This protocol follows any and all animal care and use guidelines and regulations set by IACUC at the University of Cincinnati. This work is funded by NIH/NINDS NS07722 and the Gardner Family Center for Parkinson&#8217;s Disease and Movement Disorders.

Alle Schritte des Protokolls folgen der Tierpflege und verwenden Richtlinien und Vorschriften durch die IACUC von der Universität von Cincinnati eingestellt. 1. Allgemeine Überlegungen <ol><li> Wenn möglich, testen Mäusen während ihrer aktiven Phase in der Dunkel-Zyklus. Typischerweise führen Tests unter schlechten Licht und mindestens 1 Stunde in den dunklen Zyklus. Allerdings, wenn Prüfung in der Dunkel-Zyklus nicht möglich ist, führen alle drei Tests während der Lichtzyklus. Beachten Sie, dass schnüffeln mal abnehmen kann, wenn die Mäuse während der Schlafzyklus getestet werden. HINWEIS: Während des Tests kann während der Schlafzyklus durchgeführt werden, können die Mäuse weniger Interesse an der vergrabenen Pellet, Blöcke, oder Duftpatrone zu zeigen. </li><li> Um eine Wirkung von außen olfaktorischen Signale zu reduzieren, tragen einen Basis Paar Handschuhe zu allen Zeiten überall in jedem Test und legen Sie dann ein sauberes Paar Handschuhe über das Basenpaar für jede Maus und jedes Gericht. Als allgemeine Regel gilt, wenn Sie Zweifel haben, setzen auf eine saubere Reihe von Handschuhen. Haben eine Schachtel mit Handschuhen lesenily verfügbar, da sie häufig gewechselt werden. HINWEIS: Wir verwenden Handschuhe aus Nitril für alle Tier Handhabung. </li><li> Reinigung Testmaterialien und Käfige zwischen Probanden mit einem Desinfektionsmittel / Sterilisationsmittel ist auch ein wichtiger Schritt in diese Reihe von Tests, um das Potenzial für die Verbreitung von Krankheiten zu reduzieren sowie zu entfernen unerwünschte Geruchssinn. </li></ol> 2. Buried Pellet-Test <ol><li> Mindestens zwei Tage vor der Prüfung erfassen das Gewicht der einzelnen Maus und Nahrung zu 90% des Körpergewichts zu beschränken. Vor der Prüfung und bei der Lebensmittelbeschränkung, geben jedem Maus 1-2 Stücke der Pellets während des Tests verwendet werden (zB ein Stück von gesüßten Cerealien). Überspringen Sie diesen Schritt nicht, weil Mäuse sind neophobic mit Nahrung und können nicht für die Pellet während des Tests zu suchen, wenn sie vorher nicht gegessen der Pellets. </li><li> Auf allen Testtagen, zu gewöhnen die Mäuse für 1 Stunde vor der Prüfung, indem sie ihre Käfig in den Testraum ohne Wasserflasche oder Feeder-bin. Haus sie in ihren eigenen Käfig mit nur einem Filter Deckel. </li><li> Während Gewöhnung, eine saubere Maus Käfig ~ 3 cm hoch mit sauberen Betten mit dem bestimmte die Bettwäsche wird gleichmäßig über den Käfig verteilt. Stellen Sie einen Timer für 5 min. </li><li> Nach 1 Stunde der Gewöhnung, begraben 1 gesüßt Getreide Pellet 0,5 cm unter dem Bettzeug, so dass es nicht sichtbar ist. </li><li> Entnehmen Sie die Test Maus aus ihrem Käfig, legen Sie sie in der Mitte des Testkäfig, setzen Sie den Filter Deckel auf den Käfig und starten Sie den Timer. </li><li> Stoppen Sie den Timer, wenn die Maus entdeckt das Pellet und beginnt zu essen. Beachten Sie die Zeit, um das Pellet begraben aufzudecken. </li><li> Wenn die Maus nicht das Pellet in 5 min zu finden, beenden Sie den Versuch und beachten Sie eine Punktzahl von 300 Sekunden für die Maus. Bewegen Sie den Pellet an die Spitze der Einstreu, so dass die Maus hat Zugang zu ihr, und lassen Sie die Maus, um die Pellets zu essen. </li><li> Nach der Studie, die Maus zurück in seinen Heimkäfig. </li><li> Das Bettzeug aus dem Testkäfig entleeren und reinigen Sie die cAlter mit Tierraum Reinigungslösung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,9 für jede Maus und Handschuhe vor und nach jeder Maus ändern. </li><li> Nachdem alle Mäuse getestet werden, geben ihnen nur genug zu essen, um sie bei 90% Körpergewicht zu halten. </li><li> Führen Sie die Tests an den Tagen 2-5 auf die gleiche Weise als Test Tag 1 mit einer Ausnahme; begraben das Pellet in einem anderen Ort in den Käfig für jeden Versuch. </li><li> Am Testtag 6, führen Sie die Oberfläche Pellet-Studie. </li><li> Für die Oberflächen Pellet-Studie, nach dem gleichen Verfahren für die Prüfung Tag 1, aber statt zu begraben das Pellet unter dem Bettzeug legen Sie es auf der Bettwäsche. Notieren Sie sich die Zeit für die Maus zu finden und anfangen zu essen das Pellet. </li></ol> 3. Block Test <ol><li> Hausmäuse einzeln in saubere Käfige und legen 5 Blocks in den Käfig (mit der Bezeichnung AE), Handschuhwechsel vor der Einrichtung jeden Käfig. </li><li> Führen Sie den Test 24 Stunden später. Bewegen Testmäuse auf den Testbereich, entfernen Sie die Wasserflasche und Feeder bin, und legen all 5 Blöcke aus dem Käfig zusammen mit einer Handvoll von Bettwäsche in einen Plastikbeutel mit Ausweis des Tieres bezeichnet. Legen Sie den verschlossenen Plastikbeutel auf der Oberseite der Maus zu Hause Käfig. </li><li> Gewöhnen die Tiere in ihrem Heimkäfig ohne Wasserflasche, Feeder bin und Blöcke 1 Stunde vor der Prüfung. </li><li> Handschuhe zwischen jedem Käfig so zu ändern, dass die Düfte nicht zwischen Tieren / Blöcke ausgetauscht. </li><li> Richten Sie die Maus Käfige nebeneinander auf einem Tisch mit mindestens 10 cm zwischen den einzelnen Käfig. Positionieren Sie eine Videokamera, so dass die vor dem Käfig (nicht die lange Seite des Käfigs) in klare Sicht. </li><li> Stellen Sie den Timer für 30 Sekunden und beschriften Sie eine Karte mit den wichtigen Experiment (Datum, Maus ID, Versuch, etc.). Videoband das Label für 2-3 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie Blöcke AD aus dem Plastikbeutel mit Identifikation, die Maus und legen Sie sie in der Mitte des Käfigs, so dass sie deutlich auf der Videokamera sichtbar. Vergewissern Sie sich, ~ 1 cm of Raum zwischen jedem der Blöcke. Setzen Sie den Filter nach oben zurück auf den Käfig. Starten Sie den Timer und Video für 30 Sekunden. </li><li> Nach 30 sec, stoppen Sie die Aufnahme, und entfernen Sie die Blöcke aus dem Käfig und legt sie zurück in den Plastikbeutel. </li><li> Handschuhe wechseln und fahren Sie dann mit der nächsten Maus, Wiederholung des gleichen Verfahrens für den ersten Versuch verwendet. Tun Sie dies für insgesamt 6 Studien für jede Maus dafür, dass es eine inter-Testintervall von ~ 5 min. </li><li> Am 7. Versuch, den gleichen Vorgang für die Versuche 1-6, außer zu bringen, anstatt Block D von der Maus den eigenen Käfig hinzufügen Block E von einer anderen Maus Käfig, so dass die Maus auf die Blöcke A, B, und C aus seiner ausgesetzt eigenen Käfig und Block E von einer anderen Maus Käfig. Hinweis im Labor Buch, dessen Block E jede Maus an und stell wo Block E ist in jeder Maus Käfig (zB ABCE oder AEBC) platziert ausgesetzt. Nehmen Block E von einer Maus des gleichen Geschlechts, aber nicht von einem ursprünglichen cagemate. Videotape für 30 sek. </li><li> Nach den 7 Studien zurück Tieren zu einem neuen sauberen Käfig mit ihren ursprünglichen Käfiggefährten. Sauber Blöcke im Test mit einem milden Reinigungsmittel und Wasser verwendet und an der Luft trocknen für den Einsatz in späteren Tests. </li></ol> 4. Gewöhnung / Entwöhnung <ol><li> Führen Sie die Gewöhnung / Entwöhnung Test in einer ähnlichen Weise wie die Block-Test aber statt mit Blöcken, die den Geruch einer Maus haben, verwenden Gewebekassetten halten Baumwolle mit verschiedenen Paaren von Extrakten duftend. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.1-3.4 mit einem einzigen, fusselfreien Tuch Kartusche statt der Blöcke. </li><li> Gewöhnen Mäuse in den Testraum. </li><li> Die duftenden Gewebekassetten herzustellen, in einem separaten Raum. Setzen Sie einen kleinen Wattebausch in einen sauberen Patrone und fügen Sie dann 5 ul-Extrakt (zB Mandelextrakt) in die Baumwolle. Lassen Sie die Patrone oben über der Baumwolle und in einer eigenen Box oder Tasche mit dem Duft markiert. </li><li> Machen Sie dasselbe Verfahren foder eine zweite Duft (zB Anis-Extrakt). Handschuhe zwischen Umgang mit verschiedenen Düften ändern. Sicherstellen, dass der Wattebausch ist vollständig in das Gewebe Kartusche eingeschlossen. HINWEIS: Exposed Fasern aus dem Wattebausch kann dazu führen, das Tier, das Interesse an der Wattebausch zum Nisten Zwecke statt der Duft selbst haben. </li><li> Dann folgen Sie den Schritten von 3,6 bis 3,10 mit einem duftenden Gewebekassette für die ersten sechs Studien, die zweite Duftpatrone Gewebe für die siebte Studie. </li></ol> 5. Analyse der Videobänder <ol><li> Für den Block und Gewöhnung / Entwöhnung Tests haben eine Rater blind für experimentelle Bedingung messen die Zeit damit verbracht, schnüffeln jeden Block, mit Sniffing definiert als Nasen Kontakt mit diesem Block. Falls gewünscht, messen andere Verhaltensweisen wie Zeit, um die neuen Block (E) während des Test 7 und die Gesamtaktivität (die Anzahl der Bewegungen entlang der Länge und Breite des Heimkäfig) während jedes Test nähern. Ergebnis der aufgewendeten Zeit ein Schnüffelnd Zeit, sich von dem Videoband mit einer Stoppuhr zu nähern. </li><li> Ebenso für die Gewöhnung / Entwöhnung Test, haben ein Rater blind für experimentelle Bedingung messen die Zeit damit verbracht, schnupperte in die Patrone, die Zeit, die Patrone, und der Bewegungsaktivität zu nähern. </li></ol> 6. Statistik <ol><li> Analysieren Sie den Test mit Pellet begraben Nichtparametrische Statistik, da die Latenzzeit des Pellets dazu tendieren, Heterogenität der Varianz zeigen, zu finden. Mitteln die Latenz um das Pellet in 3-5 Tagen zu lokalisieren und dann vergleichen Sie zwischen Gruppen von Mäusen mit Hilfe eines Mann-Whitney-U-Test. Ähnlich zur Oberflächen Pellet Teil des Tests analysieren Latenz, um das Pellet zu finden unter Verwendung eines Mann-Whitney-U-Test, um Genotypen zu vergleichen. </li><li> Für den Block Test, Analyse der Daten von Test 7 (Einführung der neuen duftenden Block). Typischerweise beschäftigen nichtparametrische Analysen, um Heterogenität der Varianz erklären. Um Unterschiede in der Zeit analysieren verbrachte schnüffeln the Roman Block als auch Zeit, um die Blöcke für verschiedene Versuchsgruppen nähern, verwenden Sie den Mann-Whitney-U-Test. Verwenden Sie den Wilcoxon-Test zu Zeit verbrachte Sniffing den Roman Block zu Zeit verbrachte schnüffeln die bekannten Blöcke zu vergleichen. </li><li> Für die Gewöhnung / Dishabituation Test analysiert Verhalten para auf Versuchen 1, 6 und 7, ähnlich zu früheren Studien 20. Wenn Mäuse zeigen wenig bis kein Schnüffeln, verwenden Sie nicht-parametrische Analysen. </li></ol>

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We have no conflicts of interest.

Jede der in dieser Studie beschriebenen Tests messen verschiedene Aspekte der Riech in Mäusen. Die vergrabene Pellet-Test misst die Lebensmittel Motivation Aspekt des Geruchssinns, die Prüfung der Fähigkeit von Hunger (Lebensmittel beschränkt ist, nicht Nahrung entzogen) Mäusen, um eine schmackhafte Stück gesüßt Getreide unter Betten begraben zu erkennen. Der Block Test misst mehr der soziale Aspekt der Riechfunktion, die Prüfung der Fähigkeit von Mäusen, zwischen ihren eigenen Duft und die eines Artgenossen zu unterscheiden. Die Gewöhnung / Entwöhnung Test bewertet die Fähigkeit der Maus, zwischen bekannten und neuartigen, harmlosen Düften zu unterscheiden. Mit mehreren Tests ist wichtig, bei der Charakterisierung eines neuen Modells, weil Anomalien in der Lebensmittel Motivation oder Angst könnte in mutierten Mäusen beobachtet im Vergleich zu Kontrollen Unterschiede beitragen. Zum Beispiel, wenn nur der Block Test durchgeführt und verringerte Schnüffeln des Blocks, der den Geruch eines anderen Maus beobachtet wurde, ist es unklar, ob eine Olfactcher Defizit oder eine verbesserte Reaktion auf die Angst vor Artgenossen, die auf die Vermeidung von diesem Block führen kann. Wenn mehrere Tests durchgeführt und Defizite in allen Tests beobachtet, es unterstützt nachdrücklich eine Interpretation der Geruchsminderung. Allerdings, wenn Unterschiede in nur einem Test, nicht aber die anderen beobachtet, dann kann es zu einer Geruchsminderung subtiler sein, aber es ist unerlässlich, um auszuschließen, andere Erklärungen (dh, erweiterte Angst oder reduzierte Nahrungs Motivation). Weitere wichtige Faktoren im Auge zu behalten, wenn die Prüfung Riechfunktion Mäuse gehören die Hintergrundstamm und Geschlecht der Mäuse. Unterschiedlichen genetischen Hintergrund Stämme (dh C57BL / 6, DBA, etc.) können tief greifende Auswirkungen auf das Verhalten der Maus daher, empfiehlt es sich, jedes Protokoll in Wildtyp-Mäusen aus dem gleichen Hintergrund vor der Durchführung des gesamten Experiments anzupassen. Es wird auch empfohlen, dass männliche und weibliche Mäuse getrennt voneinander getestet, da das männliche olfaktorischen Systems hoch istly empfindlich auf Frauen in Östrus und olfaktorische Erkennung einer Frau in Östrus konnte mit der Leistung in allen drei Tests stören. Einige Schritte sind absolut entscheidend, wenn bei der Prüfung Geruchssinn bei Mäusen zu folgen. Es ist wichtig, bewusst die Gerüche der Experimentator an die Tiere einzuführen ist. Tragen von Handschuhen für die Verfahren ist wesentlich und häufigen Wechseln der Handschuhe zwischen Tieren erforderlich ist. Es ist immer eine gute Übung für den Experimentator nicht nach Köln oder Parfüm auf den Geruchssinn Testtage tragen. Obwohl einige Teile des Verfahrens unflexibel sind, gibt es andere Teile, die modifiziert und angepaßt werden kann, ohne die Gültigkeit oder die Empfindlichkeit des Tests. Zum Beispiel kann die Anzahl der Gewöhnungsversuche erhöht oder verringert werden, je nach Stamm von Mäusen getestet und wie schnell sie auf die Stimuli zu gewöhnen. Die Haupteinschränkung dieser Tests ist, dass sie alle durch eine Form der Motivation angetrieben, dass es Nahrungsmittel oder sozialen, dasses schwierig, völlig aus, Anomalien in der Motivation als Erklärung, wenn eine veränderte Reaktion beobachtet. Dies kann durch Analysieren von zusätzlichen Parametern, wie Aktivität während des Testens und der Zeit auf Reize Ansatz minimiert werden. Einmal gemeistert, können die Tests leicht bei der Prüfung des Phänotyps der neuen Mausmodellen von neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Tests, die die höchste Macht haben in präklinischen Studien testet potentielle Therapeutika enthalten sein (für ein Beispiel siehe ref. 25).

Riechstörungen auf einer Vielzahl von neurodegenerativen Störungen, einschließlich Parkinson-Krankheit (PD), Alzheimer-Krankheit und Huntington-Krankheit 1 verbunden. In PD, Riechstörungen sind Defizite bei der Geruchsidentifikation, Detektion und Diskriminierung und werden in bis zu 70-95% der Patienten 2-5 gefunden. Diese Defizite können die Kardinal motorischen Symptome von Parkinson durch bis zu 4 Jahre vorausgehen, was darauf hinweist, dass Riechstörungen können die frühen Stadien der PD 6-10 signalisieren. Das frühe Auftreten von Riechdefizite PD hat zu einem großen Interesse an Riechstörungen und den zugrunde liegenden Mechanismen geführt. In präklinischen Studien an Nagern, könnte Riechstörungen ein sensibler Ergebnis Maßnahme, um das therapeutische Potenzial von neuen therapeutischen Strategien vorherzusagen. Viele Tests wurden entwickelt und umfassend genutzt, um sensomotorischen Beeinträchtigungen in Nagetiermodellen der PD und TES charakterisierent das therapeutische Potenzial von neuartigen Behandlungen 11-15. Auch wenn olfaktorische Defizite sind in PD dokumentiert, Geruchs-Funktion wurde nicht routinemäßig in vielen Modellen gemessen. Diese Ansicht ändert sich aber mit der Entdeckung des genetischen Formen der PD und der Vorstellung, dass mehr akzeptiert PD ist eine systemische Erkrankung, die mehr als nur Sensomotorik. Derzeit gibt es zahlreiche Studien, in der genetischen Mausmodellen der PD und andere neurodegenerative Erkrankungen, die jetzt eine Analyse der Geruchssinn bei der Charakterisierung 16-24. Angesichts des wachsenden Interesses von Riechstörungen bei neurodegenerativen Erkrankungen, haben wir versucht, eine Batterie von Tests, die olfaktorischen verwendet werden können, um neue Modelle der Neurodegeneration sowie Testpotential krankheitsverändernden Therapien in präklinischen Studien charakterisieren zu montieren. Die in der vorliegenden Studie beschriebenen Tests wurden sowohl die Charakterisierung und präklinische Studien 18,25 eingesetzt. Die Tests highlIn dieser Studie wurde gezeigt, ighted in Detektieren Riechstörungen in einem häufig verwendeten alpha-Synuclein-überexprimierenden Maus-Modell der Parkinson-Krankheit 18 empfindlich. Sie umfassen die Test begraben Pellet 26,27, eine angepasste Version des Blocks Test 23,24,28,29, und die Gewöhnung / Entwöhnung Test 30. Es ist wichtig zu beachten, dass es mehrere Anpassungen der in dieser Studie beschriebenen Tests, die empfindlich Maßnahmen Riech bei Mäusen, die, die in dieser Studie werden die Tests Unser Labor hat die meiste Erfahrung mit und routinemäßig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Cap&#39;n Crunch</td>
			<td style="width:88px;">Quaker Oats</td>
			<td align="right" style="width:88px;">3E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Wooden Blocks</td>
			<td style="width:88px;">Lara&#8217;s Crafts</td>
			<td align="right" style="width:88px;">10144</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="379" rowspan="6" style="height:379px;width:88px;">Flavor Extracts</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;">Kroger</td>
			<td style="width:88px;">Almond: 011110664716</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Anise: 011110615619</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Banana: 011110669919</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Coconut: 011110669889</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Lemon: 011110669957</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Orange: 0011110669964</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="59" rowspan="2" style="height:59px;width:88px;">Tissue Cartridges</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Z672122-500EA</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Manufactured by Simport no: M490-2</td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Cotton Balls</td>
			<td style="width:88px;">Kroger</td>
			<td align="right" style="width:88px;">1.1111E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Mouse Cages</td>
			<td style="width:88px;">Ancare</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">19 x 29 x 12.7 cm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Camcorder</td>
			<td style="width:88px;">Sony</td>
			<td style="width:88px;">&#160;HDR-HC9</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">MiniDV Tapes</td>
			<td style="width:88px;">Sony DVC premium</td>
			<td align="right" style="width:88px;">2.7243E+10</td>
			<td style="width:88px;">60 minute long play&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Die vergrabenen Pellet Block und Gewöhnung / Dishabituation Tests sind sehr vorteilhaft Auswertungen des Geruchssinns bei Mäusen. Unter Verwendung dieser Tests haben wir signifikante Veränderungen in den Geruchssinn in mehreren genetischen Mausmodellen der Parkinson-Krankheit, einschließlich alpha-Synuclein-überexprimierenden (Thy1-ASYN) 18 und ATP13A2 Knockout-Mäusen gefunden. Beide Thy1-ASYN und ATP13A2 Knockout-Mäuse länger dauern, bis das Pellet begraben als die Kontrollen 18 zu finden. Abbildungen 1-3 zeigen Daten aus Wildtyp-und Knockout-Mäusen ATP13A2 gesammelt. In der vergrabenen Pellet-Test, ATP13A2 Knockout-Mäuse zeigen eine erhöhte Latenzzeit, um die vergrabene Pellet Vergleich zum Wildtyp Kontrollmäusen (Abbildung 1) zu finden. Im Block Test sowohl Wildtyp-und Knockout-Mäusen ATP13A2 schnüffeln den Roman Block von einer anderen Maus Käfig verglichen, um Blöcke von zu Hause Käfig (Abbildung 2). In der Gewöhnung / Entwöhnung Testwildtyp-Mäusen zeigen, Gewöhnung an einen Geruch und<html> dann erhöht, wenn ein Roman schnüffelt Geruch wird eingeführt (Abbildung 3). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Buried Pellet-Test. Latenz, um das Pellet in Wildtyp-(n = 10) und ATP13A2 KO (n = 14) bei 20-27 m Alter zu finden. * P &lt;0,05, Mann-Whitney-U <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Blockprüfung Zeit belauscht das neue Block (E) in der Blocktest in Wildtyp-(n = 10) und ATP13A2 KO (n = 12) weiblichen Mäusen bei 20 -. 27m alt. ΔΔ eine p &lt;0,01 im Vergleich zu den Blöcken A, B und C aus dem gleichen Genotyp. Mann-Whitney U &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 3. Die Gewöhnung / Entwöhnung Test. Mittlere Zeit sniffing eine Duftpatrone in Wildtyp-Mäusen (Alter 9 m, n = 7) auf 6 Versuche und die Einführung einer Patrone mit einem neuen Duft auf Probe 7.

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Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Riech Assays für Mausmodelle für Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

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21.8K Aufrufe.  University of Cincinnati. Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Serie: Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Forschung

Neurowissenschaften

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Beurteilung der Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke durch intravenöse Infusion von FITC-markierte Albumin in einem Mausmodell der Neurodegenerative Erkrankung

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.