This protocol follows any and all animal care and use guidelines and regulations set by IACUC at the University of Cincinnati. This work is funded by NIH/NINDS NS07722 and the Gardner Family Center for Parkinson&#8217;s Disease and Movement Disorders.

Tutte le fasi del protocollo seguono la cura degli animali e l&#39;uso di linee guida e regolamenti stabiliti dal IACUC dell&#39;Università di Cincinnati. 1. Considerazioni generali <ol><li> Se possibile, testare topi durante la fase attiva del ciclo buio. Tipicamente, eseguire test in condizioni di scarsa luce e almeno 1 ora nel ciclo buio. Tuttavia, se il test nel ciclo buio non è fattibile, eseguire tutti e tre i test durante il ciclo di luce. Tenete a mente che i tempi di sniffing può diminuire quando i topi sono testati durante il loro ciclo di sonno. NOTA: Durante le prove possono essere eseguite durante il ciclo sonno i topi possono mostrare meno interesse per il pellet sepolta, blocchi, o la cartuccia profumata. </li><li> Al fine di ridurre eventuali effetti di stimoli olfattivi di fuori, indossare un paio di guanti di base in qualsiasi momento nel corso di ogni prova e poi posto un paio pulito di guanti sopra la coppia di base per ogni mouse e ogni prova. Come regola generale, in caso di dubbio, messo su un set pulito di guanti. Hanno una scatola di guanti leggereily disponibile in quanto saranno cambiati frequentemente. NOTA BENE: Usiamo guanti di nitrile per tutta la movimentazione degli animali. </li><li> Pulizia materiali di prova e le gabbie tra soggetti con un disinfettante / sterilizzante è anche un passo importante in questa serie di test al fine di ridurre il rischio di diffusione della malattia, nonché rimuovere stimoli olfattivi indesiderati. </li></ol> 2 Buried Pellet di prova <ol><li> Almeno due giorni prima del test, registrare il peso di ogni mouse e poi il cibo limitare al 90% del peso corporeo. Prima della prova e durante la restrizione alimentare, dare ogni mouse 1-2 pezzi di pellet da utilizzare durante la prova (ad esempio, un pezzo di cereali zuccherati). Non saltare questo passaggio perché i topi sono neophobic con il cibo e non possono cercare il pellet durante il test se non hanno mangiato il pellet in precedenza. </li><li> Su tutti i giorni di test, abituare i topi per 1 ora prima della prova ponendo loro gabbia in sala prove con bottiglia per l&#39;acqua o l&#39;alimentatore bin. loro casa nella loro gabbia a casa con un semplice coperchio superiore del filtro. </li><li> Durante l&#39;assuefazione, riempire una gabbia pulita topo ~ 3 cm di altezza con lenzuola pulite assicurandosi la biancheria da letto viene distribuito uniformemente in tutta la gabbia. Impostare un timer per 5 min. </li><li> Dopo 1 ora di assuefazione, seppellire 1 zuccherate pellet di cereali 0,5 centimetri sotto la biancheria da letto in modo che non sia visibile. </li><li> Rimuovere il mouse prova dalla gabbia casa, posizionarlo al centro della gabbia di prova, collocare il coperchio superiore del filtro sulla gabbia e avviare il timer. </li><li> Arrestare il timer quando il mouse scopre il pellet e inizia mangiarlo. Annotare il tempo per scoprire il pellet sepolta. </li><li> Se il mouse non trova il pellet entro 5 min, terminare il processo e notare un punteggio di 300 sec per questo mouse. Spostare il pellet alla parte superiore della biancheria da letto in modo che il mouse ha accesso ad esso, e lasciare il mouse per mangiare il pellet. </li><li> Dopo la prova, riportare il mouse per sua gabbia a casa. </li><li> Svuotare la biancheria dalla gabbia di prova e pulire il cetà, con soluzione detergente stanza degli animali. </li><li> Ripetere i passaggi 2,4-2,9 per ogni mouse, e cambiare i guanti prima e dopo ogni mouse. </li><li> Dopo che tutti i topi sono testati, dare loro abbastanza cibo per mantenerli al 90% del peso corporeo. </li><li> Eseguire il test nei giorni 2-5 allo stesso modo come il giorno di test 1 con una sola eccezione; seppellire il pellet in un punto diverso nella gabbia per ogni prova. </li><li> Il giorno 6 test, eseguire il processo pellet superficie. </li><li> Per la prova di pellet di superficie, seguire la stessa procedura per la giornata di test 1, ma invece di seppellire i pellet sotto la biancheria da letto è posto sulla parte superiore della biancheria da letto. Registrare il tempo per il mouse per trovare e iniziare a mangiare il pellet. </li></ol> 3 Block Test <ol><li> Casa individualmente topi in gabbie pulite e mettere 5 blocchi nella gabbia (etichetta AE), cambiare i guanti prima di configurare ogni gabbia. </li><li> Eseguire il test di 24 ore più tardi. Spostare i topi di prova per l&#39;area di prova, rimuovere la bottiglia di acqua e alimentatore bin, e posizionare all 5 isolati dalla gabbia insieme ad una manciata di biancheria da letto in un sacchetto di plastica etichettata con l&#39;identificazione dell&#39;animale. Posizionare il sacchetto di plastica sigillato sulla parte superiore della casa gabbia del mouse. </li><li> Abituare gli animali nella loro gabbia casa senza la bottiglia d&#39;acqua, alimentatore bin, e blocchi per 1 ora prima del test. </li><li> Cambiare i guanti tra ogni gabbia in modo che i profumi non vengono scambiati tra animali / blocchi. </li><li> Allineare le gabbie del mouse accanto all&#39;altro su un tavolo con almeno 10 cm tra ogni gabbia. Posizionare una videocamera in modo che la parte anteriore della gabbia (non il lato lungo della gabbia) è chiaramente visibile. </li><li> Impostare il timer per 30 secondi e l&#39;etichetta di una scheda con i dettagli importanti esperimenti (data, ID del mouse, prova, ecc). Videotape l&#39;etichetta per 2-3 sec. </li><li> Rimuovere i blocchi dC dal sacchetto di plastica con l&#39;identificazione che il mouse e metterli al centro della gabbia in modo che siano ben visibili sulla videocamera. Assicurarsi che vi sia ~ 1 cm Øf spazio tra ciascuno dei blocchi. Posizionare la parte superiore del filtro sulla gabbia. Avviare il timer e videotape per 30 sec. </li><li> Dopo 30 sec, interrompere la registrazione e rimuovere i blocchi dalla gabbia e metterli nuovamente dentro il sacchetto di plastica. </li><li> Cambiare i guanti e poi passare a quello successivo del mouse, ripetendo la stessa procedura utilizzata per la prima prova. Fate questo per un totale di 6 prove per ogni mouse assicurandosi che vi sia un intervallo inter-trial di ~ 5 min. </li><li> Al 7 ° prova, seguire la stessa procedura per le prove 1-6 tranne che invece di mettere blocco D dalla propria gabbia del mouse Aggiungi blocco E dalla gabbia di un altro mouse in modo che il mouse è esposto a blocchi A, B, C e dalla sua propria gabbia di casa e blocco E dalla gabbia di un altro mouse. Nota nel libro laboratorio il cui blocco E ogni mouse è esposto al blocco e alternativo dove E è posto in gabbia di ogni mouse (ad esempio, ABCE o AEBC). Prendere blocco e da un mouse dello stesso sesso, ma non da un cagemate originale. Videotape per 30 sec. </li><li> Dopo le 7 prove, ritorno animali ad una nuova gabbia pulita con i loro cagemates originali. Pulire blocchi utilizzati nel test con detergente delicato e acqua e lasciare asciugare all&#39;aria per l&#39;uso in test successivi. </li></ol> 4. assuefazione / Dishabituation <ol><li> Eseguire il test di assuefazione / Dishabituation in un modo simile al test di blocco, ma invece di usare blocchi che hanno l&#39;odore di un topo, utilizzare cartucce di tessuto in possesso di cotone profumato con diverse coppie di estratti. </li><li> Seguire i passaggi 3,1-3,4 utilizzando una sola cartuccia, inodore tessuti al posto dei blocchi. </li><li> Abituare topi in sala prove. </li><li> Preparare le cartucce dei tessuti profumati in una stanza separata. Mettere un piccolo batuffolo di cotone in una cartuccia pulita e poi aggiungere 5 ml di estratto (ad esempio, l&#39;estratto di mandorla) nel cotone. Agganciare la parte superiore della cartuccia sopra il cotone e posto in un box dedicato o borsa etichettato con quel profumo. </li><li> Eseguire la stessa procedura fo un secondo profumo (ad esempio, estratto di anice). Cambiare i guanti tra gestione di diversi profumi. Assicurarsi che il batuffolo di cotone è completamente racchiuso nella cartuccia del tessuto. NOTA: Esposto fibre della palla di cotone possono causare l&#39;animale ad avere interesse per la palla di cotone per scopi di nidificazione, piuttosto che il profumo stesso. </li><li> Quindi, seguire i passaggi 3,6-3,10 utilizzando una cartuccia tessuto profumato per le prime sei prove, e la seconda cartuccia tessuti profumati per la settima prova. </li></ol> 5 Analisi delle Videocassette <ol><li> Per il blocco e test di assuefazione / Dishabituation, hanno una cieca rater a condizione sperimentale misurare il tempo trascorso ad annusare ogni blocco, con sniffing definito come contatto nasale con quel blocco. Se lo si desidera, misurare altri comportamenti come il tempo di avvicinarsi al blocco romanzo (E) durante la prova di 7 e l&#39;attività totale (il numero di movimenti effettuati per tutta la lunghezza e la larghezza della gabbia casa) durante ogni prova. Punteggio ottenuto il tempo trascorso sniffing untempo d per avvicinarsi dalla videocassetta con un cronometro. </li><li> Allo stesso modo, per il test di assuefazione / Dishabituation, hanno una cieca rater a condizione sperimentale misurare il tempo trascorso ad annusare la cartuccia, il tempo di avvicinarsi alla cartuccia, e l&#39;attività locomotoria. </li></ol> 6. Statistiche <ol><li> Analizzare il test pellet sepolto utilizzando statistiche non parametriche perché la latenza per trovare il pellet punteggi tendono a mostrare l&#39;eterogeneità della varianza. Nella media la latenza per individuare il pellet attraverso giorni 3-5 e poi confrontare tra i gruppi di topi con una Mann-Whitney U-test. Analogamente, per la parte pellet superficie del test, analizzare la latenza per trovare il pellet con un Mann-Whitney U-test per confrontare genotipi. </li><li> Per la prova di blocco, analizzare i dati provenienti da Trial 7 (introduzione del blocco romanzo profumato). In genere, utilizzare le analisi non parametrici per spiegare l&#39;eterogeneità della varianza. Al fine di analizzare le differenze di tempo trascorso sniffing the romanzo blocco così come il tempo di affrontare i blocchi per i diversi gruppi sperimentali, utilizzare il Mann-Whitney U-test. Utilizzare il Wilcoxon rank test Firmato a confrontare il tempo speso ad annusare il romanzo blocco di tempo speso ad annusare i blocchi familiari. </li><li> Per la prova di assuefazione / Dishabituation, comportamento parametrico analisi su prove 1, 6 e 7, simile a studi precedenti 20. Se i topi mostrano poco o nessun sniffing, utilizzare le analisi non parametrici. </li></ol>

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We have no conflicts of interest.

Ciascuno dei test descritti in questo studio misurano diversi aspetti della funzione olfattiva nei topi. Il test di pellet sepolta misura l&#39;aspetto motivazione cibo di olfatto, testare la capacità di fame (cibo limitato, non cibo privati) topi per rilevare un pezzo appetibile di cereali zuccherati sepolto sotto biancheria da letto. Il test blocco misura più dell&#39;aspetto sociale della funzione olfattiva, per valutare la capacità dei topi di discriminare tra loro profumo e quella di un conspecifici. Il test di assuefazione / Dishabituation valuta la capacità del mouse per discriminare tra odori familiari e innocui romanzo,. L&#39;utilizzo di più test è importante nella caratterizzazione di un nuovo modello perché anomalie nei motivazione cibo o la paura potrebbero contribuire alle differenze osservate nei topi mutanti rispetto ai controlli. Ad esempio, se solo il test del blocco viene eseguito e diminuito sniffing del blocco che ha l&#39;odore di un altro mouse è osservato, non è chiaro se vi sia un Olfactdeficit ory o una risposta di paura migliorato per la conspecifici che può portare a scanso di quel blocco. Quando più i test vengono eseguiti e deficit si osservano in tutti i test, si sostiene con forza l&#39;interpretazione di impairment olfattiva. Tuttavia, se le differenze si osservano in un solo test, ma non gli altri, poi ci può essere una perdita olfattiva più sottile ma sarà indispensabile per escludere altre spiegazioni (ad esempio, una maggiore paura o motivazione cibo ridotto). Altri fattori importanti da tenere a mente durante la prova topi funzione olfattiva includono il ceppo di sfondo e il sesso dei topi. Diversi ceppi background genetico (cioè, C57BL / 6, DBA, ecc) possono avere effetti profondi sul comportamento del mouse quindi, si consiglia di adattare ogni protocollo in topi di tipo selvatico dello stesso fondo prima di eseguire l&#39;intero esperimento. Si raccomanda inoltre che topi maschi e femmine essere provati separatamente gli uni dagli altri, perché il sistema olfattivo maschile è altamente sensibile alle femmine in estro e la rilevazione olfattiva di una femmina in estro potrebbe interferire con le prestazioni in tutti e tre i test. Alcuni passi sono assolutamente fondamentale da seguire durante la prova dell&#39;olfatto nei topi. E &#39;importante essere consapevoli degli odori sperimentatore sta introducendo agli animali. Indossare i guanti per le procedure è richiesta cambio essenziale e frequente dei guanti tra gli animali. E &#39;sempre una buona pratica per lo sperimentatore di non indossare colonia o profumo nei giorni di test olfatto. Mentre alcune parti del procedimento sono inflessibili, ci sono altre parti che possono essere modificati e adattati senza ridurre la validità o la sensibilità del test. Ad esempio, il numero di prove assuefazione può essere aumentata o diminuita a seconda del ceppo di topi in prova e in quanto tempo si abituano agli stimoli. La principale limitazione di questi test è che sono tutti guidati da una qualche forma di motivazione, sia esso cibo o sociale, rendendodifficile escludere completamente anomalie in motivazione come una spiegazione quando una risposta alterata osservato. Questo può essere minimizzato analizzando parametri aggiuntivi, come l&#39;attività durante il test e il tempo di avvicinarsi stimoli. Una volta masterizzato, le prove possono essere facilmente utilizzati per esaminare il fenotipo di modelli nuovi murini di malattie neurodegenerative. Inoltre, i test che hanno la più alta potenza possono essere incluse in studi preclinici test potenziali terapie (per esempio vedi rif. 25).

La disfunzione olfattiva è legata a una serie di malattie neurodegenerative tra cui il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer e il morbo di Huntington 1. Nel PD, menomazioni olfattive comprendono deficit di identificazione odore, la rilevazione e la discriminazione e si trovano in fino al 70-95% dei pazienti 2-5. Questi deficit possono precedere i sintomi motori cardinale di PD fino a 4 anni, indicando che la disfunzione olfattiva può segnalare prime fasi del PD 6-10. La comparsa precoce di deficit olfattivi nel PD ha portato ad un forte interesse per la disfunzione olfattiva ed i meccanismi sottostanti coinvolti. In studi preclinici nei roditori, la disfunzione olfattiva potrebbe essere una misura di esito sensibile per prevedere il potenziale terapeutico di nuove strategie terapeutiche. Molti test sono stati progettati e ampiamente utilizzato per caratterizzare menomazioni sensomotorie in modelli di roditori di PD e di TESt il potenziale terapeutico di nuovi trattamenti 11-15. Anche se i deficit olfattivi sono ben documentati nel PD, la funzione olfattiva non è stata misurata di routine in molti modelli. Questo punto di vista sta cambiando anche se con la scoperta di forme genetiche del PD e la nozione più accettato che il PD è una malattia sistemica che colpisce più di una semplice funzione sensomotoria. Attualmente, ci sono numerosi studi in modelli genetici murini di PD e di altre malattie neurodegenerative che ora includono l&#39;analisi del dell&#39;olfatto nella caratterizzazione 16-24. Dato il crescente interesse della disfunzione olfattiva in patologie neurodegenerative, abbiamo cercato di montare una batteria di test olfattivi che possono essere utilizzati per caratterizzare nuovi modelli di neurodegenerazione e prova potenziali terapie modificanti la malattia in studi preclinici. Le prove descritte nel presente studio sono stati utilizzati sia la caratterizzazione e studi preclinici 18,25. Le prove Highlighted in questo studio hanno dimostrato di essere sensibile nel rilevare la disfunzione olfattiva in un frequente utilizzato alfa-sinucleina modello murino sovraesprimenti della malattia di Parkinson 18. Essi comprendono il test sepolta pellet 26,27, una versione adattata del test blocco 23,24,28,29, e il test di assuefazione / Dishabituation 30. E &#39;importante notare che ci sono diversi adattamenti dei test descritti in questo studio che sono misure sensibili della funzione olfattiva nei topi, quelli evidenziati in questo studio sono i test di laboratorio ha più esperienza con e utilizzare routine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Cap&#39;n Crunch</td>
			<td style="width:88px;">Quaker Oats</td>
			<td align="right" style="width:88px;">3E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Wooden Blocks</td>
			<td style="width:88px;">Lara&#8217;s Crafts</td>
			<td align="right" style="width:88px;">10144</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="379" rowspan="6" style="height:379px;width:88px;">Flavor Extracts</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;">Kroger</td>
			<td style="width:88px;">Almond: 011110664716</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Anise: 011110615619</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Banana: 011110669919</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Coconut: 011110669889</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Lemon: 011110669957</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Orange: 0011110669964</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="59" rowspan="2" style="height:59px;width:88px;">Tissue Cartridges</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Z672122-500EA</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Manufactured by Simport no: M490-2</td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Cotton Balls</td>
			<td style="width:88px;">Kroger</td>
			<td align="right" style="width:88px;">1.1111E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Mouse Cages</td>
			<td style="width:88px;">Ancare</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">19 x 29 x 12.7 cm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Camcorder</td>
			<td style="width:88px;">Sony</td>
			<td style="width:88px;">&#160;HDR-HC9</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">MiniDV Tapes</td>
			<td style="width:88px;">Sony DVC premium</td>
			<td align="right" style="width:88px;">2.7243E+10</td>
			<td style="width:88px;">60 minute long play&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

I pellet, blocco, e test assuefazione / Dishabituation sepolti sono tutte valutazioni estremamente vantaggiose dell&#39;olfatto nei topi. Utilizzando questi test, abbiamo trovato cambiamenti significativi olfatto in diversi modelli murini genetica della malattia di Parkinson, tra cui alfa-sinucleina sovraesprimenti (Thy1-Asyn) 18 e Atp13a2 topi knockout. Entrambi Thy1-Asyn e Atp13a2 topi knockout impiegano più tempo per trovare il pellet sepolto rispetto ai controlli 18. Figure 1-3 mostrano i dati raccolti dal tipo selvatico e Atp13a2 topi knockout. Nel test pellet sepolta, Atp13a2 topi knockout mostrano un aumento di latenza per trovare il pellet sepolta rispetto ai topi di controllo di tipo selvatico (Figura 1). Nella prova di blocco sia di tipo selvatico e Atp13a2 topi knockout per annusare il blocco romanzo da gabbia di un altro topo rispetto a isolati dalla propria gabbia di casa (Figura 2). Nei topi di prova assuefazione / Dishabituation tipo selvatico mostrare assuefazione ad un odore e<html> poi aumentata sniffing quando un romanzo odore è introdotto (Figura 3). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Sepolto pellet di prova. Latenza per trovare il pellet in di tipo selvatico (n = 10) e Atp13a2 KO (n = 14) a 20-27 m di età. * P &lt;0.05, Mann-Whitney U. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 prova Block ora annusando il blocco romanzo (E) nel test di blocco di tipo selvatico (n = 10) e Atp13a2 KO (n = 12) topi femmina a 20 -. 27m di età. ΔΔ rappresenta p &lt;0.01 rispetto ai blocchi A, B, e C dello stesso genotipo. Mann-Whitney U. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura prova 3 assuefazione / Dishabituation. Tempo medio fiutando una cartuccia profumata nei topi di tipo selvatico (9 m età, n = 7) su 6 prove e l&#39;introduzione di una cartuccia con una nuova fragranza in prova 7.

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Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Saggi olfattive per modelli murini di malattia di Neurodegenerative

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

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21.8K Views.  University of Cincinnati. Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Video: Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

I modelli del mouse di leucomalacia periventricolare

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Ricerca

Neuroscienze

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Valutare fenotipi neurodegenerative<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Valutazione della permeabilità della barriera emato - encefalica dall'infusione endovenosa di albumina FITC-labeled in un modello murino di malattia di Neurodegenerative

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.