我々はそれがメタボリックメモリの分裂伝染エピジェネティックな部品の検査を可能にするという点でユニークである糖尿病のゼブラフィッシュモデルを記述<em生体内で&gt;</em&gt;。

糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.6K ビュー.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. メタボリックメモリは、糖尿病合併症が持続し、正常血糖値は、薬学的に達成された後でも妨げられることなく進行する現象である。ここで我々はそれがメタボリックメモリの分裂伝染エピジェネティックな部品の検査を可能にするという点でユニークである糖尿病のゼブラフィッシュモデルを記述。

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

医学

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

ラットにおける慢性栄養注入のモデル

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

尿中エキソソームを単離するために、修正沈殿法

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン<em&gt; WNT5A</em&gt;ゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

内分泌と外分泌リプログラミングおよび増殖のためのモデルとしての膵管の連結を介して、マウスの膵臓への外科的損傷

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

塩化第二鉄誘発性頚動脈および腸間膜血管に血栓症のマウスモデル

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

マウスの膵臓の組織学的解析と代謝プロファイリングに対する郭清

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

身体組成と高脂肪給電マウスにおける代謝ケージ分析

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.

Methods Article

糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル