Financiación: Este trabajo fue apoyado por un cuartel general Stuart &amp; Victoria beca predoctoral Quan (RSR), el premio Pioneer NIH (RAS)

Examen General de Salud Un tratamiento más completo de los exámenes de salud en general se encuentran en excelentes Jacqueline Crawley recursos fenotipo conductual, ¿qué pasa con mi ratón? 1. En primer lugar, utilice una batería modificada prueba observacional para evaluar la salud general del sujeto. La batería incluye los elementos de protocolo completo de evaluación de Samuel Irwin 2 a identificar rápidamente los temas que serán aptos para su análisis posterior. En resumen, la batería modificado identifica los animales que se encuentran físicamente anormal (por ejemplo, gravemente insuficiente o excesiva de peso, no se arreglan, disnea) o que presentan una postura anormal de locomoción, o comportamientos. Todos ellos podrían ser manifestaciones de la enfermedad. Cualquier evaluación inicial que de manera similar, los sujetos no saludables es el adecuado. También es importante tener en cuenta que los animales se utilizan con humanidad, tanto durante el examen de salud general, así como durante las pruebas posteriores. Sin anestesia o analgesia se utiliza como estas pruebas no poner en marcha procedimientos potencialmente dolorosos. Prueba de la sensibilidad olfativa Este test está diseñado para detectar una diferencia en la sensibilidad olfativa entre los dos grupos de ratones (por ejemplo, un tipo salvaje y un grupo de mutantes de los animales). En esta prueba, múltiples diluciones de un perfume se hacen. Un animal inocente entonces investiga una sola dilución del aroma y el tiempo total de exploración (a menos de 3 minutos) se registra. Diluciones múltiples de la fragancia son probados en diferentes temas, ingenuo y el tiempo total de exploración se utiliza para generar las curvas de dosis-respuesta para cada grupo de ratones. Dos investigadores deben participar en las pruebas, con una ciega a los genotipos tema y / o condición. Investigador principal <ol><li> Obtener cuatro jaulas limpias (8 x 10 x W 18 L, en pulgadas), sin ropa de cama. Alinee las cuatro jaulas en la cabina de bioseguridad. </li><li> Configurar las particiones entre cada escena con papel de filtro opaco. Colocar un cartel negro en la partición final de tal manera que las líneas laterales del lado negro y el fondo de la jaula. Cubra la parte superior de la arena con un pedazo de plexiglás transparente para permitir la luz para iluminar la arena. (A) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_8/figure1new.png" alt="Figura 1" /> (B) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_9/image15.png" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Arena Set-Up. (A) estar bien cubierto, arena vacía (b) Arena con papel de filtro sujeto y perfumadas. </li> <li> Comience habituar a los sujetos. Coloque el primer tema en la primera jaula de habituación. Después de 15 minutos, mueva el primer tema de la segunda jaula. Limpie la jaula primero con TB Quatricide. Luego, coloque la segunda asignatura en la primera jaula, limpiar. Continuar este proceso con los temas siguientes. En última instancia, cada individuo debe ser habituado en las tres jaulas antes de ser colocado en la arena (caja de cuarta y final) por otros 15 minutos de habituación antes de la prueba. </li></ol> Investigador ciego <ol><li> Hacer un número apropiado de 2 pulgadas por 2 pulgadas cuadrados de papel de filtro para las muestras de perfume. </li><li> Utilizando el aroma pre-seleccionados, debidamente diluirlo. Para las muestras hidrofóbicas tales como mantequilla de maní, el uso del petróleo como solvente, para todos los demás, el uso de agua destilada. Vortex. </li><li> Establecer un dispositivo de grabación de video digital en el otro extremo de la cabina de bioseguridad de tal manera que al final toda la jaula está en foco. Grabar un vídeo previo a garantizar los parámetros son los adecuados. </li><li> Registrar el orden en que las diluciones se pondrá a prueba, teniendo cuidado al azar el orden de los ensayos. </li><li> Individuo del registro de la basura y los números de identificación. </li><li> Una vez que el tema se ha acostumbrado durante 15 minutos en el terreno, comenzar la preparación para la primera prueba. Pipeta de la primera dilución arriba y hacia abajo en el tubo cónico que antes de pipetear en un cuadrado de papel de filtro. La superficie de papel de filtro debe cubrir de manera óptima y el 85% (aproximadamente 0,50 ml de solución). Use un Kimwipe para asegurarse de que el papel de filtro no es demasiado saturado. </li><li> Iniciar la grabación de vídeo. </li><li> Coloque el cuadrado de papel de filtro en la caja en el extremo opuesto de la posición actual del animal. </li><li> Empezar a cronometrar. </li><li> Después de 3 minutos, detenga la grabación y quitar el olor a diluirse. </li><li> Si sólo hay un olor (por ejemplo, la canela) se va a probar, eliminar la materia primera prueba de la arena. Repita los pasos 6-11 para cada animal, adecuada dilución de la esencia de cada tema. Si más de un olor se va a probar, sin embargo, no retire el sujeto de la prueba de la arena. En su lugar, empezar a cronometrar. </li><li> Adecuadamente diluir el olor siguiente con los mismos métodos que se enumeran más arriba. </li><li> Después de 1 minuto, inicie la grabación de vídeo. Coloque el cuadrado de papel de filtro con la dilución de la próxima fragancia de la jaula en el extremo opuesto de la positio actual de los animalesn. </li><li> Repita los pasos 6-13 para cada aroma, teniendo en cuenta el número de archivos de vídeo para cada ensayo. </li><li> Repita los pasos 6-14 para cada tema. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_10/image2new.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Los resultados representativos para una sesión de pruebas de sensibilidad olfativa. Cada ratón, ya sea del grupo de control (Grupo A) o el grupo experimental (grupo B) fue expuesto a una de las cinco distintas diluciones de extracto de canela en papel de filtro por su parte, la sesión de tres minutos. El tiempo total dedicado a explorar el papel de filtro se evalúa. Los ratones del grupo A tienen una mayor sensibilidad olfativa que los del grupo B. </li></ol> Prueba de preferencia olfativa Esta prueba está diseñada para identificar las deficiencias específicas de detección, es decir, la capacidad de detectar olores atractivo o repulsivo. El siguiente procedimiento toma libremente del protocolo de Kobayakawa, K., et al3. Una vez más, dos investigadores deben participar en las pruebas, con una ciega a los genotipos tema y / o condición. El tiempo total de exploración se registra de nuevo (al ver video) para varios olores. Los olores con un total de tiempos de exploración más que el agua se designan como &quot;atractivo&quot;, mientras que aquellos con tiempos de menos de agua que se denomina &quot;aversión&quot;. La investigadora examina si los olores mismo son &quot;atractivos&quot; o &quot;desagradable&quot; para los sujetos de prueba diferentes. Por favor, siga los pasos 1-3 en la sección de pruebas de sensibilidad olfativa para el investigador principal. Investigador ciegos El procedimiento para la prueba de preferencia olfativa es el mismo, con ligeras modificaciones de los pasos 2 y 4. Por favor, siga los pasos 1-15 en la sección de pruebas de sensibilidad olfativa para el investigador ciego, con los cambios siguientes: Para el paso 2, con los olores pre-seleccionados (una combinación de aromas atractivos y aversivo), hacen que las soluciones adecuadamente diluida de cada uno en tubos cónicos. Para las muestras hidrofóbicas tales como mantequilla de maní, el uso del petróleo como solvente, para todos los demás, el uso de agua destilada. Vortex. Para el paso 4, en lugar de grabación de la dilución a ensayar, grabar la orden de los aromas variados que se pondrá a prueba, asignaron al azar el orden de los ensayos. Esta prueba está diseñada para identificar las deficiencias específicas de detección, es decir, la capacidad de detectar olores atractivo o repulsivo. El siguiente procedimiento toma libremente del protocolo de Kobayakawa, K. et al. 3. Una vez más, dos investigadores deben participar en las pruebas, con una ciega a los genotipos tema y / o condición. El tiempo total de exploración se registra de nuevo (al ver video) para varios olores. Los olores con un total de tiempos de exploración más que el agua se designan como &quot;atractivo&quot;, mientras que aquellos con tiempos de menos de agua que se denomina &quot;aversión&quot;. La investigadora examina si los olores mismo son &quot;atractivos&quot; o &quot;desagradable&quot; para los sujetos de prueba diferentes. Por favor, siga los pasos 1-3 en la sección de pruebas de sensibilidad olfativa para el investigador principal. Investigador ciegos El procedimiento para la prueba de preferencia olfativa es el mismo, con ligeras modificaciones de los pasos 2, 4 y 13. Por favor, siga los pasos 1-15 en la sección de pruebas de sensibilidad olfativa para el investigador ciego, con los cambios siguientes: Para el paso 2, con los olores pre-seleccionados (una combinación de aromas atractivos y aversivo), hacen que las soluciones adecuadamente diluida de cada uno en tubos cónicos. Para las muestras hidrofóbicas tales como mantequilla de maní, el uso del petróleo como solvente, para todos los demás, el uso de agua destilada. Vortex. Para el paso 4, en lugar de grabación de la dilución a ensayar, grabar la orden de los aromas variados que se pondrá a prueba, asignaron al azar el orden en cada ensayo. Para el paso 13, el lugar de la plaza de papel de filtro con el olor siguiente en la jaula en el extremo opuesto de la posición actual del animal. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_11/image3new.png" alt="Figura 3" /> Figura 3. Los resultados representativos para una sesión de pruebas de las preferencias olfativas. Cada ratón fue expuesto a cada uno de los diferentes aromas en papel de filtro por su parte, la sesión de tres minutos. El tiempo total dedicado a explorar el papel de filtro se evalúa. La mantequilla de maní y vainilla son los olores atractivos (aroma tiempo de exploración&gt; agua de tiempo de exploración) y 2-metilbutirato ácido es aversivo (aroma tiempo de exploración &lt;agua de tiempo de exploración). La puntuación de las pruebas olfativas Después de adquirir toda la sensibilidad olfativa y videos preferencia, es necesario analizar el tiempo total dedicado a explorar cada dilución / olor. Tiene el investigador ciego analizar todos los videos de la coherencia. <ol><li> Vista previa de la video, teniendo en cuenta lo siguiente: a) cuando el papel de filtro se coloca en el campo, b) cuando el ratón se acerca al papel de filtro, c) cuando el ratón se investiga el papel de filtro y d) cuando han transcurrido tres minutos (a partir de cuando el filtro papel fue colocado en la arena). Saber cuándo se centran en el comportamiento del ratón hace que sea más fácil de marcar con precisión el tiempo total dedicado a explorar después de la revisión. </li><li> Revisar el video. Tenga en cuenta el momento en que el primer ratón investiga el papel de filtro (latencia). </li><li> Con un cronómetro, el tiempo de todas las investigaciones a los tres minutos de colocar el papel de filtro en la arena. El momento de la investigación se define como cualquier momento en las fosas nasales del ratón son &lt;1 mm del papel de filtro. Es importante no incluir ninguna de las veces cuando el ratón está muy cerca del papel de filtro, pero no está activamente investigando. No incluyen episodios de masticar y lamer el papel o los combates de sentarse en el papel en el tiempo de exploración total. Es necesario adherirse firmemente y constantemente a estas reglas para analizar con precisión el comportamiento olfativo. </li><li> Un tiempo récord de latencia, el tiempo total dedicado a investigar el papel de filtro y el número de archivos de vídeo. </li></ol>

<ol>
	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What&amp;rsquo;s+Wrong+with+my+Mouse?+Behavioral+Phenotyping+of+Transgenic+and+Knockout+Mice.">What&amp;rsquo;s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice.</a> , 42-60 (2007).</li><li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+observational+assessment:+Ia.+A+systematic,+quantitative+procedure+for+assessing+the+behavioral+and+physiologic+state+of+the+mouse.">Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.</a> Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).</li><li>Kobayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb.">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450, 503-508 (2007).</li></ol>

Las pruebas anteriores permiten la evaluación rápida y fiable de la función olfatoria básica. No debe pasarse por alto, sin embargo, que esta fiabilidad exige la adecuada selección y preparación de materias para la prueba. Los animales enfermos o incapacitados de lo contrario son a menudo sujetos inconsistentes. Además, la habituación de los sujetos de prueba es la clave. Hemos encontrado que el uso de varias jaulas durante el proceso de habituación permite que los animales se sientan cómodos con el manejo exp...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methylbutyric acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>W269506</td>
<td>Concentrations Used:9.16 x 10-1 &#x2013; 10-8 M 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pure Vanilla Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Unilever</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Cinnamon Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil, light</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>O121-1</td>
<td>Concentrations Used:N/A</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

olfactory behavioral testing in the adult mouse

El sistema olfativo de roedores es de interés creciente para los científicos, estudió, en parte, a la biología de sistemas, debido a su sistema de circuitos estereotipados, pero accesible. Además, la capacidad única de esta zona para generar nuevas neuronas durante la vida de un organismo lo convierte en un atractivo sistema para los biólogos del desarrollo y la regeneración por igual. Ese interés hace necesario un medio para una evaluación rápida, pero confiable de la función olfatoria. Muchas pruebas de la capacidad olfativa es compleja, variable o no diseñados específicamente para los ratones. Además, algunas pruebas son sensibles a los déficits de memoria, así como defectos en la capacidad olfativa, confundiendo a los resultados obtenidos. Aquí se describe una batería simple de pruebas diseñadas para detectar defectos en la sensibilidad olfativa y la preferencia. En primer lugar, una evaluación inicial de la salud en general permite la identificación de los animales adecuados para su análisis posterior. En segundo lugar, los ratones son expuestos a diferentes diluciones de los olores para determinar si hay una diferencia de umbral. En tercer lugar, los ratones se presentan con varios olores, atractivo y desagradable, que permitan la evaluación de las preferencias olfativas. Estos estudios simples que hacen la caracterización inicial de comportamiento olfativo accesible para los laboratorios de la variedad de recursos y la experiencia.

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Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

Propiedades fundamentales, sin embargo, exclusiva del sistema olfativo de roedores han llevado a su estudio cada vez mayor entre los biólogos. Una evaluación relativamente simple de su función se necesita también. A continuación se describen las pruebas sensibles para la caracterización de la sensibilidad del ratón olfativo y preferencias.

Pruebas del comportamiento olfativo en el ratón adulto

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

olfactory-behavioral-testing-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K vistas.  Dana Farber Cancer Institute. Propiedades fundamentales, sin embargo, exclusiva del sistema olfativo de roedores han llevado a su estudio cada vez mayor entre los biólogos. Una evaluación relativamente simple de su función se necesita también. A continuación se describen las pruebas sensibles para la caracterización de la sensibilidad del ratón olfativo y preferencias.

Video: Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Investigación

Biología

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage adultos de pez cebra

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...