Name: effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs
Uploaded: 2014-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
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Damos las gracias a MR Helmus para la voz en off, CM Popelier, S. y C. Ypenburg Levesque para la asistencia técnica. Esta investigación es financiada por la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), la Real Academia Holandesa de Artes y Ciencias (KNAW) y la Organización de Servicios Estudiantiles Japón (JASSO). Esta publicación fue apoyada por una beca de acceso abierto de la NWO a JMK.

1. Criadero <ol><li> Obtener ejemplares adultos de Lymnaea stagnalis (L.) a partir de un cultivo de laboratorio, como el de la Universidad VU. </li><li> Mantener el agua baja en cobre a 20 ° C, tanto en la instalación de cría (molluscarium) y los tanques experimentales, que tienen el cambio de agua continuo. </li><li> Ajuste el ciclo de luz / oscuridad de 12 h: 12 h. </li><li> Para la cría, alimentar a los caracoles adultos sin pesticidas lechuga ad libitum, alimentar a los jóvenes menores de edad con TetraPhyll (comida de pescado) copos. Mantener caracoles en tanques separados de acuerdo a su edad, a partir de las masas de huevos que se colocan dentro de un plazo de 24 horas. </li><li> Una vez que los caracoles son retirados de los tanques de cría que no se devuelven, para evitar los efectos de haber sido mantenido bajo condiciones ligeramente diferentes, así como para prevenir pseudoreplication. </li></ol> 2. Disección <ol><li> Aislar los caracoles durante 1 semana, y darles de comer a voluntad, para asegurar that tienen pleno esperma y almacena el líquido seminal. </li><li> Preparar un microscopio estéreo, una placa de disección con los pins, pequeñas tijeras quirúrgicas, fórceps gruesos y finos, una jeringa de 10 ml llena con una solución de MgCl 2 50 mM, agujas de inyección (0,3 mm x 13 mm) y algunas toallas de papel. </li><li> La eutanasia a un caracol inyectando MgCl2 solución (generalmente 3 ml o más para los caracoles adultos con una longitud de concha de 31,6 ± 2,1 mm y el peso húmedo de 2.89 ± 0.55 g). Penetrar en el pie con la aguja de inyección en un ángulo de 45 ° y se inyecta mediante la aplicación de una suave presión de forma continua hasta que el caracol se relaja y se mantiene extendida (en segundos). Retire la aguja de inyección y comprobar si el caracol es sacrificado (por ejemplo, comprobar si el reflejo de retirada tentáculo está ausente). </li><li> Retire con cuidado la cáscara siguiendo su curvatura por el uso de fórceps gruesas. A mitad de camino, quite suavemente el músculo columelar de la cáscara raspando con los fórceps. Gire suavemente tél caracol de su concha, siguiendo la dirección de enrollado de la concha. </li><li> Coloque el caracol en la placa de disección y precisar la parte trasera del pie. Luego, coloque un alfiler a través de la cabeza y poner un poco de tensión en el caracol para facilitar la disección. </li><li> Localizar el gonoporo femenina, que más tarde será un punto de referencia para la disección. </li><li> El uso de las tijeras quirúrgicas y unas pinzas finas, hacer que la primera incisión, justo debajo del borde de la capa y cortar hacia el gonoporo hembra. Cuando una de las cuchillas de las tijeras es empujada bajo la pared del cuerpo, levántelo ligeramente para asegurarse de que sólo la pared del cuerpo, y ninguno de los órganos internos, se corta. Continuar el corte por encima de la gonoporo hacia la cabeza y cortar en línea recta. </li><li> Localizar la glándula de la próstata (posterior) y las vesículas seminales (anterior). Diseccionar éstos con cuidado y mantenerlos en hielo. Utilice estos para hacer las soluciones de ensayo que contiene líquido y / o esperma seminal. Utilice fisiológica sal Lymnaeaine (5.83 mmol / L CaCl2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / l MgCl 2 · 6H 2 O, 42.69 mmol / l de NaCl, 37.53 mmol / L KCl) como un medio portador. </li><li> Recoger el líquido seminal que está presente en el lumen de la glándula de la próstata, así como el esperma de las vesículas seminales. Posteriormente, suspender tanto en solución salina en viales separados, expresando con cuidado su contenido y eliminar el tejido de los órganos con una pinza. Mantener en hielo y utilizar el mismo día. Más tarde, mezclar estas suspensiones para crear las diferentes soluciones de tratamiento. </li></ol> 3. Intravaginal Inyección <ol><li> Antes de comenzar el procedimiento de inyección intravaginal, preparar una cáscara de molde de silicio (hecho para adaptarse a la punta de la cáscara), 1 jeringas mm, 10-12 cm de tubo de silicio con un diámetro de 1 mm, romos agujas de inyección (0,3 mm x 13 mm ), fórceps secundarios y la misma jeringa de 10 ml llena con una solución de 50 mM de MgCl 2 provista de una aguja de inyección agudo. </li><li> Se recoge el esperma, es necesario agregar al líquido seminal (o fluido seminal proteínas individuales) en algunos tratamientos; una dosis biológicamente relevante es igual a 1/3 de una glándula de la próstata y vesícula seminal por inyección. NOTA: En la sección de resultados representativos (Figura 1) se muestran los resultados de un experimento con tres tratamientos diferentes: Control (medio de soporte, es decir, la solución salina), Ovipostatin (una de las proteínas del líquido seminal identificados) solo y Ovipostatin acompañado con el esperma. Además, para estimar la dosis biológicamente relevante en otras especies, determinar la diferencia en el peso de la glándula prostática de los individuos que se han apareado y las personas que quedaron aisladas sexual-16 recientemente. </li><li> Preparar jeringas de 1 ml para cada una de las soluciones de ensayo preparadas. Llene cada jeringa con una solución y asegúrese de que no haya burbujas de aire en el interior. </li><li> Coloque una aguja de inyección romo en cada jeringa. </li><li> Para utilizar la inyección de un 1tubo de silicona diámetro mm con una longitud mínima de 10 cm. </li><li> Deslice con cuidado el tubo de silicona sobre la aguja de inyección, teniendo cuidado de no perforar el tubo, y quitar el aire del tubo aplicando suavemente la presión sobre la jeringa. </li><li> Anestesiar un caracol, siguiendo el mismo protocolo que en el punto 2.3. Esta vez asegúrese de no inyectar más de 2 a 3 ml de 50 mM MgCl 2. </li><li> Coloque el caracol en el molde de la cáscara para mantenerlo en una posición estable. </li><li> Localice el gonoporo femenina, que es claramente visible como una mancha blanca en el lado derecho del animal, anterior al tentáculo derecho y gonoporo masculino (esta ubicación también se aplica a otras especies de caracoles de agua dulce). Asegúrese de tener acceso sin obstáculos. </li><li> Utilice una pinza para sujetar el extremo del tubo de silicona y suavemente inserto de aproximadamente 2-4 mm del tubo de silicio en el gonoporo hembra. </li><li> Con cuidado aplique presión a la jeringa e inyectar 0,03 ml de la solución de ensayo. Espere medio minutoUte para permitir que la presión en el tubo que se extienda en el tracto femenino antes de retirar el tubo. </li><li> Devuelva el caracol tratado a su contenedor de aislamiento, donde puede ser monitoreado, y permitir que se recupere de la sedación en el tanque experimental. </li></ol> 4. Bioensayo <ol><li> Etiquetar cada caracol para la identificación y medir su longitud de concha. Este último es un buen indicador del tamaño, que es relevante al tiempo de cuantificar el rendimiento reproductivo. </li><li> Mantenga cada caracol aislado en un recipiente 460 ml que está perforada para permitir el intercambio de agua dentro del tanque experimental. Es importante colocar todos los contenedores en la orientación correcta, con las perforaciones en la dirección del flujo de agua, para permitir el intercambio de agua eficiente. </li><li> Durante el bioensayo, caracoles alimentar regularmente con una cantidad estandarizada de lechuga. Utilice un golpeador de metal redondo para cortar lechuga. En este protocolo se utilizan discos de lechuga de 19,6 cm 2, que se aproxima a la de unmontaje que como máximo se puede comer en un día. </li><li> Reunir una masa de huevos usando el lado plano de una espátula y raspar la masa de huevos de la pared del recipiente. Use el lado cuchara para recoger la masa de huevos. NOTA: masas de huevos opacos que acaban de ser establecidas no se pueden utilizar para el escaneado (que se vuelven transparentes dentro de unas pocas horas después de la construcción). Para la especie modelo en este protocolo, stagnalis Lymnaea, compruebe si hay masas de huevos todos los días, ya que producen 2-3 masas de huevos por semana. Esto puede diferir en otras especies. </li><li> Escanear las masas de huevos recogidos de forma digital, utilizando una (laptop) de ordenador que contiene el controlador del escáner, un escáner de cama plana, una escala milimétrica estándar, una espátula, la transferencia de placas y baldosas de vidrio. </li><li> Coloque cada masa de huevos en las placas de transferencia y repetir hasta que los platos están llenos. Posteriormente, haga presión sobre las masas de huevos en seco en la toalla de papel y transferirlos a los azulejos de cristal en el mismo orden que en las placas de transferencia. </li><li> Gire cada azulejo boca abajo (lamasas de huevos se adhieren a las baldosas de vidrio) y se coloca cuidadosamente en el escáner de superficie plana, justo debajo de la escala milimétrica. Aplique un poco de presión para aplanar las masas de huevos, que se distribuyen los huevos de manera uniforme para todos ellos son visibles dentro del mismo plano de enfoque. Colocar los azulejos con una cantidad estandarizada de cinta alrededor de dos bordes para asegurar que todos los huevos se aplanan por igual. </li><li> Ajuste la configuración del escáner. Es importante ajustar la resolución al máximo, hacer una exploración preliminar, recortar el área de trabajo, y ajustar el brillo y el contraste. Escanear las masas de huevos. </li><li> Coloque cada masa de huevos en su propia etiqueta del vial de vidrio de 20 ml para un mayor desarrollo y eclosión. </li><li> Actualizar el agua en la eclosión viales cada dos días para mantenerlo adecuadamente oxigenado. Para ello, de acuerdo a los números de neonatos y el tamaño en el orden siguiente: decantación / vertiendo (sin crías), desbordando (inicio de la eclosión), y extraer el agua con una pipeta (muchas crías). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Medir y contar los huevos <ol><li> Instale el software de análisis de imágenes ImageJ libre disposición (NIH, EE.UU.) y el plugin contador de células. </li><li> ImageJ abierto, así como un programa de hoja de cálculo para transferir los datos. A continuación, abra una imagen escaneada de masas de huevos en ImageJ. </li><li> Ajuste la escala con la función de zoom para desplazarse a la escala milimétrica. Acercar y ajustar la ventana de 1 mm para llenar la pantalla. Dibuja una línea con la herramienta de línea entre las dos líneas que indican 1 mm. Vaya a analizar, y Set escala. En el menú emergente de la opción de longitud medida se hace visible, ajuste la distancia conocido a 1 y unidad de longitud de mm. Marque la casilla Global, y cerrar la ventana. </li><li> Establecer las medidas preferidas (largo, ancho, circunferencia) navegando a analizar, y establecer medidas, seleccionando Área y diámetro de Feret (largo y ancho). Haga clic en Aceptar para confirmar y continuar con el análisis de la imagen. </li><li> Para medir los huevos, la zoOM en en un huevo de la primera masa de huevo que debe ser medido. Se recomienda utilizar un zoom de 800%. Entonces, usando la herramienta elíptica dibujar un óvalo exactamente alrededor del huevo, pulse Ctrl + D para dibujar la circunferencia sobre la imagen (para evitar que la medición del mismo huevo dos veces). A continuación, pulse Ctrl + M para registrar la medida de las propiedades de la ovalada (largo, ancho, circunferencia); una pantalla emergente se abre mostrando las mediciones. NOTA: El uso de la herramienta elíptica para medir los huevos no se aplica a todas las especies. Para las especies con huevos en forma no uniforme, utilice las selecciones a mano alzada en su lugar. </li><li> Mida tantos huevos como sea necesario y guarde las medidas. Hoja de cálculo xls. Opcionalmente, copiar los datos directamente en una hoja de cálculo. </li><li> Posteriormente contar los huevos dentro de una masa de huevos, mediante el uso de la ventana del contador y poner las cuentas manualmente en la hoja de trabajo. </li><li> Por otra parte, contar los huevos individuales por masa de huevos con la ayuda de la célula contra plug-in. Para ello, vaya a los plug-ins,a continuación, analizar y seleccionar Contador de células. La ventana del contador de células aparecerá, marque la casilla &#39;Guardar original &quot;caja y pulsa&#39; inicializar &#39;. Aparecerá una nueva ventana del contador, seleccione la herramienta en forma de cruz de la barra de herramientas y seleccione un tipo de contador en el menú de contador de células. Cuente los huevos individuales haciendo clic sobre los huevos individuales en la ventana Contador de células. Observe el recuento total de al lado del tipo de contador en el menú de contador de células. Copia este número manualmente a una hoja de cálculo o de obtener los resultados pulsando Resultados. </li><li> Cuente múltiples masas de huevos dentro de un evento de conteo añadiendo tipos de contador, si es necesario. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado muestra cómo recolectar líquido seminal y la forma de probar esto en una forma biológicamente significativa. Aunque este procedimiento aquí se muestra usando el extracto de glándula de la próstata, el efecto de una sola proteína de fluido seminal purificado también se puede probar siguiendo el mismo procedimiento. Obviamente, en este tipo de pruebas, siempre es crucial incluir controles adecuados (tratamientos simulados) para garantizar que el procedimiento y / o el medio portador no afectan los parámetros en preguntas 14,16. Utilizando este método, ya se ha demostrado que existe una única proteína fluido seminal, a saber Ovipostatin, que media una reducción en la puesta de huevos 14,16. Esta proteína, producida en la glándula de la próstata y se transfiere durante el apareamiento junto con los espermatozoides, representa el primer componente líquido seminal caracterizaron completamente en un hermafrodita simultáneo y no, hasta ahora, no muestra ninguna similitud con las proteínas conocidas. El hallazgo de que Ovipostaestaño reduce la producción de masa de huevo en el recipiente corrobora trabajos anteriores que indica que las sustancias en el semen pueden influir en la puesta de huevos 13-15. Mediante la transferencia de cantidades biológicamente relevantes (ver 3.2 16), uno puede demostrar de manera convincente que es una proteína de líquido seminal, y no la presencia de espermatozoides a sí mismos, que media la reducción observada en la puesta de huevos (Figura 1). Teniendo en cuenta que la recepción repetida del líquido seminal a través de apareamientos naturales aumenta la inversión por huevo 15, ahora se vuelve altamente relevante para cuantificar otros parámetros de la puesta de huevos. El protocolo presentado ahora proporciona los métodos necesarios para hacerlo. Aunque no se encontró efecto de Ovipostatin en el éxito de los huevos puestos por el receptor 16 de la eclosión, puede haber otras proteínas de fluidos seminales que actúan en concierto con esta proteína. Por lo tanto, los parámetros que deben ser cuantificados en este contexto - al lado por el que se números de la frecuencia y de los huevos - incluyen el tamaño del huevo, hatctiempo Hing, el desarrollo de crías y el tamaño de crías. Además, es posible observar los efectos sobre otros procesos femeninos que la puesta de huevos, como el almacenamiento y el uso de esperma, así como la asignación de recursos hacia la función reproductiva femenina y masculina 14,17. Es evidente que el método presentado es un instrumento para hacer frente a estas cuestiones de seguimiento, tanto en Lymnaea stagnalis y en otros caracoles de agua dulce. En resumen, los experimentos con este espectáculo protocolo que transfieren fluido seminal proteínas afectan el desempeño reproductivo de la mujer del destinatario en estos hermafroditas simultáneos. Dado que pocos estudios han abordado este, es probable que sea mucho más común en la fertilización internamente hermafroditas que se refleja en la actualidad en la literatura científica. Especialmente cuando uno se da cuenta de que la elección de pareja pre-copulador y la competencia espermática se ha demostrado que desempeñan un papel importante en estos hermafroditas 14, que importanTS el potencial de tales proteínas de las glándulas accesorias masculinas a ser seleccionado sexualmente en este sistema. Por último, esta investigación ayuda a apoyar la noción de que el desarrollo de las proteínas del líquido seminal son de igual importancia para los hermafroditas simultáneos, ya que son para las especies separadas sexuado.

Tras la transferencia, los espermatozoides son por lo general acompañada de líquido seminal producido por las glándulas accesorias masculinas. Mientras que algunos componentes del eyaculado juegan un papel en la activación de los espermatozoides nutritiva y 1, otros influyen en la fisiología femenina con el fin de aumentar el éxito de la fertilización del donante de esperma 2-4. Estos efectos son especialmente seleccionados para, a través de la selección sexual, cuando una especie es altamente promiscua y tiene el almacenamiento de esperma eficiente y la digestión de los espermatozoides. Bajo tales condiciones, los donantes de esperma compiten fuertemente para la fertilización de los huevos 5. Si bien existe abundante evidencia correlacional de la importancia de las sustancias líquido seminal para el éxito de la fertilización masculina, prueba directa es más raro y pocos estudios han profundizado en los detalles del cambio y / o sustancias que intervienen 6 fisiológica. En especies con sexos separados (es decir, machos y hembras; Gonocorista) hay unos pocos modelos especi bien investigadoES cuando se trata de la composición del fluido seminal y sus efectos. Algunos ejemplos son la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster 6, el mosquito de la malaria, Anopheles gambiae 7, y el escarabajo rojo de la harina, Tribolium castaneum 8. Tales estudios de fluidos seminales son mucho más raras cuando se trata de especies que son simultáneamente hermafrodita (es decir, los individuos son funcionalmente macho y hembra al mismo tiempo), a pesar de que este modo de reproducción es común en todo el reino animal 9. El ejemplo más notable hermafrodita de la transferencia de una sustancia de las glándulas accesorias es probablemente el rodaje de los llamados amorosos dardos en los caracoles de tierra de 2,10, cuando la sustancia se transfiere por el donante de esperma a través de inyección hipodérmica 11,12, es decir, no junto con los espermatozoides. Pero hay muchos hermafroditas simultáneos que transfieren productos de las glándulas accesorias masculinas junto con su esperma,tales como la especie modelo utilizado aquí, el gran estanque de caracol Lymnaea stagnalis. La investigación anterior ha demostrado ya que la recepción de líquido seminal influye en el rendimiento reproductivo femenino de esta especie 13-15, y varias de las proteínas del líquido seminal involucrados se han identificado 16,17. El objetivo general de este protocolo, que es una extensión de los métodos reportados en Koene et al 16, es poner a prueba los efectos de las proteínas del líquido seminal sobre diversos parámetros de la puesta de huevos en los moluscos gasterópodos. Esto se logra mediante la disección de la glándula de la próstata (es decir, el macho de las glándulas accesorias producir el líquido seminal) de aislados sexual caracoles donantes de un cultivo de laboratorio normalizado. En segundo lugar, el esperma del donante se obtiene de las vesículas seminales y diferentes soluciones de tratamiento se hacen. Posteriormente, los caracoles de ensayo se anestesian y por vía intravaginal inyectadas con una solución de ensayo (por ejemplo,extracto de glándula de próstata solo, extracto de glándula de la próstata con el esperma, los espermatozoides solo, medio portador). Estos caracoles de prueba se siguen de cerca para los siguientes días o semanas, en condiciones normales, para grabar la puesta de huevos. Las masas de huevos se recogen, digitalmente escaneada para contar y medir varios parámetros, y luego poner en viales individuales para incubar. Después de dos semanas, las crías son contados y escaneados digitalmente. Todos los análisis, tanto de las masas de huevos y crías, son luego analizados utilizando un paquete de software de análisis de imágenes de libre disposición. Para este protocolo se utiliza la cepa de laboratorio de la gran caracol estanque, stagnalis Lymnaea, que se cría en la Universidad VU en Amsterdam. Esta especie sirve como un sistema modelo para investigar preguntas sobre selección y reproducción en hermafroditas sexual. Tamaño relativamente grande del animal hace que sea muy accesible experimentalmente. Además, ya que se utiliza como especie modelo en muchos bdisciplinas iológica que ya saben mucho sobre la biología básica de estos animales. Este método le ayudará a estudiar las preguntas acerca de los procesos de selección sexual que están mediadas a través de fluido seminal proteínas en general. Además, debido a que estos son hermafroditas simultáneos, es posible abordar si tales proteínas actúan en formas similares y / o diferentes como lo hacen en especies en las que los sexos están separados 16,17.

<table><tbody><tr><td>Fish food flakes</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small surgical scissors</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse and fine forceps</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.83 mmol/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.76 mmol/L MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42.69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37.53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two component Silicon</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing (diameter 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml perforated containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal leaf puncher (19.6 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatula/spoon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millimeter scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferring plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glass vials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

En fertilizar internamente animales, el fluido seminal se suele añadir a los espermatozoides, formando el semen o eyaculado. Además de esperma nutritiva y la activación de, los componentes en el líquido seminal también pueden influir en la fisiología femenina para aumentar el éxito de la fertilización del donante de esperma. Aunque muchos estudios han informado de tales efectos en las especies con sexos separados, pocos estudios han abordado este en animales hermafroditas simultáneamente. Este protocolo de vídeo presenta un método para estudiar los efectos de líquido seminal en gasterópodos, el uso de un caracol de agua dulce de forma simultánea hermafrodita, la gran caracol Lymnaea stagnalis estanque, como organismo modelo. Mientras se muestra el procedimiento utilizando extractos completos de la glándula de la próstata, los componentes individuales (es decir, proteínas, péptidos, y otros compuestos) de líquido seminal pueden ser probadas de la misma manera. Efectos de la recepción de los componentes del eyaculado en la puesta de huevos se pueden cuantificar en términos de frecuencia de la puesta de huevos yestimaciones más sutiles de comportamiento reproductivo femenino, como el número de huevos dentro de cada masa de huevos. Los resultados muestran que las proteínas del líquido seminal afectan el rendimiento reproductivo de la mujer en esta hermafrodita simultáneo, destacando su importancia para la selección sexual.

La Figura 1 muestra el porcentaje de animales que ponen huevos después de la inyección intravaginal de cualquiera de la sustancia de control (solución salina), Ovipostatin, o Ovipostatin acompañados con el esperma. N = 15 para cada tratamiento; ver Koene et al 16 para obtener más información y estadísticas (Fuente: Figura 3 de Koene et al 2010, PLoS ONE.).. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Efecto de Ovipostatin en la producción masiva de huevos de Lymnaea stagnalis. El gráfico muestra el porcentaje de animales que ponen huevos después de la inyección intravaginal ya sea de la sustancia de control (solución salina), Ovipostatin o Ovipostatin acompañados con el esperma. N = 15 para cada tratamiento; ver Koene et al. 2010 Detalles y estadísticas. Reimpresión con permiso de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

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Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Efecto de la Mujer Accesorios Glándula productos en la puesta de huevos en gasterópodos

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vistas.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Video: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Un método no invasivo para<em&gt; In situ</em&gt; Determinación de Éxito de apareamiento en americano femenino Langostas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Investigación

Medio ambiente

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

La obtención de huevos de Xenopus laevis mujeres

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Biología

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

Separación mecánica y solubilización proteica de las subcapas perivitellina externa e interna de los huevos de gallina

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Bioquímica

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

Análisis de los productos de escisión familiar del factor de crecimiento transformador ß secretados en el blastocoele de los embriones de Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Biología del Desarrollo

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Ensayo de Alto Rendimiento para el Examen de Preferencias de la puesta de huevos individual<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurociencias

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Dos tipos de ensayos para la detección de espermatozoides quimioatracción rana

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridación para el molusco gasterópodo<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater mussels are among the most imperiled organisms in the world, but information about early larval (glochidial) development and brooding periods is still lacking for many species. Previous studies have focused on the complex life history stage when female mussels are ready to parasitize host fish, but few studies have focused on the brooding period and timing of larval development. The protocol described here allows researchers to non-lethally evaluate the state of gravidity for female mussels. The results of this study show that this method does not affect a female mussel&rsquo;s ability to stay gravid or become gravid again after sampling has been performed. The advantage of this method may permit its use on federally threatened or endangered species or other populations of high conservation concern. This protocol can be adapted for use on both preserved or live individuals and was tested on a variety of mussel species. The database provided is a repository for a breadth of information on timing of reproductive habits and will facilitate future freshwater mussel research, conservation, and recovery efforts.

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels Bivalvia: Unionida

Freshwater mussel conservation is dependent on monitoring reproductive patterns and processes of species. This study standardizes a non-lethal protocol for sampling gill contents, characterizing larval development, and providing a digital repository for data collected. This protocol-database package will be an important tool for mussel researchers in recovery of imperiled species.

Estandarización de un método no letal para caracterizar el estado reproductivo y el desarrollo larvarios de los mejillones de agua dulce (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the induction of ovarian maturation is important to meet the consumer demand for mature mud crabs and hasten seed production. Eyestalk ablation is an effective tool to enhance ovarian maturation in mud crabs. However, there is no standard protocol for the eyestalk ablation of mud crabs. In this study, two eyestalk ablation techniques are described: cauterization (the use of hot metal to ablate the eyestalk of an anesthetized crab) and surgery (the removal of the eyestalk using surgical scissors). Before eyestalk ablation, sexually mature females (CW &#62; 86 mm) were anesthetized using an ice bag (&#8722;20 &#176;C) with seawater. When the water temperature reached 4 &#176;C, the ice bag was removed from the water. Flowing seawater (ambient temperature: 28 &#176;C) was used for recovery from the anesthesia immediately after eyestalk ablation. Mortality did not occur during or after the process of eyestalk ablation. The eyestalk ablation protocol presented here accelerated the ovarian maturation of the mud crabs.

Two eyestalk ablation protocols (i.e., cauterization and surgery&#160;approaches) were performed on anesthetized female crabs. The eyestalk ablation of mud crabs hastened the ripening of ovaries without decreasing the survival rate.

Ablación del tallo ocular para aumentar la maduración ovárica en cangrejos de fango

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the ...

Drosophila Male Accessory Gland Dissection: A Method to Isolate Secondary Cells

Source: Immarigeon, C., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60218/" target="_blank">A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the dissection of the accessory glands from male flies and shows an example in which the isolated gland will be dissociated into a single cell suspension.

Drosophila Disección de glándulas accesorias masculinas: un método para aislar células secundarias

Source: Immarigeon, C., et al. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (2019).
...

Efecto de la Mujer Accesorios Glándula productos en la puesta de huevos en gasterópodos

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Un método no invasivo para