This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.

Etiquetar los recipientes que se utilizan para el almacenamiento de los músculos con identificadores apropiados para el animal y el músculo cosechado. Pre-enfriar las bolsas / contenedores e instrumentos para prevenir la congelación / descongelación del tejido cuando se agrega. 1. Consideraciones Estudio de diseño técnico de Muscle Tissue Collection <ol><li> Para los pequeños modelos animales (murinos) de la enfermedad muscular, utilizan un músculo entero para el estudio, ya que los modelos animales pequeños a menudo requieren evaluación de un músculo entero para proporcionar muestras miofibra suficiente para estudios patológicos. Para grandes animales (caninos) los modelos de enfermedad muscular, utilizan porciones musculares que son al menos 0.3 x 0.3 cm o más en la transversal (transversal) de aspecto. NOTA: biopsias de núcleo también se pueden utilizar, pero puede ser subóptima para estudios de caracterización primarios debido a problemas de muestreo. </li><li> Para estudios que envuelve el sarcómero, la medición ultraestructural de la longitud del sarcómero puede comprender un punto final crítico y puede require especializada manipulación. Esto es por lo general sólo es relevante en enfermedades en las que los elementos de las longitudes de sarcómero muestran inadecuadas, como en algunas de las causas de miopatía nemalínica. Algunos laboratorios prefieren para fijar el músculo en su estado sin contracción o estirado, en lugar de realizar estas mediciones en el músculo no tensado o no estirado. <ol><li> Si no se medirá la longitud del sarcómero, fijar el tejido muscular sin pre-estiramiento del músculo al colocar directamente en el fijador EM deseada (véase Reactivos). </li><li> Si se miden las longitudes del sarcómero, varias técnicas de pre-estirar el músculo (ver Discusión) se pueden usar: <ol><li> Utilice un dispositivo de sujeción para mantener el músculo en su tensión de reposo mientras está todavía en el animal, extirpar el músculo alrededor de la parte exterior de la pinza y colocarla directamente en el fijador EM deseada (ver Reactivos). </li><li> Estirar y el pin el músculo a una superficie (tal como una pieza de corcho) a una longitud similar a la observada <em&gt; in vivo después de que se ha extraído del animal. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sub-dividir el músculo esquelético aislado en fragmentos que son apropiados para los estudios deseados (Figura 1) <ol><li> Para la histología muscular congeladas: <ol><li> Incluya la mayor cantidad de un determinado músculo como sea posible para minimizar el sesgo de muestreo (véase el paso 1.1), pero los especímenes deben ser &lt;1,5 cm para evitar la congelación de los artefactos. </li><li> Tratar a todos los músculos del mismo estudio similar para evitar diferencias de artefactos de tamaño de la fibra debido a diferencias en el manejo. </li></ol></li><li> Para la microscopía electrónica (EM): <ol><li> Corte un ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm tira de músculo de la muestra, con el eje longitudinal de la muestra paralela al eje longitudinal de la original del músculo. NOTA: El fijador no penetrará adecuadamente piezas más gruesas de tejido, por lo que el mantenimiento de espesor de la muestra a 2 mm o menos es crucial en la obtención de resultados adecuados. Además,como la orientación de tales pequeños fragmentos de músculo es a menudo difícil, es aconsejable el uso de un fragmento de tejido que imita la orientación real del músculo (es decir, el aspecto más largo de la muestra fijada es la orientación longitudinal de las miofibras musculares /) a minimizar la manipulación y la confusión durante el procesamiento EM. </li></ol></li><li> Para el cultivo de células: <ol><li> El rendimiento celular deseada puede afectar a la cantidad de músculo requiere para el establecimiento de cultivo celular. Músculos individuales (o partes de los músculos) de los animales pequeños pueden proporcionar el número de células suficientes para establecer los cultivos celulares, por lo que si es necesario, el tejido de la piscina de varios músculos. </li></ol></li></ol> 3. Fijación de Tejidos y Procesamiento de Microscopía Electrónica (EM) <ol><li> Coloque un fragmento de músculo no mayor de 2 mm en su dimensión más delgada directamente en el fijador EM deseada (véase Reactivos). </li><li> Coloque el músculo en tampón fijador EM (ver Reactivos) después de 2-48 h de FIJACIÓNen. Fijación prolongada (semanas o meses) puede dar como resultado la pérdida de detalle ultraestructural en los estudios de EM. </li><li> Enviar a un centro núcleo EM para su procesamiento. </li></ol> 4. Congelación del músculo por histológico, bioquímico y Estudios Moleculares <ol><li> Eliminar el exceso de humedad en la muestra mediante secado a fondo la muestra con una toalla de papel hasta que el tejido es ligeramente adherente a la toalla. La humedad excesiva producirá artefactos de congelación significativos en el músculo. NOTA: tejido puede secarse adicionalmente haciéndola rodar en el polvo de bebé. Este paso no es generalmente necesario para los músculos a menos que hayan estado en un ambiente excesivamente húmedo. </li><li> Coloque (OCT o un adhesivo similar tal como goma tragacanto) en la parte inferior de un criomolde poco profunda o en el corcho, con sólo lo suficiente OCT para proporcionar una base para el músculo orientado (Figura 2C). Etiquetado del corcho o criomolde antes de la congelación puede ser útil para el seguimiento de la muestra. </li><li> Carefully colocar el músculo en el molde en la orientación deseada, con la mayoría del músculo que sobresale de los PTU para que el músculo en sección no está en contacto por OCT (Figura 2C). </li><li> Añadir isopentano a una taza de metal hasta que se alcanza una profundidad de aproximadamente 3-4 cm. </li><li> Póngase los guantes de seguridad térmica y retire la tapa de Dewar. </li><li> Coloque o sostener la taza de metal en contacto con el nitrógeno líquido, de modo que el nivel de nitrógeno líquido en la parte exterior de la copa está por encima del nivel de la isopentano en el interior de la copa. Estrategias para organizar estos contenedores se muestran en la Figura 2. <ol><li> No permita que el nitrógeno líquido para entrar en la copa de metal, ya que produce una espuma burbujeante que puede ser incómodo para trabajar con (y también es lo suficientemente frío para congelar). </li></ol></li><li> Observe el isopentano para determinar cuando se ha alcanzado la temperatura apropiada. A la temperatura apropiada (de manera óptima entre -140 a -149 ° C), por lotapa blancos guijarros de isopentano congelado formarán (después de unos minutos, y después de la niebla inicial ha desaparecido por encima del isopentano) en el fondo de la taza, o la solución generalmente espese a la consistencia de la melaza. Congelar antes de esta etapa producirá atifacts congelación. <ol><li> Si el isopentano se congela completamente sólida, descongelar y enfriar a temperaturas bajo cero de nuevo antes de su uso posterior. </li></ol></li><li> Con unas pinzas previamente refrigeradas, baje el espécimen y corcho / molde en el isopentano durante aproximadamente 10-20 segundos. </li><li> Coloque la muestra congelada en un recipiente previamente enfriado. </li><li> Mantenga la muestra y el recipiente con hielo seco en todo momento hasta la transferencia a un -80 ° C congelador. </li></ol> 5. Si Artefacto congelación es presente en el tejido ya congelados, es posible mejorar el grado de artefactos de congelación utilizando la siguiente &quot;Descongelar y Volver a congelar&quot; Procedimiento <ol><li> Tome bloques del congelador, uno a la vezY mantenerlos en hielo seco. El calendario de este protocolo es fundamental. Sólo descongelar y volver a congelar un bloque a la vez. </li><li> Mueva la muestra de hielo seco a temperatura ambiente. </li><li> Si la muestra se embebió en OCT, eliminar los PTU que rodea lo más completamente posible el uso de un bisturí. </li><li> Permitir que la muestra se descongele a temperatura ambiente hasta el punto de que esté completamente descongelado, pero no hasta el punto en el que se está secando. <ol><li> Prod suavemente la muestra con un fórceps para asegurar que la muestra está completamente descongelado antes de pasar al siguiente paso. </li></ol></li><li> Congelar el músculo como se especifica en los pasos 4.1 a 4.10. </li></ol> 6. Preparación de Muscle for Testing Funcional Skinned fibra del solo <ol><li> El procedimiento de almacenamiento para el músculo depende de cuando el músculo / fibra está siendo utilizado para los experimentos. <ol><li> Para su uso en unas pocas semanas, colocar el músculo en una solución de 50% glycerol/50% de solución de relax (ver Reactivos), y se almacena a -20 ° C. </li><li> Para el uso de popaer un par de semanas, colocar el músculo en una solución de 75% glycerol/25% de solución de relax (ver Reactivos), y se almacena a -80 ° C. </li><li> Por otra parte, dejar que el músculo seco, pines para el corcho, y almacenarlos en gránulos de sílice a -80 ° C. Estos músculos deshidratados se pueden usar para año. </li></ol></li></ol> 7. Preparación de músculo fresco para el Transporte de cultivo celular a laboratorios externos Protocolos para el establecimiento de cultivos de células han sido bien descrito en otros lugares 4-7. <ol><li> Llenar un tubo cónico estéril de 50 ml con medio de crecimiento completo estéril. </li><li> Añadir el tejido muscular al tubo utilizando unas pinzas esterilizadas, sumergiendo completamente el tejido en los medios de comunicación. <ol><li> Llenar el resto del tubo con medios para prevenir el secado durante el envío. </li></ol></li><li> Añadir compresas de hielo en la caja de espuma de poliestireno y colocar el tubo cónico cerca de varias bolsas de hielo. <ol><li> Tenga en cuenta que sólo los paquetes de hielo (y no de hielo seco) se debe utilizarpara evitar daños por congelamiento del líquido y el tejido. </li></ol></li><li> Los paquetes se envían O / N, pero los tejidos pueden durar 2 días en estas condiciones. </li></ol>

<ol>
	<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+replacement+therapy+rescues+weakness+and+improves+muscle+pathology+in+mice+with+X-linked+myotubular+myopathy.">Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy.</a> Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).</li><li>Talmadge, R. J., Roy, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+separation+of+rat+skeletal+muscle+myosin+heavy-chain+isoforms.">Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms.</a> J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).</li><li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+properties+of+pure+populations+of+human+dystrophic+muscle+cells.">Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells.</a> Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubularin-deficient+myoblasts+display+increased+apoptosis,+delayed+proliferation,+and+poor+cell+engraftment.">Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment.</a> Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).</li><li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells.">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li><li>Webster, C., Blau, H. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+tropomyosin+3+(TPM3)+are+common+and+associated+with+type+1+myofiber+hypotrophy+in+congenital+fiber+type+disproportion.">Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion.</a> Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El músculo esquelético es un tejido estructural y funcionalmente único, y procedimientos especializados de preparación son necesarios para poder realizar una evaluación óptima de los parámetros estructurales y funcionales. Aunque una variedad de tejidos se congelan comúnmente para estudios patológicos en contextos clínicos y de investigación, los protocolos de congelación de los tejidos no musculares generalmente implican la inmersión total del tejido en octubre antes de la congelación. Como se muestra en la Figura 3, un protocolo de este tipo no es adecuado para la evaluación patológica de los músculos esqueléticos y sin embargo es lo suficientemente similar al protocolo descrito aquí que se trata de un error de comúnmente encontrado. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo sencillo para el manejo adecuado de los músculos para evitar problemas como éste. Consejos También se ha recopilado en el manejo adecuado de los músculos para fisiológica fuera de sitio y los estudios celulares, en un esfuerzo para facilitar la adquisición de datos de alta calidad en los laboratorios centrales del exterior en los casos where los estudios in situ no son preferibles o posible. Como se señala en este protocolo, los elementos que son absolutamente esenciales en el procesamiento adecuado de músculo para estudios patológicos incluyen minimizar el contenido de agua del tejido, la disminución de la temperatura a la que se congela el músculo, y el aumento de la velocidad a la que se logra la congelación. El exceso de humedad en el tejido o la lentitud excesiva del proceso de congelación (producido por temperaturas insuficientes o por la falta de contacto directo entre el agente de congelación y el tejido, como se encuentra con nitrógeno líquido) dará lugar a la congelación de los artefactos que pueden afectar el análisis patológico. Como PTU dispone una fuente adicional de la humedad del tejido, muchos laboratorios utilizan otros adhesivos como goma de tragacanto como un sustrato de la incrustación. Incluso en los casos en que la congelación se lleva a cabo adecuadamente, se debe tener cuidado para evitar especímenes posteriormente descongelación accidentalmente a través del contacto con recipientes o instrumentos RT.Por lo tanto, un proceso de congelación con éxito requiere un cierto grado de planificación que incluye un pre-enfriamiento de todos los instrumentos y contenedores que se utilizarán. Cuando se encuentran artefactos de congelación, hay un método descrito aquí para la recuperación del tejido que es suficiente para la mayoría de las evaluaciones patológicas. Sin embargo, este ciclo de congelación / descongelación no ofrecer la histología perfecta y tiene el potencial de afectar otros estudios moleculares o enzimática del tejido (además del tiempo necesario para volver a congelar el tejido), por lo que el uso de prácticas apropiadas de congelación inicial es mucho más preferible . En los casos en que se encontró artefacto de congelación en el tejido de pre-congelados, sin embargo, la técnica descrita en este documento puede ser extremadamente útil. La fijación y el procesamiento de tejido para ME ofrece desafíos técnicos específicos que requieren una planificación previa a la recogida de tejidos. El error más común en la recogida de muestras para EM implica el uso de fragmentos de tejido que son demasiado gruesas para glutaraldehyde para penetrar. Como glutaraldehído sólo penetra aproximadamente 0,1 cm en el tejido muscular de una superficie determinada, se debe tener cuidado para asegurarse de que una de las dimensiones de las muestras EM es no más gruesa que 0,2 cm. Además, como EM es un medio excelente para evaluar directamente el aparato contráctil, algunos investigadores han desarrollado estrategias de pre-tensión o estiramiento previo del músculo antes de la fijación para permitir la medición de los elementos contráctiles a una tensión fisiológicamente relevante. No existe un protocolo estándar para la pre-tensado, pero dos estrategias se describen brevemente en este protocolo. Cabe señalar que los intentos de pre-tensar el músculo puede producir resultados impredecibles a menos que se llevan a cabo de una manera muy específica, y puede ser preferible fijar los músculos en el estado de holgura para evitar cambios de artefactos en la longitud del sarcómero a través de un no estándar procedimiento de pretensado 8,9. Para que los músculos en que este tipo de medidas específicas no son necesarias (incluyendo la mayor parte biopsies realizados con fines clínicos), generalmente no se realizan esfuerzos para pre-tensión del músculo, y el principal efecto de la morfología muscular es una separación no uniforme de sarcómeros en el músculo. Este trabajo representa la primera de una serie para proporcionar los SOP para la realización de las pruebas en el campo de la enfermedad muscular congénita, y representa el esfuerzo de más de 20 expertos en el campo de la enfermedad muscular congénita que es rutinario realizar celular, molecular y funcional, fisiológica y la investigación patológica. Se pondrá a disposición una serie de procedimientos normalizados de trabajo publicados durante el próximo año, y los protocolos necesarios y todos los formatos adecuados para cada se discutieron en un músculo de la Enfermedad congénita Consorcio taller celebrado en abril de 2013 en Washington DC El objetivo de este esfuerzo SOP es proporcionar una hoja de ruta para las pruebas necesarias y el análisis de muestras en el campo de la enfermedad muscular congénita a 1) estandarizar las prácticas y los criterios de valoración utilizados en nuestro campo como much como sea posible, y 2) proporcionar instrucción sobre las prácticas estándar para los nuevos investigadores en nuestro campo. Creemos que estos recursos facilitarán la entrada de nuevos investigadores en nuestro campo bajo estudiada y así mejorar el alcance de la investigación que se puede realizar. Además, una estandarización de las prácticas será de gran utilidad para comparar los datos entre los estudios e identificar los puntos finales en la planificación y la realización de los ensayos preclínicos y clínicos. Mientras que el foco principal de este artículo está relacionado con la congelación y preparación de tejido apropiado para una variedad de estudios, nuestro grupo de colaboración también discutió los puntos finales útiles para el análisis patológico de los especímenes musculares. En la actualidad, no existe un consenso oficial sobre el enfoque a adoptar cuando se realiza el análisis patológico, y una variedad de diferentes estudios se llevan a cabo para relacionar los nuevos conocimientos a las publicaciones anteriores para cada enfermedad respectiva. Por lo tanto, pensamos que sería útil paraproponer algunas directrices generales para la planificación de los extremos patológicos en la musculatura caracterización patología. Antes de la cuantificación de la patología en un estudio, el pensamiento considerable se debe poner en 1) el método de medición del tamaño de la fibra, 2) la posibilidad de anomalías de tipo de fibra específico o efectos del tratamiento, 3) la posibilidad de alteraciones o efectos que se limitan a los músculos individuales, y 4) una estrategia para la cuantificación de los hallazgos patológicos que son característicos de la enfermedad en estudio. Tamaño de fibra es un punto final necesario para la mayoría de los estudios, y por desgracia hay una extensa variación en la forma en que se cuantifica. Muchos estudios reportan estos resultados usando métodos de cuantificación automatizadas proporcionadas por el software de imágenes de propiedad, pero muchos de estos programas toman atajos (como el supuesto de que las fibras son círculos o elipses), que puede hacer estas mediciones automatizadas inexacta. Es necesario entender cómo estos programas automatizados hacen sus mediciones bntes de tener confianza en las mediciones, y animamos a los investigadores a incluir estos detalles en los métodos de papel. Además, la medición específica utilizada para denotar tamaño de la fibra es extremadamente variable, y algunas mediciones son preferibles a otros 10,11. Una medida comúnmente utilizada de tamaño de la fibra es el área de sección transversal de la fibra (CSA), en particular porque los investigadores que realizan estudios fisiológicos estandarizar sus resultados con las mediciones de CSA obtenidos usando sus instrumentos. Desafortunadamente, mientras que las mediciones de CSA pueden reflejar con precisión el tamaño de la fibra en las secciones transversales perfectos, que dependen en gran medida en orientación de la fibra (en la medida en que las fibras longitudinales u oblicuamente seccionadas-tendrán mediciones artificialmente altos CSA) y son por lo tanto las mediciones no ideales para el tamaño de la fibra. Una medida preferible de tamaño de la fibra que es menos dependiente de fibra de área de sección transversal es el diámetro de la Feret mínimo (diámetro MinFeret), que es la medición de the diámetro menor en la célula muscular 12. Esta medida es sólo ligeramente dependientes orientación de las fibras y generalmente es el estándar de oro para la medición clínica de la fibra, y se anima a los investigadores a avanzar hacia el uso de esta técnica. Estas mediciones a menudo se pueden hacer usando el mismo software que genera mediciones CSA 13, y también son fáciles de medir manualmente. Con respecto a la evaluación de los datos patológicos de acuerdo con el tipo de fibra, músculo específico, y en el contexto de los hallazgos patológicos relacionados con la enfermedad específica, estos son temas menos controversiales que sólo deben tenerse en cuenta durante la planificación de un estudio. Tipo de fibra puede ser evaluada utilizando tinción inmunohistoquímica o ATPasa, pero es útil tener en cuenta que los músculos específicos y especies animales tienen mezclas específicas de estos tipos de fibras (necesitando por lo tanto diferentes expectativas y las estrategias de ensayo). Implicación patológica específica muscular o la eficacia del tratamientopuede ocurrir, y el peso total del músculo en comparación con los controles se puede utilizar para identificar el grado de heterogeneidad de la enfermedad antes de decidir sobre los músculos para evaluar patológicamente. Por último, es bien sabido que muchas enfermedades musculares están asociados con anomalías patológicas específicas (tales como varillas nemaline en miopatía nemalínica) 14,15, y por lo que también es útil considerar si estas anomalías se encuentran en un músculo de tipo fibra o -específica de distribución cuando se realiza el análisis 16,17. En general, aunque no proponemos un conjunto inflexible de normas para la evaluación de los músculos, creemos que estos temas deben ser considerados antes de la realización de los estudios patológicos en cualquier enfermedad del músculo esquelético.

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation. 
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models. 
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1111">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device</td>
			<td style="width:107px;">Custom Biogenic Systems</td>
			<td style="width:115px;">Lab-5 Series</td>
			<td>Any other liquid nitrogen dewar could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Cold-conductive container</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:115px;">02-583A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Nalgene</td>
			<td style="width:115px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer</td>
			<td style="width:107px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:115px;">1228Y01</td>
			<td>Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For single fiber functional testing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">08-757-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sylgard coating</td>
			<td style="width:107px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:115px;">&#160;3-6636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Dissection stereomicroscope</td>
			<td style="width:107px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:115px;">693101</td>
			<td>Any other dissection microscope could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile laminar flow hood</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">51022485</td>
			<td>Any other cell culture hood could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Materials</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Plastic bags/containers</td>
			<td style="width:107px;">Nasco</td>
			<td style="width:115px;">B01009WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Thermal safety gloves</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">G4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Face shield</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">S47640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Long forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">&#160;12-460-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Marker</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td style="width:115px;">125328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Sterile 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">C1060-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">PES filter unit, 500 mL, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">644320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Ice packs</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">NC9909223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Insulated Styrofoam box</td>
			<td style="width:107px;">Polar Tech</td>
			<td style="width:115px;">207F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Packing tape</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td align="right" style="width:115px;">795570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Reagents</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Tissue Freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Airgas</td>
			<td style="width:115px;">NI NF160LT350</td>
			<td>Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Isopentane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M32631-4L</td>
			<td>Store Isopentane&#160; in a flammable materials cabinet.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:523px;">EM fixative (choose one)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;">The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16537-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Karnovsky&#39;s fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">15732-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For functional studies (if desired)&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Relaxing solution, containing (in mmol/L)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 40 BES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10 EGTA</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 6.56 MgCl2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5.88 Na-ATP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1.0 DTT</td>
			<td style="width:107px;">RPI</td>
			<td style="width:115px;">D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 46.35 K-propionate</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15 creatine phosphate, pH 7.0</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 leupeptin</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:115px;">10895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.1 PMSF</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Skinning solution, containing&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Relaxing solution (See Above)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.5% Triton X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indicating silica granules</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Flat pieces of cork (1 x 1 inch)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">63305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture (if desired)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Growth Medium, containing (for 500 mL)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 &#181;m PES filter unit.&#160; Store at 4&#176;C and use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 395 mL of high glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 mL of fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Storage requriements</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease

El músculo esquelético es un tejido único debido a su estructura y función, que requiere protocolos específicos para la recogida de tejidos para obtener óptimos resultados de las evaluaciones funcionales, celulares, moleculares y patológicos. Debido a la sutileza de algunas anormalidades patológicas visto en los trastornos musculares congénitas y el potencial para la fijación a interferir con el reconocimiento de estas características, la evaluación patológica de músculo congelado es preferible muscular fija la hora de evaluar el músculo esquelético para la enfermedad muscular congénita. Además, el potencial de producir artefactos de congelación graves en el músculo requiere precauciones específicas al congelar el músculo esquelético para el examen histológico que no se utiliza comúnmente cuando se congelan otros tejidos. Este manuscrito describe un protocolo para la congelación rápida del músculo esquelético utilizando isopentano (2-metilbutano) enfriado con nitrógeno líquido para preservar la morfología óptima músculo esquelético. Este procedimiento también es eficaz para freezing tejidos destinados a los estudios de expresión genética o de proteínas. Además, hemos integrado nuestro protocolo de congelación en un procedimiento más amplio que también describe los métodos preferidos para la clasificación a corto plazo del tejido de (1) los estudios funcionales de fibra única y (2) el cultivo celular de mioblastos, con un enfoque en el esfuerzo mínimo necesario para recoger tejidos y transportarlo a la investigación o laboratorios especializados de referencia para completar estos estudios. En general, este manuscrito proporciona un resumen de cómo el tejido fresco se puede distribuir de manera efectiva para una variedad de estudios fenotípicos y de ese modo proporciona los procedimientos normalizados de trabajo (PNT) para estudios patológicos relacionados con la enfermedad muscular congénita.

Para dar ejemplos de los artefactos observados con la congelación inadecuada, varios músculos del cuadriceps de ratones fueron congelados utilizando diferentes técnicas (Figura 3) para replicar los errores encontrados comúnmente. Como se muestra en la Figura 3A, el músculo esquelético apropiadamente congelado muestra una aposición estrecha de miofibras en el tejido circundante (por lo general otras fibras musculares, pero a veces el espacio entre endomisio miofibras se llena con la fibrosis o células inflamatorias en una variedad de procesos de enfermedad o lesión) y un compartimiento citoplasmático claramente visible. Para el análisis patológico, la capacidad de ver el espacio intracelular es a menudo más importante que el compartimento endomisio, ya que suele ser crítico para identificar claramente la presencia de cambios degenerativos, cambios regenerativos, u otros hallazgos patognomónicos (núcleos centrales, inclusiones intracelulares) en este espacio. Por lo tanto, la presencia de cristales de hielo en el compartimento intracelular representa amAjor problema en la evaluación patológica de los músculos. Congelación adecuada de tejido muscular requiere ambas temperaturas suficientemente frías y una velocidad suficiente de la congelación para evitar la formación de cristales de hielo. Incluso cuando la contabilidad de ambos factores, considerable de artefactos de congelación aún puede ocurrir debido a un exceso de humedad en el tejido muscular. Este problema se encuentra más comúnmente en el tejido muscular que había sido sumergida previamente en solución salina y se secó insuficientemente o cuando el músculo ha estado en contacto directo por OCT medios de montaje en el sitio de seccionamiento (Figura 3B, 3E). Mientras algún contacto con octubre suele ser inevitable, como consecuencia del proceso de montaje, se debe hacer todo lo posible para evitar el contacto entre las áreas que serán evaluados histológicamente y los PTU, destinados al montaje. En contraste, las muestras congeladas utilizando un -80 ° C congelador (Figura 3 C) y nitrógeno líquido (Figura 3D) proporcionan ejemplos de artefacto de congelación que se produce por la temperatura subóptima o la velocidad de congelación. El proceso de congelación lenta encontrado mediante la colocación de tejido en un congelador -80 ° C proporciona un ejemplo extremo de congelación artefacto. Cuando se utiliza nitrógeno líquido, el problema principal es que el contacto entre el nitrógeno líquido y el tejido provoca una vaina de nitrógeno gaseoso para formar en la interfaz tejido-líquido, y esta interfaz gaseosa no es lo suficientemente fría para producir muscular rápida congelación 1. Esto puede producir artefactos de congelación significativa cerca de la superficie de la muestra, pero las áreas internas de la muestra es más probable que el flash de congelación a una velocidad apropiada y puede ser totalmente a salvo de heladas artefacto. Mientras que el simple inmersión del tejido muscular en nitrógeno líquido no es tan útil como el proceso de isopentano de congelación, puede ser útil para la congelación de muestras de músculos grandes en situaciones en isopentano no está disponible (por ejemplo, muestras de autopsia clínica en las instituciones conlaboratorios de patología muscular clínicos fuera). Los resultados con esta estrategia son generalmente mejor cuando se utilizan grandes porciones de tejido (&gt; 2 cm en varias dimensiones). Si bien la evitación de artefacto de congelación proporciona resultados histológicos óptimas, una técnica también ha sido desarrollado (y descrito en el presente documento) que invierte sustancialmente la congelación artefactos para permitir la evaluación de tejido congelado de forma incorrecta. El tejido que se congela de forma incorrecta (Figura 3E) se puede descongelar y volver a congelar bajo condiciones estrictamente controladas (Figura 3F) para permitir que la redistribución del agua dentro de las fibras, y el grado de conservación morfológica que es obtenible puede ser excelente. En nuestra experiencia, este proceso preserva la morfología intracelular del tejido de manera muy notable, pero a menudo se produce una separación de artefactos de las fibras dentro del espacio endomisio. Como muchos puntos finales patológicos se encuentran en el espacio intracelular y aquellos en losel espacio endomisial se ve mejor utilizando tinciones especiales (ya sea para resaltar la fibrosis o para identificar otros tipos de células), se espera que alteren verdaderamente la evaluación patológica de los músculos de estos cambios de artefactos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Triage de tejido para estudios estructurales, funcionales, y celulares de músculo esquelético. Dependiendo de los tipos de estudios deseados, tejido de músculo esquelético recogido se puede procesar en una variedad de maneras para obtener resultados óptimos. Los protocolos descritos en el presente documento se describen los métodos de triage o procesamiento de muestras de músculo esquelético para estudios fuera del sitio para optimizar los resultados que se pueden obtener a partir de unidades de apoyo de expertos. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 2. Ejemplos de aparatos utilizados para la congelación del músculo. Como se describe en el protocolo, la congelación muscular óptimo requiere la inmersión del tejido muscular en isopentano que está en su temperatura de congelación. Un medio seguro y eficaz de obtención de isopentano enfriado con hielo implica el uso de un recipiente de metal para el isopentano que se enfría en un Dewar circundante que contiene nitrógeno líquido. Como a menudo es conveniente tener las dos manos libres, es posible utilizar un aparato ortopédico tales como un anillo de soporte (A) para mantener el recipiente isopentano en el nitrógeno líquido mientras que la prevención de la mezcla de los dos líquidos. Alternativamente, el recipiente también podría celebrarse en el nitrógeno líquido manualmente (B). En cualquier caso, el tejido no debe ser colocado en el isopentano hasta que el isopentano se visiblemente helada en la parte inferior del recipiente (por lo general como guijarros blancos opacos), y luego debe ser sumergido durante 10-20 segundos para permitir la congelación completa. Isopentane a temperatura de congelación produce &quot;niebla&quot; mínimo (es decir, la temperatura no es adecuada si considerable niebla está presente). Una vez que el tejido se congela, colocar directamente en los recipientes de pre-enfriada (y luego directamente en un refrigerador o congelador) para evitar la descongelación accidental después de la congelación. Músculo congelado (C) montado Apropiadamente-debe tener la mayoría del tejido muscular que sobresale de una base de congelado octubre <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Ejemplos de congelación artefacto, y de eficaz descongelación / recongelación. Imágenes representativas de (A) músculo apropiadamente isopentano-congelado, (B) músculo congelaron en isopentano apropiadamente, pero mientras está en contacto con el medio de montaje PTU, (C) de músculo congelado en un congelador a -80 °, y (D </fuerte&gt;) del músculo congelado en nitrógeno líquido, todos los cuales mostrar grados variables de congelación artefacto. Como se muestra en (B), el alto contenido de líquido de octubre produce artefactos de congelación significativa en el músculo que está en contacto con él, se debe utilizar de modo que sólo la cantidad mínima de octubre requerido para el montaje y el músculo para la evaluación histológica debe ser &quot;de pie fuera &quot;de su superficie. La lentitud del proceso de congelación utilizando un (C) -80 ° C congelador o (D) de nitrógeno líquido (en relación con la velocidad de congelación en hielo isopentano frío) puede conducir a la producción de artefactos de congelación significativa. Paneles E y F muestran el músculo de la misma muestra que era (E) inicialmente subóptima congelada (debido a un contacto excesivo con OCT) y después (F) descongelado y vuelto a congelar utilizando la técnica descrita en este documento. Si bien se puede observar una cierta separación de artefactos entre las fibras en la muestra vuelto a congelar, la i mejoran la morfología intracelular de las fibras musculares es evidente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triage de tejidos y de congelación para los modelos de la enfermedad del músculo esquelético

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

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JoVE Journal

Biology

39.7K vistas.  Medical College of Wisconsin. The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Video: Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Investigación

Biología

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...