עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של קרן משפחת איאקוקה, רוזלינד פרנקלין האוניברסיטה הזנק כספים, והמכונים הלאומיים לבריאות גרנט DK092721 הלאומי (לRVI). המחברים מבקשים להודות לניקי Intine לסיוע בהכנת כתב יד.

כל ההליכים מתבצעים בעקבות ההנחיות המתוארות ב&quot; עקרונות טיפול בבעלי חי מעבדה &quot;(המכונים הלאומיים לבריאות אין פרסום. 85-23, מתוקן 1985) והטיפוח אושר רוזלינד פרנקלין האוניברסיטה המוסדי בעלי החיים והשתמשו ועדת חית פרוטוקול 08-19. יש 2 קיצורים חשובים המשמשים בכתב היד הזה. 1) DM: מתייחס לדגים שנמצאים באקוטית (300 מ&quot;ג / ד&quot;ל) מדינת hyperglycemic והיו לפחות 3 שבועות. 2) MM: מתייחס לדגים שהיו 21 יום (ראה פרוטוקול) דגי DM ואפשרו לשחזר שליטה הגליקמית באמצעות התחדשות לבלב. זו מושגת בתוך (14) ימים של הסרת תרופה. הדגים נחשבים דגי MM מנקודה זו ואילך. כמו כן, חשוב לציין כי דגים המכונים שליטת מטופלים באופן זהה כדגי DM או MM במונחים של מספר הזריקות (מלח בלבד), זמני הדגירה בטמפרטורות השונות ואת המספר ועיתויקטיעות סנפיר זנב. 1. דור של דג זברה עם סוכרת, דגי DM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הן התאוששות ומכלי מי הרדמה. מים הם מי שחזור דגים נורמלים. למי הרדמה להוסיף מספיק 2-phenoxyethanol כך ש1:1,000 דילול במי דגים רגילים מושג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון 0.3% (במנדף) של streptozocin (STZ) על ידי הוספת 6 מ&quot;ג של STZ עד 2 מ&quot;ל של 0.09% נתרן כלורי ולהציב את הפתרון באופן מיידי על קרח. זה יספק פתרון הזרקה דיו להזרקה של כ 20 דגים ב20 דקות. אם תחרוג הסימן 20 דקות, לעצור, ולהפוך את פתרון STZ טרי לפני שתמשיך. בפתרון צינור נפרד aliquot מספיק מלח לדגי שליטה. ברגע שהוא STZ solubilized כל השלבים הבאים אינם דורשים שימוש במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק סמ&quot;ק ½ המצויד במחט 27 1/2 מד עם פתרוני STZ או שליטה להבטיח כי אין בועות אוויר כלואות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Anesthetize כל דג בנפרד על ידי נחת הדג במי הרדמה, ולחכות עד שתנועת השחייה שלהם מפסיקה (1-2 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן קצר הרדים למקם את הדגים במגבת נייר כדי לספוג את עודפי מים, הנח את הדג במשקל סירה ולמדוד את המסה של הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הדגים על משטח יציב (מכסת צלחת פטרי) להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרון שליטה STZ או לתוך חלל הצפק של הדגים על ידי החדרת מחט עבר פוע להיבט האחורי של הצפק הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.35 מ&quot;ג / g צריך להיות מועבר (350 מ&quot;ג / ק&quot;ג) של STZ לכל דג והנפח של 0.3% נדרש הפתרון יכול להיות מחושב באופן הבא. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל המוני של דגים (ז) ב -0.35 להניב כמות STZ במ&quot;ג הנדרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלק את המוצר שנוצר על ידי מעל 3 להניב הנפח של פתרון 0.3% נדרש הזרקה בμl. לדוגמה: לדגים 0.5 גרם:) 0.5 x 0.35 = 0.175 ב) .0175 / 3 = 0,058 מ&quot;ל= 58 μl. אותו הנפח ללא STZ הייתי להיות מוזרק לדגי שליטה. גיליון לכרכים להזריק למסת דג צריך להיות שנוצר ומשמש להתייחסות מהירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזריקה הבאה למקם את הדגים במכל מי ההתאוששות ולפקח עליהם לפעילות שחייה רגילה. ברגע שזה הושג הדגים מועברים למכל חיים נורמלי שנשמר בטווח הטמפרטורות המופחתת של 22 ° C - 24 ° C. טמפרטורה מופחתת זו היא קריטית עבור אינדוקציה יעילה של היפרגליקמיה (סוכרת, DM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות היפרגליקמיה מזוהית בתוך 24 שעות מהזריקה הראשונה, כדי לגרום למצב ממושך של היפרגליקמיה גבוהה מאוד דג הזברה דורש שלב אינדוקצית הזרקה תכופה אחרי זריקות תחזוקה שבועיות, כמוצג להלן. </li></ol> שבוע 1: 3 זריקות (יום 1, 3, 5), שבוע 2: הזרקה 1 (יום 12), שבוע 3: זריקה 1 (יום 19), שבוע 4: (יום 21) בצעבדיקה של עניין. בשלב זה דג הזברה נחשב להיה במצב ממושך של היפרגליקמיה ולהציג את סיבוכי הסוכרת של רטינופתיה, נפרופתיה והתחדשות סנפיר גם נפגעה. אלה מכונים כמו דגי DM. בנוסף אם רוצה את הדג יכול להישמר במצב hyperglycemic עם זריקות תחזוקה שבועיות. כ 5% מוות במהלך תהליך זה צריך להיות צפוי. 2. איסוף דם ורמת הגלוקוז בדם בצום (FBGL) קביעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל קבוצה של דגי DM ובקרה חייבת לכלול מספיק דגים לקבוע במדויק FBGL הממוצע של הקבוצה כassay זה מחייב את הדגים כדי להיות קורבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צינור PCR מתויג לכל דגימת דם המכילה 5 μl של תמיסת מלח הרגיל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאיסוף דם, להרדים דגים כאמורים לעיל, להסיר את כל המים, הנח את הדג בשקופית מיקרוסקופ ובאמצעות אזמל, הסר את הראש של הדגבבסיס operculum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הדם (עד 2 μl) כי הוא שוחרר מהדגים לשקופית ולהוסיף אותו במהירות ל5 μl של תמיסת מלח הרגיל סטרילי pipetting למעלה ולמטה כדי לוודא שהדם לא סותם. מייד למקם את המדגם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את נפח דם מדגם על ידי מדידת הנפח הכולל של הנוזל (תמיסת המלח + דם) ולאחר מכן את ההפחתה 5 μl של תמיסת מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 μl של הדם המדולל מכל צינור PCR לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microfuge ולקבוע את ריכוז הסוכר בדם באמצעות ערכת Assay גלוקוז QuantiChrome. זה מבוצע על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן ללא יוצא מן הכלל. תוצאות צפויות: דגים רגילים / שליטת 60 מ&quot;ג / ד&quot;ל ודגי 310 DM מ&quot;ג / ד&quot;ל. </li></ol> 3. זנב סנפיר מחקרי התחדשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם דגים כמתואר ב1.0-1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג מניח על מכסה צלחת הפטר ולקטוע סנפיר הזנב בקו ישר באמצעות גודל סטרילי10 אזמל הפרוקסימלי לנקודת הסתעפות lepidotrichia הראשונה תוך צפיית הסנפיר באמצעות מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר דגים להתאושש כמו ב1.10 אבל למקם את הדגים על 33 מעלות צלזיוס במשך שלב צמיחת המשובים של assay. זו טמפרטורה שהוקמה לניתוח סנפיר התחדשות מואץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסנפירים ניתן הדמיה בכל קטיעת הודעת זמן זאת אנו שגרתי לבחון את צמיחת רגנרטיבית ב24, 28 ו 72 שעות לאחר סעיף טראנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם דגים כמו קודם (ראה 1.0-1.4), הצב את הדגים תחת מיקרוסקופ לנתח מצוידים במצלמה (אנו משתמשים בניקון SMZ-1500 מצוידים במצלמה ש-הדמיה) ולאסוף את כל התמונות בהגדלת סנפיר 1X עם תוכנת אלמנטי ש&quot;ח . הסנפיר צריך להתפשט להדמיה כך שהוא הוארך באופן מלא ללא מתיחה או לפגוע ברקמה וצריך להיות חופשי מכל טיפי מים. לעקביות תמיד שם בצד הגבה מהימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפסת תמונות ולמדוד את משובי groאזור wth באמצעות תוכנת J תמונה ושימוש במשטח ציור. עקוב הקיף את כל השטח של צמיחה חדשה ולקבוע את האזור. כל מדידה צריכה להיעשות חמש פעמים ועמדו בממוצע על מנת להבטיח דיוק העקיבה. חשוב שהתמונות ששמשו אין לי צללים או טיפי מים כמו אלה תורמים לטעויות במדידת שטח התולדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אורכו של אתר הקטיעה לאורך הציר הגבה-הגחון ולחלק את השטח שנקבע ב3.6 על ידי מדידה זו. זה מאפשר דגים בגדלים שונים להשוואה ישירה. </li></ol> 4. דור של זיכרון מטבולים (MM) דג זברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום קבוצה של דגי DM והבקרה הנאותה שלהם כמפורט בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 21 ימים לקבוע את FBGL לקבוצת משנה של הקבוצה ולחלק את דגי DM ל 2 קבוצות. המשך STZ זריקות שבועיות לאחת מהקבוצות כפקדי DM, במשך תקופת הניסוי. להפסיק הזרקת STZ לקבוצה וincubat 2דואר הדגים בטמפרטורה נורמלית. תוך 14 ימי דג זברה אלה יהיה לשחזר אינסולין בדם נורמלי ושליטה באמצעות התחדשות הלבלב גלוקוז. דגים אלה נקראים עכשיו MM (דגי זיכרון מטבולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הסרת תרופת הודעה 30 לקטוע את סנפירי הזנב של שליטה, DM וMM דגים באמצעות שיטה המתוארת ב3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר דגים לתנאי מים רגילים להתחדשות סנפיר במשך 30 ימים. זה מאפשר צמיחה של מה שאנו מכנים רקמות, חילוף חומרי זיכרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב60 יום לבצע קטיעה שנייה (כמתואר ב3.2) בתוך הרקמה שיוצרת מחדש בתקופה מ30-60 ימים ולבצע את assay זנב סנפיר ההתחדשות (3.1-3.7) איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד את הרקמות ולבצע בדיקה של עניין. ראה בטבלת 1 סיכום פרוטוקול. </li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

סוכרת היא מחלה של חוסר ויסות חילוף חומרים, אובחנה בתחילה כיפרגליקמיה, שסופו של דבר גורמת לניזק כלי דם שמוביל לסיבוכים רבים שנמשכים גם לאחר כל euglycemia המושגת למרות התערבות תרופות. התמדה זה של סיבוכים המכונית זיכרון מטבולים וכמה מחקרים שנערכו לאחרונה בחנו את התפקיד שמנג...

סוכרת (DM) היא בעיה בריאותית רצינית, וצמיחתו, שגורם לקיצור תוחלת חיים בשל כלי דם מחלה ספציפיים (רטינופתיה, נפרופתיה, נוירופתיה ריפוי, ליקוי פצע) וmacrovascular (מחלות לב ושבץ) סיבוכים 1. סיבוכי סוכרת, ברגע שיזמו ממשיכים להתקדם ללא הפרעה גם כאשר שליטה הגליקמית מושגת 2,3 ותופעה זו זכתה לכינוי זיכרון מטבולים או השפעת המורשת. נוכחותה של תופעה זו הוכרה קלינית בתחילת 1990 כ&quot; לשלוט בסוכרת וסיבוכי המשפט (DCCT) &quot;התקדם ומאז כבר נתמך על ידי ניסויים קליניים נוספים מרובים 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. מודלים של בעלי חיים של DM היו קריטיים לתגליות הקשורים לפיזיולוגית פתים-של סיבוכי סוכרת וזיכרון מטבולים. למעשה, ההתמדה של סיבוכי סוכרת תועדה לראשונה במודל של כלבים סוכרתייםרטינופתיה שמאז נתמכת על ידי מספר קווים של ראיות ניסיוניות תוך שימוש במגוון מערכות בתרבות מבחנה ומודלים של בעלי חי 15,16,17,18,19,20,21. מחקרים אלו מראים בבירור כי תוצאות תקופת hyperglycemic ראשוניות בהפרעות קבע (כולל ביטוי גנים חריג) של איברי המטרה / תאים ומכאניים מרמזות על המעורבות של epigenome. Epigenomes כולל את כל השינויים שהכרומטין לסוג תא נתון והם אחראים לפרופיל ביטוי הגנים הייחודיים של תא. שינויי כרומוזום הם דינמיים במהלך התפתחות, התמיינות תאי תמיכה, מגיבים לגירויים חיצוניים, mitotically עוברים בירושה ביציבות 22,23 וניתן לשנות במחלה 24,25,26. מנגנוני epigenetic אלה כוללים: לפרסם שינויי translational היסטון, הכללת גרסת היסטון הלא קנוניה בoctomers, שינויי גישת הכרומטין באמצעות מתילציה DNA, וגניםביטוי שליטה באמצעות קידוד הלא RNAs מייקר 27,28,29,30. בסך הכל, תהליכי epigenetic לאפשר לתאים / אורגניזמים כדי להגיב במהירות לשינויים בגירויים סביבתיים 31,32,33, הם גם העניקו לו את היכולת לתא כדי &quot;לזכור&quot; מפגשים אלו פעם הגירוי מוסר 23,22. לכן, כמו פרופילי ביטוי גנים שעברו שינוי כתוצאה מתהליכי epigenetic הם יציבים בהיעדר האות (הים) שיזם אותם והם תורשתיים באמצעות חלוקת תא, שהם צברו עניין רב כבסיס מנגנונים מולקולריים של מחלות אנושיות, כולל זיכרון מטבולים. את התוצאות כי הם מתעוררים בהקשר של DM ואפיגנטיקה התקדמות מקבילה במחלות אחרות שבשפע של שינויים הנגרמים על ידי epigenetic היפרגליקמיה גורם לשינויים קבועים מדהימים ברשתות תעתיק של תאים (שנסקר ב34,35,36,37,38). דג הזברה כבר זמן רב אורגניזם מודל מוביל לסטופיתוח חוליות dy זאת 15 השנים האחרונות ראה צמיחה המעריכית בניצול אורגניזם זה למחקר של מחלות אנושיות. 39. מודלים של מחלות אנושיות דג זברה כבר הוקמו פורשים מגוון רחב של פתולוגיות אדם כולל הפרעות גנטיות ומחלות נרכשות 40,41,42. את היתרונות הרבים של דג הזברה על אורגניזמים מודל חוליות אחרים כוללים פוריות גבוהה, זמן דור קצר, שקיפות דרך הבגרות מוקדמת, צומצמו הוצאות שכר דירה ומערך של כלים למניפולציה גנטית. יתר על כן, בשל השימור הנרחב של מסלולים גנטיים ופיזיולוגיה סלולרית בקרב בעלי החוליות והיכולת לבצע הקרנות סמי קצב העברת נתונים גבוהות, דג הזברה שמש בהצלחה לגילוי תרופות. פתחנו מודל דג זברה בוגר בסוכרת מסוג I המשתמשת בסמי diabetogenic, streptozocin. יש לנו מאופיין במודל זה כדי להראות שדג זברה סוכרתי לאלא להציג רק את הסיבוכים משניים האדם הידועים, אך בנוסף, הם מציגים החייאת איברים לקויה (התחדשות סנפיר זנב) כתוצאה מסביבת hyperglycemic. בנוסף, יש לנו דיווח שדג זברת hyperglycemic לחזור glycemia הנורמלי בתוך 2 שבועות של הסרת תרופה בשל התחדשות של תאים בטאו בלבלב וכתוצאה מכך אנדוגניים מדינת גליקמי פיסיולוגי נורמלית. עם זאת, בניגוד לכך, החייאת איברים בדגים אלה נותרת לקויים באותה המידה כמו במצב הסוכרתי החריף המציין סיבוך זה נמשך והוא רגיש לזיכרון מטבולים. הדחיפה העיקרית ליצירת מודל זה הייתה לספק מערכת כדי ללמוד את מרכיבי mitotically היציבים epigenetic התומכים בתופעת הזיכרון מהטבולים בהעדר רעש רקע סביבת hyperglycemic הקודמת. בסיומו של הפרוטוקול המסופק כאן את רקמות דג הזברה וסלקטיבית או יכולות להיות מעובד על ידי כל בדיקה מתאימה לresearchers צריך. אנחנו השתמשנו בהצלחה בהליך זה כדי לזהות את שינויי הגנום המתמשכים במתילציה DNA הנגרמים על ידי היפרגליקמיה שנשמרים בזיכרון מטבולי המדינה 21. אנו חשים כי מודל דג זברה זה מסוג שהסוכרת יש מספר יתרונות על פני מערכות חדשניים מודל אחרות לבחינת זיכרון מטבולים. 1) כל המחקרים שלנו יכול להתנהל בvivo וכדגי hyperglycemic הקודמים לחזור לeuglycemia דרך התחדשות של ייצור האינסולין אנדוגני, הם אינם דורשים הזרקת אינסולין חיצונית. לכן, זה ימנע את הקוצים המסבכים ועמקים בשליטה הגליקמית שעלולות להתרחש בבעלי החיים הזקוקים לאינסולין אקסוגני. 2) כפי שתואר לעיל, גירוי הרקע מהמצב הסוכרתי הקודם (כלומר המשך נוכחותם של מוצרים סופיים glycation המתקדם וסמני מיני חמצן תגובתי) בוטל ולכן ניתן לבחון טהור epigגורמי enetic של זיכרון מטבולים. 3) הניסויים יכולים להתבצע במהירות כפי שהוא לוקח כ 80 ימים מאינדוקצית סוכרת עד בדיקת זיכרון מטבולים. 4) התחדשות סנפיר זנב היא ניסוי מאוד נגישה ומאפשרת מניפולציה גנטית וניסיונית קלה עבורה יש מגוון רחב של כלים. 5) התחדשות סנפיר זנב מספקת שיטה פשוטה מאוד וכמותיים להערכת זיכרון מטבולים, ולכן יאפשר לגילוי סמים בעתיד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2 phenoxyethanol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> אזמל (גודל 10) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> ½ מזרק סמ&quot;ק, עם מחט מד 27 1/2 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome glucערכת בדיקת OSE. </td><td> מערכות מבדק </td><td> DIGL-100 </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד הנתרן </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> TMZ-1500 </td><td> כל מיקרוסקופ לנתח הוא בסדר גמור. </td></tr><tr><td> מצלמה להדמיה </td><td> ניקון </td><td> Q הדמיה </td><td> כל המצלמה מתאימה. </td></tr><tr><td> תמונת J תוכנה </td><td> המכונים הלאומיים לבריאות </td><td> NIH תמונה </td><td></td></tr><tr><td> אלמנטי ש&quot;ח </td><td> ניקון </td><td></td><td> כל תוכנת ההדמיה מתאימה. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

הסוכרת משפיעה כיום 346,000,000 אנשים וזה צפוי להגדיל עד 400 מ&#39;עד 2030. ראיות מהמעבדה והן בניסויים קליניים בקנה מידה גדולים גילו כי התקדמות סיבוכי סוכרת ללא הפרעה דרך התופעה של זיכרון מהטבולים גם כאשר שליטה הגליקמית מושגת pharmaceutically. ביטוי גנים יכול להשתנות ביציבות באמצעות שינויי epigenetic שלא רק מאפשרים לתאים ואורגניזמים כדי להגיב במהירות לשינויים בגירויים סביבתיים, אלא גם העניק לו את היכולת של התא כדי &quot;לזכור&quot; מפגשים אלו פעם הגירוי מוסר. ככזה, את התפקידים שמנגנונים אלה לשחק בתופעת הזיכרון מהטבולים כעת, נבדקים. יש לנו דיווח לאחרונה הפיתוח של מודל דג זברה מסוג אני סוכרת ומאופיינת במודל זה כדי להראות שדג זברה הסוכרתי להציג את הסיבוכים מהשניים הידועים, כולל שינויים הקשורים לא רקעם רטינופתיה סוכרתית, נפרופתיה סוכרתית וריפוי פצעים לקוי אלא גם תערוכת התחדשות סנפיר זנב נפגע. מודל זה הוא ייחודי בכך שדג הזברה הוא מסוגל להתחדש הלבלב הפגוע שלה ולשקם את מדינת euglycemic דומה למה שניתן היה לצפות בחולים אנושיים שלאחר ההשתלה. יתר על כן, סבבים רבים של קטיעת סנפיר זנב לאפשר הפרדה ומחקר על השפעות epigenetic טהורות במערכת vivo ללא גורמי סיבוך פוטנציאליים מהמצב הסוכרתי הקודם. למרות euglycemia מושגת בעקבות התחדשות לבלב, הסיבוך מהשני של התחדשות הסוכרתית סנפיר וריפוי פצעי עור נמשך ללא הגבלה זמן. במקרה של התחדשות סנפיר לקויה, פתולוגיה זו נשמרה גם לאחר סבבים רבים של התחדשות סנפיר ברקמות הסנפיר בת. תצפיות אלו מצביעות על תהליך epigenetic בסיסי הקיים במדינת הזיכרון מהטבולים. כאן אנו מציגים את השיטות הדרושות להצלחת genקרוא את קבוצות זכרון סוכרת וחילוף חומרים של דגים ולדון ביתרונות של מודל זה.

הקלד דג זברה סוכרתי לא רק להציג את הסיבוכים משניים הידועים של רטינופתיה ונפרופתיה, אלא גם, מפגין סיבוך נוסף: התחדשות סנפיר זנב לקויה. סיבוך מאוחר יותר זה נמשך בשל זיכרון מטבולים בדגים ששוחזרו בקרת סוכר נורמלית לאחר תקופת hyperglycemic. באיור 2 א (שליטה) והתרשים 2...

Watch this Scientific Journal Video about A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory at JoVE.com

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

זכרון מטבולית הוא התופעה שמתרחשת סיבוכי סוכרת להתמיד ולהתקדם ללא הפרעה גם לאחר euglycemia מושגת pharmaceutically. כאן אנו מתארים מודל סוכרת דג זברה שהוא ייחודי בכך שהיא מאפשרת בדיקה של רכיבי epigenetic mitotically המסירים של זיכרון מטבולים<em&gt; In vivo</em&gt;.

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

a-zebrafish-model-of-diabetes-mellitus-and-metabolic-memory

Research

JoVE Journal

Medicine

25.6K Views.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. זכרון מטבולית הוא התופעה שמתרחשת סיבוכי סוכרת להתמיד ולהתקדם ללא הפרעה גם לאחר euglycemia מושגת pharmaceutically. כאן אנו מתארים מודל סוכרת דג זברה שהוא ייחודי בכך שהיא מאפשרת בדיקה של רכיבי epigenetic mitotically המסירים של זיכרון מטבולים In vivo.

Video: A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

דגם של עירוי מזין כרוני בחולדה

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

פגיעה כירורגית ללבלב העכבר באמצעות קשירת של צינור הלבלב כמודל להאנדוקרינית ואקסוקרינית תכנות מחדש והפצה

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

פקקת עכבר דגם על עורק ראשי וכלי לפדר מושרה כלוריד Ferric

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

דיסקציה של הלבלב העכבר עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

הרכב הגוף וניתוח מטבולית שכולאת בעכברים פד שומן גבוה

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.