Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium aus dem Iacocca Family Foundation, Rosalind Franklin University Start-up-Fonds und National Institutes of Health Grants DK092721 (um RVI) unterstützt. Die Autoren möchten sich Nikki Intine für Beihilfen in Manuskripts danken.

Alle Vorgänge werden nach den Richtlinien in &quot;Principles of Laboratory Animal Care&quot; beschrieben (National Institutes of Health Veröffentlichungs-Nr. 85-23, revidiert 1985) und der zugelassenen Rosalind Franklin University Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss Tier-Protokoll 08-19. Es gibt 2 wichtige Abkürzungen, die in diesem Manuskript verwendet werden. 1) DM: bezieht sich auf Fische, die in einer akuten (300 mg / dl) hyperglycemic Zustand sind und für mindestens 3 Wochen. 2) MM: bezieht sich auf Fische, die 21 Tage waren (siehe Protokoll) DM Fisch und dürfen Blutzuckerkontrolle durch Pankreas-Regeneration wiederherzustellen. Dies wird in (14) Tagen von Drogen Entfernung erreicht. Die Fische werden MM Fische ab diesem Zeitpunkt berücksichtigt. Es ist auch wichtig, dass die Fische, die als Kontrolle bezeichnet werden beachten sind identisch wie DM oder MM Fische in Bezug auf die Anzahl der Injektionen (Kochsalzlösung only), der Inkubationszeiten bei den verschiedenen Temperaturen und der Anzahl und Zeitpunkt behandeltder Schwanzflosse Amputationen. Ein. Generation von Zebrafisch mit Diabetes mellitus, DM Fisch <ol><li> Bereiten Sie sowohl Erholung und Anästhesie Wassertanks. Recovery Wasser normale Fische Wasser. Für Anästhesie Wasser hinzufügen ausreichend 2-Phenoxyethanol, so dass ein 1:1,000 Verdünnung in normalen Fisch Wasser erreicht wird. </li><li> Vorbereiten einer 0,3% igen Lösung (in einer Abzugshaube) des Streptozocin (STZ) durch Zugabe von 6 mg STZ bis 2 ml 0,09% Natriumchlorid und sofort platzieren die Lösung auf Eis. Dies wird genügend Injektionslösung für die Injektion von etwa 20 Fische in 20 min. Wenn Sie die 20 Minuten-Marke überschreiten, stoppen und einen frischen STZ-Lösung bevor Sie fortfahren. In einem separaten Röhrchen Aliquot genug Salzlösung zur Steuerung Fisch. Sobald das STZ solubilisiert alle nachfolgenden Schritte erfordern keine Abzugshaube verwenden. </li><li> Füllen Sie eine ½ cc Spritze mit einer 27 1/2 Gauge-Nadel mit den STZ-oder Control-Lösungen sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen ausgestattet sind. </li><li> AnestheTize jeden Fisch einzeln, indem Sie den Fisch in der Anästhesie Wasser und warten, bis ihr Schwimmen Bewegung aufhört (1-2 min). </li><li> Einmal betäubt kurz den Fisch auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu absorbieren, den Fisch in Wiegeschiffchen und messen die Masse der Fische. </li><li> Legen Sie den Fisch auf eine feste Unterlage (Petrischalendeckel) zur Injektion. </li><li> Injizieren die STZ-oder Kontroll-Lösung in die Bauchhöhle des Fisches durch Einsetzen der Nadel hinter der Fase in den posterioren Aspekt der ventralen Peritoneum. </li><li> 0,35 mg / g (350 mg / kg) der STZ sollte jedem Fisch und dem Volumen der 0,3%-Lösung erforderlich ist, in der folgenden Weise berechnet werden zugestellt. <ol class="lalpha"><li> Multiplizieren Masse von Fischen (g) von 0,35, die Menge des in mg STZ erforderlich ergeben. </li><li> teilen das Produkt oberhalb von 3 erzeugt, um das Volumen der 0,3% Injektionslösung in ul erforderlich ergeben. Beispiel: Für eine 0,5 g Fisch: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 ul. Das gleiche Volumen ohne STZ würde für ein Steuerelement Fisch injiziert werden. Ein Blatt für Volumina pro Fisch Masse spritzen sollen erzeugt und verwendet werden zum schnellen Nachschlagen. </li></ol></li><li> Nach der Injektion den Fisch in der Erholung Wassertank und überwachen sie für den normalen Schwimmen Aktivität. Sobald dies erreicht werden die Fische in einen normalen lebenden Tank, der bei der reduzierten Temperatur von 22 gehalten wird übertragen ° C - 24 ° C. Diese reduzierte Temperatur ist entscheidend für die effiziente Induktion von Hyperglykämie (Diabetes mellitus, DM). </li><li> Obwohl Hyperglykämie in 24 h nach der ersten Injektion erfasst wird, um einen verlängerten Zustand sehr hohen Hyperglykämie induzieren der Zebrafisch erfordern eine häufige Injektion Induktionsphase gefolgt von wöchentlichen Wartung Injektionen wie unten gezeigt. </li></ol> Woche 1: 3 Injektionen (Tag 1, 3, 5), Woche 2: 1 Injektion (Tag 12), Woche 3: 1 Injektion (Tag 19), Woche 4: (Tag 21) FührenAssay von Interesse. An diesem Punkt der Zebrafisch als in einem längeren Zustand der Hyperglykämie gewesen und zeigen die diabetischen Komplikationen der Retinopathie, Nephropathie und ebenfalls beeinträchtigt fin Regeneration. Diese werden als DM Fische. Zusätzlich wenn gewünscht die Fische können in der hyperglycemic Staat mit wöchentlichen Wartungsarbeiten Injektionen eingehalten werden. Etwa 5% der Tod während dieses Prozesses zu erwarten. 2. Blutentnahme und Nüchternblutzucker (FBGL) Bestimmung <ol><li> Jede Gruppe von DM und Kontrolle Fisch muss genug Fische, um genau zu bestimmen, die durchschnittliche FBGL der Gruppe als dieser Test erfordert diese Fische geopfert werden. </li><li> Planen eines markierten PCR-Röhrchen für jede Blutprobe mit 5 ul sterilem normaler Kochsalzlösung. </li><li> Für die Blutentnahme, betäuben Fische wie oben, entfernen Sie das gesamte Wasser, den Fisch auf einem Objektträger und mit einem Skalpell, entfernen Sie den Kopf des Fischesan der Basis des Verschlusses. </li><li> Sammeln das Blut (bis zu 2 ul), die von den Fischen auf den Objektträger freigesetzt wird und schnell fügen Sie es dem 5 ul steriler physiologischer Kochsalzlösung und Abpipettieren um sicherzustellen, dass das Blut nicht verstopfen. Anschließend wird der Probe auf Eis. </li><li> Ermitteln der Blutprobe Volumen durch Messen des Gesamtvolumens der Flüssigkeit (Blut Kochsalzlösung +) und dann Subtrahieren der 5 ul Salzlösung. </li><li> Übertragen 5 ul des verdünnten Blut von jedem PCR-Röhrchen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bestimmen die Blutglukosekonzentration mit dem QuantiChrome Glucose Assay Kit. Dies wird durch folgende Protokoll des Herstellers ohne Ausnahme durchgeführt. Erwartete Ergebnisse: normal / Kontroll-Fische 60 mg / dl und DM Fisch 310 mg / dl. </li></ol> 3. Schwanzflosse Regeneration Studies <ol><li> Anesthetize Fischen im 1,0-1,4 beschrieben. </li><li> Legen Sie den Fisch auf einer Petrischale Deckel und amputieren die Schwanzflosse in einer geraden Linie mit einer sterilen GrößeSkalpell 10 proximal zur ersten lepidotrichia Verzweigungspunkt während des Betrachtens durch die Flosse einem Präpariermikroskop. </li><li> Lassen Sie die Fische als in 1,10 erholen, aber den Fisch bei 33 ° C für die regenerative Wachstumsphase des Assays. Dies ist eine festgelegte Temperatur für eine beschleunigte Regeneration fin-Analyse. </li><li> Die Lamellen können jederzeit Beitrag Amputation abgebildet werden wir jedoch routinemäßig untersuchen die regenerative Wachstum bei 24, 28 und 72 Stunden nach trans-Abschnitt. </li><li> Anesthetize Fisch als zuvor (siehe 1,0-1,4), den Fisch unter einem Binokular mit einer Kamera (wir benutzen eine Nikon SMZ-1500 mit einem Q-Imaging-Kamera ausgestattet) ausgestattet und sammeln Sie alle fin Bilder bei 1X Vergrößerung mit NIS-Elemente-Software . Die Flosse sollte für die Bildgebung verteilt werden, so dass sie vollständig ohne Dehnung oder Beschädigung des Gewebes verlängert und sollte frei von Wassertröpfchen. Aus Gründen der Konsistenz immer den dorsalen Seite nach rechts. </li><li> Drucken Sie Bilder und messen die regenerative growth Bereich mit Image J Software und die Verwendung einer Zeichenblock. Trace um den gesamten Bereich des neuen Wachstums und bestimmen den Bereich. Jede Messung sollte fünf Mal gemacht und gemittelt werden, um die Genauigkeit der Rückverfolgung zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass die Bilder nicht verwendet Schatten oder Wassertröpfchen zu Fehlern, da diese wirken in der Messung des Auswachsens Bereich. </li><li> Messung der Länge des entlang der Amputationsstelle dorsal-ventralen Achse und unterteilen den Bereich in 3,6 durch diese Messung bestimmt. Dies ermöglicht Fische verschiedener Größen, um direkt miteinander verglichen werden. </li></ol> 4. Generation von Metabolic Memory (MM) Zebrafisch <ol><li> Starten Sie eine Gruppe von DM Fische und deren entsprechende Kontrollen, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> 21 Tage bestimmen die FBGL für eine Teilmenge der Gruppe und teilen die DM Fische in 2 Untergruppen. Weiterhin wöchentliche Injektionen STZ für eine der Gruppen als DM Steuerelemente für die Dauer des Experiments. Cease STZ Injektion zur zweiten Gruppe und INCUBATe der Fisch bei normaler Temperatur. Innerhalb von 14 Tagen diese Zebrafisch wird wieder normale Blut Insulin und Glukose Kontrolle durch Pankreas-Regeneration. Diese Fische sind jetzt genannt MM (metabolische Speicher Fisch). </li><li> Am Tag 30 nach Drogen Entfernen amputieren die Schwanzflossen der Kontrolle, DM und MM Fische über die Methode in 3.2 beschrieben. </li><li> Zurück Fisch normales Wasser für fin Regeneration für 30 Tage. Dies ermöglicht das Wachstum dessen, was wir, metabolische Speicher Gewebe. </li><li> Am Tag 60 führen eine zweite Amputation (wie unter 3.2 beschrieben) innerhalb des Gewebes, die in der Zeit von 30-60 Tagen wurde regeneriert und führen Sie die Schwanzflosse Regeneration Assay (3,1-3,7) Abbildung 1. </li><li> Isolieren Gewebe und führen Assay von Interesse. Siehe Tabelle 1 für ein Protokoll Zusammenfassung. </li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diabetes mellitus ist eine Erkrankung des metabolischen Dysregulation, zunächst als Hyperglykämie, die letztlich ergibt Blutgefäß beschädigt, was zu vielen Komplikationen, die alle auch bestehen, nachdem euglycemia obwohl pharmazeutische Intervention erreicht wird diagnostiziert. Diese Persistenz von Komplikationen wird als metabolische Speicher und mehrere aktuelle Studien haben die Rolle, dass epigenetische Mechanismen spielen bei diesem Phänomen untersucht bezeichnet. Hier haben wir ein Protokoll, das für die ...

Diabetes mellitus (DM) ist ein ernstes und zunehmendes gesundheitliches Problem, dass zu einer verringerten Lebenserwartung durch krankheitsspezifische mikrovaskulären (Retinopathie, Nephropathie, Neuropathie, Wundheilungsstörungen) und makrovaskuläre (Herzerkrankungen und Schlaganfall) Komplikationen 1. Einmal ausgelöst, diabetischen Komplikationen weiterhin Fortschritte ununterbrochenen selbst wenn Blutzuckerkontrolle 2,3 erreicht wird und dieses Phänomen wurde metabolischen Speicher oder den Legacy-Effekt bezeichnet. Das Vorhandensein dieses Phänomen wurde klinisch in den frühen 1990er Jahren als &quot;The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)&quot; Fortschritte gemacht und hat seit durch mehrere zusätzliche klinische Studien 4,5,6,7,8,9,10 unterstützt erkannt, 11,12,13,14. Tiermodelle der DM wurden entscheidend für Entdeckungen im Zusammenhang mit der Pathophysiologie der diabetischen Komplikationen und Stoffwechselkrankheiten Speicher. In der Tat war die Persistenz von diabetischen Komplikationen zunächst in einem Hundemodell der diabetischen dokumentiertRetinopathie welche inzwischen von mehreren Linien der experimentelle Nachweis unter Verwendung einer Vielzahl von in-vitro-Kultur-Systeme und Tiermodellen 15,16,17,18,19,20,21 unterstützt. Diese Studien zeigen deutlich, dass eine anfängliche hyperglycemic Zeitraum führt zu einer dauerhaften Anomalien (einschließlich aberrante Genexpression) von Zielorganen / Zellen und mechanistisch das Engagement des Epigenom schlägt. Epigenome bestehen aus allen Chromatinmodifikationen für einen gegebenen Zelltyp und sind verantwortlich für eine Zelle einzigartigen Genexpressionsprofils. Die Chromosomen-Modifikationen sind während der Entwicklung, Unterstützung Zelldifferenzierung dynamisch reagieren auf äußere Reize sind mitotisch stabil vererbt und 22,23 kann in Krankheit 24,25,26 verändert werden. Diese epigenetischen Mechanismen beinhalten: posttranslationalen Histon-Modifikationen, nicht-kanonischen Histon-Variante Aufnahme in octomers, Chromatin Zugang Veränderungen durch DNA-Methylierung und GenAusdruck Kontrolle durch nicht-kodierende micro RNAs 27,28,29,30. Insgesamt epigenetische Prozesse Zellen / Organismen sich schnell an verändernde Reize aus der Umwelt 31,32,33 reagieren können, sondern auch die Fähigkeit verleihen der Zelle zu &quot;merken&quot; diese Begegnungen, sobald der Reiz 23,22 entfernt. Daher wird, wie veränderter Genexpression, die aus Profilen epigenetische Prozesse in Abwesenheit des Signals (s), die sie initiiert sind stabil und werden durch Zellteilung vererbbare, haben sie große Interesse als Basiswert molekularen Mechanismen von menschlichen Erkrankungen einschließlich metabolischen Speichers gewonnen. Die Ergebnisse, die im Kontext von DM und Epigenetik parallel Fortschritte bei anderen Erkrankungen, dass eine Fülle von epigenetischen Veränderungen durch Hyperglykämie induziert verursachen bemerkenswerte Änderungen in persistente Transkriptionsnetzwerke von Zellen (besprochen in 34,35,36,37,38) abzeichnen. Der Zebrafisch ist seit langem ein führender Modellorganismus zur study Entwicklung von Wirbeltieren jedoch in den letzten 15 Jahren ein exponentielles Wachstum bei der Nutzung dieses Organismus für das Studium der menschlichen Krankheit. 39 gesehen. Zebrafisch Modellen menschlicher Erkrankungen wurden eingerichtet überspannt eine Vielzahl menschlicher Erkrankungen einschließlich genetischer Erkrankungen und erworbenen Krankheit 40,41,42. Die vielen Vorteile des Zebrafisch gegenüber anderen Wirbeltieren Modell-Organismen sind die hohe Fruchtbarkeit, kurze Generationszeit, Transparenz durch frühen Erwachsenenalter verringert Wohnkosten und eine Reihe von Werkzeugen für die Gen-Manipulation. Darüber hinaus wurden aufgrund der umfangreichen Erhaltung der genetischen Signalwege und zellulären Physiologie unter den Wirbeltieren und die Fähigkeit, einen hohen Durchsatz Drogen-Screenings durchzuführen, hat der Zebrafisch erfolgreich für pharmazeutische Entdeckung verwendet. Wir haben einen Erwachsenen Zebrafischmodell von Typ I-Diabetes mellitus, welche die diabetogene Droge, Streptozocin entwickelt. Wir haben dieses Modell gekennzeichnet zu zeigen, dass diabetische Zebrafisch nichtt zeigt nur die bekannten menschlichen sekundären Komplikationen, sondern darüber hinaus zeigen beeinträchtigten Extremität Regeneration (Schwanzflosse Regeneration) als Folge der Hyperglykämie Umwelt. Darüber hinaus haben wir berichtet, dass hyperglykämischen Zebrafisch wieder zurück zu normalen Glykämie innerhalb von 2 Wochen Medikament Entfernung aufgrund Regeneration von endogenen Betazellen des Pankreas, was zu einem physiologisch normalen glykämischen Zustand. Jedoch im Gegensatz dazu bleibt Schenkel Regeneration in dieser Fische beeinträchtigt im gleichen Umfang wie in der akuten diabetischen Zustand anzeigt, diese Komplikation auftritt und ist anfällig für metabolische Speicher. Die wichtigsten Impulse für die Erzeugung dieses Modells war es, ein System, um die mitotisch stabile epigenetische Komponenten, die den Stoffwechsel Gedächtnisphänomen unterstützt in der Abwesenheit von dem Hintergrundrauschen des vorherigen hyperglycemic Umgebung zu studieren bieten. Am Abschluß des Protokolls bereitgestellt hier die Zebrafisch oder selektive und Geweben, die durch jeden Assay geeignet ist, der verarbeitet werden kann Forschurchers braucht. Wir haben erfolgreich dieses Verfahren verwendet, um die genomweite anhaltenden Veränderungen in der DNA-Methylierung durch Hyperglykämie induziert, die im Stoffwechsel Speicherzustand 21 beibehalten werden zu identifizieren. Wir glauben, dass diese Zebrafisch Modell vom Typ-I-Diabetes mellitus mehrere innovative Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen für die Prüfung metabolische Gedächtnis hat. 1) Alle unsere Studien in vivo durchgeführt werden und wie das vorherige hyperglycemic Fisch euglycemia zurück durch Regeneration der endogenen Produktion von Insulin, sie benötigen keine exogenen Insulin-Injektionen. Daher vermeidet dies die kompliziert Spitzen und Täler der glykämischen Kontrolle in Tiere, die exogenen Insulins auftreten können. 2) Wie oben, der Hintergrund Stimulation aus der früheren diabetischen Zustand (dh die ständige Präsenz von fortgeschrittener Glykosylierung Endprodukte und reaktiven Sauerstoffspezies-Marker) werden eliminiert beschrieben und deshalb kann man die rein EPIG untersuchenenetic Faktoren des metabolischen Speicher. 3) Die Experimente können schneller durchgeführt werden, da es rund 80 Tage an Diabetes Induktion dauert, bis metabolischen Speicher Untersuchung. 4) Schwanzflosse Regeneration ist experimentell sehr zugänglich und ermöglicht eine einfache genetische und experimentelle Manipulation, für die gibt es eine Vielzahl von Werkzeugen. 5) Schwanzflosse Regeneration bietet eine sehr einfache und quantifizierbare Methode zur metabolischen Speicher beurteilen und daher für zukünftige Wirkstoffentwicklung ermöglichen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Phenoxyethanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpel (Größe 10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> ½ cc Spritze mit 27 1/2 Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome glucose Assaykit. </td><td> Bioassay-Systeme </td><td> DIGL-100 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Nikon </td><td> TMZ-1500 </td><td> Jede Seziermikroskop ist in Ordnung. </td></tr><tr><td> Camera for Imaging </td><td> Nikon </td><td> Q Bildgebung </td><td> Jede Kamera ist geeignet. </td></tr><tr><td> Image J Software </td><td> National Institutes of Health </td><td> NIH Image </td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements </td><td> Nikon </td><td></td><td> Jede Bildbearbeitungssoftware geeignet ist. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

Diabetes mellitus betrifft derzeit 346 Millionen Menschen und wird dies voraussichtlich auf 400 Millionen im Jahr 2030 erhöhen. Evidence from Labor und großangelegte klinische Studien haben gezeigt, dass diabetische Komplikationen Fortschritt über das Phänomen des metabolischen Speicher, selbst wenn die glykämische Kontrolle pharmazeutisch erreicht ungehindert. Genexpression kann stabil durch epigenetischen Veränderungen, die nicht nur ermöglichen Zellen und Organismen, schnell auf sich ändernde Umweltbedingungen Reize reagieren verändert werden, sondern auch die Fähigkeit verleihen der Zelle auf &quot;auswendig&quot; diese stößt, sobald die Impulse entfernt wird. Als solche sind die Rollen, die diese Mechanismen spielen im Stoffwechsel Gedächtnisphänomen derzeit geprüft. Wir haben vor kurzem die Entwicklung eines Zebrafisch-Modell vom Typ-I-Diabetes mellitus berichtet und charakterisiert dieses Modell, dass diabetische Zebrafisch zeigen, zeigen nicht nur die bekannten Folgeerkrankungen einschließlich der Veränderungen verbundenmit diabetischer Retinopathie, diabetischer Nephropathie und Wundheilungsstörungen sondern weisen auch beeinträchtigt Schwanzflosse Regeneration. Dieses Modell ist einzigartig, da die Zebrafisch ist in der Lage, ihre beschädigten Bauchspeicheldrüse zu regenerieren und wieder einen euglykämische Zustand ähnlich zu dem, was nach der Transplantation menschlicher Patienten erwartet werden. Außerdem mehrere Runden der Schwanzflosse Amputation zur Trennung und Untersuchung von reinem epigenetische Effekte in einem in vivo System ohne potentiellen Komplikationsfaktoren vom vorherigen diabetischen Zustand erlauben. Obwohl euglycemia nach Pankreas-Regeneration erreicht wird, bleibt der diabetischen sekundäre Komplikation fin Regeneration und Haut Wundheilung auf unbestimmte Zeit. Im Fall der gestörte Flosse Regenerierung wird diese Pathologie auch nach mehreren Runden der Flosse Regeneration in den Tochterzellen Flosse Gewebe zurückgehalten. Diese Beobachtungen deuten auf eine zugrunde liegende epigenetischer Prozess bestehenden in der metabolischen Speicher Zustand. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden benötigt, um erfolgreich generate die Diabetiker und metabolischen Speicher Gruppen von Fischen und diskutieren die Vorteile dieses Modells.

Typ I Diabetes Zebrafisch zeigen nicht nur die bekannten sekundären Komplikationen der Retinopathie und Nephropathie, aber auch, weisen eine zusätzliche Komplikation: eingeschränkter Schwanzflosse Regeneration. Diese späteren Komplikation besteht aufgrund metabolischer Speicher in Fische, die normale Blutzuckereinstellung restauriert wurden nach einer hyperglycemic Zeitraum. In 2A (Kontrolle) und 2B (metabolische Speicher) repräsentative Bilder der Regeneration Flossen, die bei 72 ...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Metabolic Speicher ist das Phänomen, mit dem diabetischen Komplikationen fortbestehen und Fortschritte ungehinderten auch nach euglycemia pharmazeutisch erreicht. Hier beschreiben wir eine Diabetes mellitus Zebrafisch Modell, das einzigartig ist, dass es ermöglicht die Prüfung der mitotisch übertragbare epigenetische Komponenten des metabolischen Speicher<em&gt; In vivo</em&gt;.

Ein Zebrafisch Modell des Diabetes mellitus und Stoffwechselkrankheiten Speicher

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

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Research

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Medicine

25.5K Aufrufe.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Metabolic Speicher ist das Phänomen, mit dem diabetischen Komplikationen fortbestehen und Fortschritte ungehinderten auch nach euglycemia pharmazeutisch erreicht. Hier beschreiben wir eine Diabetes mellitus Zebrafisch Modell, das einzigartig ist, dass es ermöglicht die Prüfung der mitotisch übertragbare epigenetische Komponenten des metabolischen Speicher In vivo.

Serie: A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Forschung

Medizin

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

Ein Modell der chronischen Nährstoff Infusion in der Ratte

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von<em&gt; Wnt5a</em&gt; Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Chirurgische Verletzung des Maus-Pankreas durch Ligatur des Pankreasganges als Modell für endokrine und exokrine Reprogrammierung und Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Eisenchlorid-induzierte Thrombose Mausmodell für Halsschlagader und Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Dissektion der Maus Bauchspeicheldrüse für histologische Analyse und Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Körperzusammensetzung und festsetzende Stoffwechselanalyse bei hohen Fett Fed Mäusen

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.