Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (Bernstein Focus para Neurotechnology conceder 01GQ0810, a T. Moser, y MED-EL Alemania); la Fundación Alemana de Investigación a través del Centro de Nanotecnología Microscopía y Fisiología Molecular del Cerebro (FZT 103, T. Moser) ya través de la SFB889, a N. Strenzke y T. Moser).

Todos los experimentos presentados en este trabajo se llevaron a cabo con los estándares éticos definidos por la ley alemana de protección de los animales de experimentación. La junta de la Universidad de Goettingen para el bienestar animal y la oficina de bienestar animal del estado de Baja Sajonia aprobaron los experimentos. 1 Preparación de μLED-estimulador <ol><li> Para μLEDs, primero preparar el estimulador μLED. Utilizar LEDs azules con 200 por 200 m de superficie activa (μLED, consulte la Tabla de Materiales). </li><li> Cables de soldadura a la μLED. Entonces, encapsular el μLED y las conexiones con pegamento epóxico. Deje el dispositivo durante la noche para permitir que el cura epoxi. </li><li> Para la estabilidad mecánica y el aislamiento eléctrico de los cables de embudo a través de un capilar de vidrio fino, usar 1 mm de diámetro exterior capilares de borosilicato y sellar la unión con epoxi (Figura 1D) de manera que el capilar se puede montar en un manipulador mecánico. NOTA: Taquí es una solución de compromiso de hacer de la cápsula lo suficientemente gruesa como para conseguir un buen aislamiento eléctrico (evitando artefactos de estimulación), pero lo suficientemente delgada como para permitir que el LED se mueven libremente dentro de la bulla y ubicarlo en el cocleostomía. Es una buena práctica para preparar más de un LED. </li><li> Para confirmar un buen aislamiento eléctrico, primero preparar un plato de Petri con 0,9% de NaCl y dip 3 alambres de cobre desnudos finalizados en el líquido. Esto sirve para simular un animal con electrodos ABR. Conecte los cables al amplificador-ABR y de allí a un osciloscopio. </li><li> A continuación, conecte el LED al estimulador y sumergirlo en la solución hasta que esté totalmente cubierto. Conducir el LED con pulsos (consulte el paso 3.1.1) a la corriente máxima permitida por más de 20 minutos y compruebe si hay artefactos de estimulación. Si aparecen, deseche el LED y probar uno nuevo. </li></ol> 2. Procedimiento Quirúrgico <ol><li> Utilice 4-10 ratones transgénicos semanas de edad, que expresan ChR2 bajo el promotor Thy1.2 (línea 9en Wang et al. 13). Para manipular el animal y realizar la cirugía, siempre use las herramientas quirúrgicas limpias y bien identificados. </li><li> Anestesiar a los animales con una inyección ip de una mezcla de uretano (1,32 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), y la buprenorfina 0,1 mg / g diluido en solución de NaCl al 0,9% estéril y colocar el ratón sobre una placa de calentamiento para mantener el cuerpo la temperatura a 37 ° C. Con esta dosis, la anestesia normalmente dura para toda el protocolo experimental. <ol><li> A partir de 10 minutos después de la hora inicial de inducción de la anestesia para detectar signos de la excitación por el reflejo de retirada de la pata. En caso de movimientos, aplicar dosis de mantenimiento de uretano (0,66 mg / kg) y buprenorfina (0,05 mg / g) diluido en 0,9% de solución NaCl estéril (sin xilazina). Vean de nuevo el reflejo de retirada de la pata y proceder sólo si el reflejo está ausente. </li></ol></li><li> Afeitarse cuidadosamente el área retroauricular en la preparación de la incisión. Use un retroauricularabordar para llegar a la bulla (cavidad del oído medio que contiene aire). <ol><li> Con un micro fórceps diseccionar cuidadosamente y / o eliminar parte de los músculos del cuello, por ejemplo, cutáneo del cuello, esternocleidomastoideo y escalenos. </li><li> Encuentra y exponer la bulla (Figura 1A). Identificar la bulla como una estructura ósea con una forma esférica característica con un anillo en la superficie bulla que indica la inserción de la membrana timpánica (Figura 1A). Hacer un agujero con la punta de una aguja de insulina justo debajo de este anillo. Empezar por ahí, retirar el hueso que cubre la ampolla con una fina Pinzas (gnawer) o microforceps de tal manera que el Promontorium de la cóclea está expuesto (Figura 1B). </li></ol></li><li> Para el cocleostomía, afeitarse suavemente la cápsula ósea para abrir una pequeña ventana (cocleostomía: ~ 500-800 micras), teniendo cuidado de dejar intacto el laberinto membranoso (Figura 1B). Realice el cocleostomía en el segundo coclearvuelta ya que es lo suficientemente lejos de la arteria estapedial y desde el vértice. La apertura de los ápice podría producir la rotura de la cóclea incluyendo una fractura de la modiolo. </li><li> Para una inserción ventana redonda de una fibra óptica o μLED-implante a escala timpánica, agrandar cuidadosamente el nicho de la ventana redonda por rascarse el nicho óseo con la punta de un bisturí afilado (un número cuchilla 11 es una buena opción). Utilice siempre una nueva cuchilla o bisturí. Tenga mucho cuidado ya que la arteria estapedial corre muy cerca de la ventana redonda (Figura 1B). </li></ol> 3. óptico Estimulación aplicando dos criterios <ol><li> Para la estimulación transcoclear, uso μLEDs o un láser de fibra acoplada. <ol><li> Montar el capilar que lleva el μLED en un manipulador mecánico y cuidadosamente coloque el μLED sobre la cocleostomía. Uso oABR, provocada por la estimulación a largo 3-10 mseg a partir de una fuente de corriente (típicamente 5-40 mA a 2,7 V) a 1-5 Hz, como un medio para optimizar la posición y oientation del μLED. </li><li> Para la estimulación láser, utilizar una nm láser de onda continua 473 y una fibra óptica de 250 micras (ver Materiales). Pareja de la fibra óptica a una fuente de láser azul que, idealmente, ofrece un control analógico rápido de potencia (bien utilizar un dispositivo acústico-óptico o una obturación rápida para definir el estímulo óptico). El uso de un micromanipulador, localizar la punta de la fibra directamente sobre la cocleostomía y fijarlo allí con cemento dental (estimulación transcoclear). </li></ol></li><li> Para la estimulación intracoclear, inserte la fibra a través de la ventana redonda en la rampa timpánica. A continuación, utilice 3-10 pulsos láser ms de 10 a 30 mW (potencia de salida de la fibra) a 1-5 Hz para obtener oABR. La gran amplitud de oABR permite al experimentador observar oABR evocada por estímulos individuales en el osciloscopio para optimizar la posición y orientación del emisor (μLED o fibra) utilizando oABR amplitud como una lectura de salida. </li><li> Una vez bien oABR haberse logrado, fijar la fibra con cyanoacrpegamento ylate o cemento dental y esperar hasta que el pegamento es sólido. NOTA: Es normal observar un poco de líquido que sale de la cóclea. Sin embargo, para evitar problemas con la polimerización del cemento, es aconsejable secar la región utilizando mechas de algodón finas. </li></ol> 4. Grabaciones de oABR <ol><li> Insertar electrodos de aguja debajo de la oreja, en el vértice y en la parte posterior cerca de las piernas y conectarlos al amplificador. </li><li> Amplificar la diferencia de potencial entre el vértice y mastoides agujas subdérmicos. Muestra a una velocidad de 50 kHz y el filtro (1-10.000 Hz). Visualizar la diferencia de potencial en un osciloscopio idealmente cerca de la configuración de la grabación para la optimización de la posición del estimulador óptico. Utilice promedio de la señal (50-1,000x) y almacenar los datos en un ordenador para análisis fuera de línea. </li></ol> 5. Grabaciones de Potenciales Evocados ópticamente Campo Local <ol><li> Colocar el animal en un marco estereotáxico. Con unas pinzas cientorally de tirar de la piel que cubre el cráneo y realizar una incisión media con unas tijeras que se extiende aproximadamente desde entre los ojos hasta el punto que los músculos del cuello se unen al cráneo. <ol><li> Reflejar la piel lateralmente. Cortar el periostio longitudinalmente a lo largo de la sutura sagital y retírela hacia los lados frotando suavemente el hueso craneal expuesta con un hisopo de algodón. </li></ol></li><li> Coloque una placa de metal por encargo en el cráneo expuesto dejando aproximadamente 1 mm de espacio entre el extremo caudal de la placa y lambda. Con un diámetro de 0,7 mm perforar cuidadosamente perforar un agujero en el hueso parietal. </li><li> Tornillo suavemente en un tornillo de diámetro de 0,85 mm - para servir como referencia para potenciales registrados desde el colículo inferior (IC) - que sostiene el tornillo con fórceps, siempre y cuando el tornillo no esté bien sujeta. Asegurar un buen contacto entre el tornillo y la duramadre sin penetrar el cerebro. Pegar el tornillo y la placa de metal en el cráneo con pegamento de cianoacrilato. </li><li> Afloje el nEck músculos suavemente desde el cráneo. Tire de los músculos del cuello en sentido caudal para alrededor de 1-2 mm. Identificar la intersección del seno sagital superior, (SSS) y el seno transversal (TS). Si es necesario, aumentar la transparencia del cráneo humedeciendo el hueso con solución fisiológica de NaCl. <ol><li> Identificar la IC en ratones como mentir directamente caudal a la intersección SSS y TS. Después de la identificación de la ubicación de la IC lenta y cuidadosamente realizar una ca. extiende trepanación 0,5 mm a 1,5 mm rostral caudal a la TS y aproximadamente 3 mm lateralmente. </li><li> Evite cualquier daño a la SSS y TS ya que impediría un experimento exitoso. Aquí, probar si el hueso trepanned ha aflojado por suavemente empujándolo. Utilizando unas pinzas lentamente quitan el hueso. </li></ol></li><li> Con un adaptador adecuado adjuntar una matriz multicanal y cabezal de la platina en un micromanipulador. Para evitar la destrucción de la matriz de grabación multicanal durante la inserción en la IC, retire con cuidado la duramadrecon una punta doblada de una pequeña aguja hipodérmica de partida cerca de un borde de hueso. <ol><li> Quite el animal del marco estereotáxico. Fije la placa de metal sobre una barra de permanecer fijación estereotáxica. Coloque la sonda de grabación sobre el IC y la inserta bajo control microscópico de tal manera que el canal superior más es apenas visible en la superficie. </li></ol></li><li> Amplificar la diferencia de potencial entre los canales individuales de la matriz de grabación y el tornillo de referencia en el hueso parietal, muestra a una velocidad de 32 kHz, filtro de paso bajo (300 Hz) y almacenar en un ordenador para análisis fuera de línea. </li><li> Todos los animales deberán ser sacrificados humanitariamente al final del procedimiento antes de la recuperación anestésica de acuerdo con las directrices pertinentes de la eutanasia. Los métodos apropiados de eutanasia pueden incluir dislocación cervical o inhalación de CO2. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los experimentos descritos demuestran la estimulación optogenética de las NEG, y pueden, en principio, también pueden utilizarse para estimular las células ciliadas internas y / o externas, siempre que la expresión de opsinas. Estos experimentos requieren mucha paciencia y cuidado. Como se ha mencionado antes, los pasos más críticos son una buena cocleostomía inserción / ventana redonda, así como una posición adecuada y la orientación de la fuente de luz. Existen limitaciones con...

Según la Organización Mundial de la Salud, 360 millones de personas en todo el mundo sufren de pérdida de la audición. En los sujetos sordos, la estimulación eléctrica directa de NEG por IC, permite la comprensión del habla abierta en la mayoría de ellos 1,2,4,5. A pesar de que las entidades de crédito han sido implantadas en más de 200.000 personas, siendo así la neuroprótesis más exitoso, codificación de sonido conducido por los actuales implantes cocleares es limitado. IC se basan en la estimulación eléctrica por un cierto número de electrodos donde cada uno se activa una región tonotópico del nervio auditivo evitando así el órgano sensorial disfuncional de Corti en la cóclea. Oyentes con audición normal pueden discriminar más de 2000 frecuencias, sin embargo los IC de hoy utilizan sólo hasta 12-22 canales de frecuencia 4. Esto es debido al flujo de corriente generalizada de cada electrodo de estimulación 7,9, la activación de un gran número de NEG que representan muchas diferentes frecuencias de sonido 8,15. Estelimitación se puede mejorar utilizando la estimulación multipolar pero a costa de un mayor consumo de potencia 16,17. Su salida de rango dinámico para la intensidad del sonido también es limitado, por lo general por debajo de 6-20 dB 4,18. Por estas razones, la mejora de la frecuencia y la intensidad de la resolución son objetivos importantes para aumentar el rendimiento del IC para mejorar el reconocimiento de voz en entornos ruidosos, comprensión de la prosodia y la percepción musical. Una opción diferente para estimular el nervio auditivo es la estimulación óptica. La luz puede ser convenientemente centrado para apuntar a una pequeña población SGN, prometiendo mejor confinamiento espacial, el aumento de resolución de frecuencia y también ampliar el rango dinámico, lo que resulta en una mejor resolución intensidad. De hecho, la estimulación coclear con luz infrarroja ha demostrado una excelente resolución de frecuencia en modelos animales 10,11,19. Una desventaja de este tipo de estimulación es que requiere energías más altas que la estimulación eléctrica <sup&gt; 10,11. Por otra parte, las preocupaciones sobre la capacidad del método para estimular directamente las neuronas auditivas se han planteado 12,20. Como alternativa a la estimulación infrarroja, empleamos la optogenética para hacer NEG sensible a la luz. Optogenética es un nuevo enfoque que combina técnicas genéticas y ópticas de manera no invasiva y controlar específicamente las células con alta precisión temporal (opiniones del 21 al 23). La modalidad actualmente más frecuentemente utilizado emplea la expresión del gen microbiana canalrodopsina 2 (ChR2) de Chlamydomonas reinhardtii y variantes de la misma, que codifica un canal de cationes de luz cerrada 24. ChR2 es una proteína transmembrana-7-hélice que, cuando se transduce en neuronas y activado por la luz azul, actúa como canal de cationes no selectivo, por lo tanto las células despolarizante de 24 27. ChR2 ha sido bien caracterizado 24,28- 31 y muchas variantes se han desarrollado para modificar action del espectro, de compuerta y permeabilidad propiedades 32,33. El objetivo de nuestro trabajo es establecer la optogenética coclear para la activación de la vía auditiva. Tomamos nota de que el enfoque optogenética para estimular el nervio auditivo requiere manipulación genética del ganglio espiral para la expresión de canalrodopsina. Trabajando con ratones y ratas permite el uso de animales transgénicos disponibles 13,34,35, que proporcionan la expresión de canalrodopsina con poca variabilidad a lo largo del eje tonotópico y animales a través de 36. Combinando alelos condicionales 37 con Cre-líneas apropiadas proporciona la expresión específica de la célula. La transferencia de genes en el ganglio espiral de otros animales requiere el uso de virus tales como el virus adeno-asociado que es un enfoque estándar en optogenética 38 y que hemos demostrado que funciona bien en ratones 36. La manipulación y la expresión de transgenes que codifican proteínas exóticas oso riesgos de efectos adversos tales como IMMU genéticarespuestas y / o proliferación ne, estado comprometido o incluso la muerte de las células manipuladas genéticamente. Para el propósito de esta demostración usamos ratones transgénicos que expresan ChR2 en las neuronas del ganglio espiral bajo el promotor Thy-1 13 para estimular ópticamente la vía auditiva. Observamos que otras variantes canalrodopsina se pueden utilizar para el mismo propósito que hemos demostrado utilizando la transferencia mediada por virus de la variante de captura 14 en NEG 39. Mientras que la optogenética coclear requiere la manipulación genética, ofrece tuning molecular para optimizar la estimulación SGN y promesas mejoró la frecuencia y la intensidad de la resolución en comparación con la estimulación eléctrica. Estimulación optogenética de la vía auditiva es muy relevante para la investigación de la audición. Por ejemplo, promete avances en los estudios de la refinamiento dependiente de la actividad de tonotopia durante el desarrollo, en el análisis de los requisitos de integración espectral en localizat sonidode iones y de la extensión de la interacción entre las proyecciones aferentes frecuencia específica en el sistema auditivo central.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U2500-100G</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl</td>
			<td>RXV</td>
			<td></td>
			<td>Sedative and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td></td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Only to be used to hold soft tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>To open the skin and help with the muscle dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lempert Rongeurs&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16004-16</td>
			<td>They are very useful to easily remove the bone from the bulla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473-nm laser&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>MLL-III473</td>
			<td>100 mW solid state 473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser driver&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>DPSSL MLL 100 mW</td>
			<td>TTL operated laser driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;m optical fiber</td>
			<td>Any comercial ; e.g. Thorlabs</td>
			<td>M42L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>PCAOM VIS</td>
			<td>Control the amount of light coupled into the fiber from the laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>160T1-8SAR-24-0.8</td>
			<td>Control the acousto-optic modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo2 laser power &#38; energy meter</td>
			<td>Gentec-EO</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue &#181;LED</td>
			<td>Cree</td>
			<td>C470UT200</td>
			<td>It is necessary to build several &#956;LED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDT System&#160;</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>RZ6-A-P1</td>
			<td>It can be used any system for stimulus generation&#160; presentation and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-shank, 16-channel silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&#160;</td>
			<td>These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill Steel Burrs</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19007-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self tapping bone screw</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19010-10</td>
			<td>Reference screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis</td>
			<td></td>
			<td>Positioning of recording probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic stimulation of the auditory nerve

La estimulación eléctrica directa de las neuronas del ganglio espiral (NEG) por implantes cocleares (IC) permite la comprensión del habla abierto en la mayoría de los sujetos sordos implantados 1-6. No obstante, la codificación de sonido con IC actuales tiene mala frecuencia y la resolución de intensidad debido a la amplia difusión actual de cada contacto de electrodo activación de un gran número de NEG lo largo del eje tonotópica de la cóclea 7 9. Estimulación óptico se propone como una alternativa a la estimulación eléctrica que promete más espacialmente confinada activación de NEG y, por tanto, una mayor resolución de frecuencia de la codificación. En los últimos años, la iluminación de infrarrojos directa de la cóclea se ha utilizado para evocar respuestas en el nervio auditivo 10. Sin embargo se requiere de altas energías que la estimulación eléctrica 10,11 y la incertidumbre se mantiene en cuanto al mecanismo subyacente 12. Aquí se describe un método basado en la optogenética para estimular NEGcon la luz azul de baja intensidad, el uso de ratones transgénicos con expresión neuronal de canalrodopsina 2 (ChR2) 13 o la expresión mediada por virus de la ChR2 variante Catch 14. Utilizamos micro-diodos emisores de luz (μLEDs) y láseres de fibra acoplada para estimular NEG ChR2 expresan a través de una pequeña abertura artificial (cocleostomía) o la ventana redonda. Analizamos las respuestas por las grabaciones del cuero cabelludo de los potenciales evocados (luz optogenética de respuesta auditiva del tronco cerebral: oABR) o mediante grabaciones de microelectrodos de la vía auditiva y los comparamos con la estimulación acústica y eléctrica.

<html> Un cocleostomía óptima es crítica y aumenta la probabilidad de un experimento exitoso. Esto significa que la ventana es regular, pequeña, y no hay ninguna lesión de las estructuras internas cocleares. Por ejemplo, sangrado indica daño de la estría vascular. Un buen ejemplo se presenta en la Figura 1B. Utilizando ratones transgénicos ChR2, ChR2 se expresa en las NEG dentro de la cóclea (Figura 1C). Azul de luz de iluminación, ...

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Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Los implantes cocleares (IC) permitir la audición por la estimulación eléctrica directa del nervio auditivo. Sin embargo, la mala frecuencia y la intensidad de la resolución limita la calidad de la audición con entidades de crédito. Aquí se describe la estimulación optogenética del nervio auditivo en ratones como estrategia alternativa para la investigación auditiva y el desarrollo de las futuras entidades de crédito.

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K vistas.  University Medical Center Goettingen.  Los implantes cocleares (IC) permitir la audición por la estimulación eléctrica directa del nervio auditivo. Sin embargo, la mala frecuencia y la intensidad de la resolución limita la calidad de la audición con entidades de crédito. Aquí se describe la estimulación optogenética del nervio auditivo en ratones como estrategia alternativa para la investigación auditiva y el desarrollo de las futuras entidades de crédito. 

Video: Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Uso del protocolo Theta-Burst para explorar Mechasnism de plasticidad en los individuos con el síndrome de X frágil y el autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Investigación

Neurociencias

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

El dispositivo de TMS NeuroStar: Realización de la FDA aprobó el Protocolo para el tratamiento de la depresión

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

La visualización directa de la murino Dorsal coclear Núcleo de optogenética La estimulación de la vía auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Evaluación de la función neuromuscular Usando percutánea estimulación nerviosa eléctrica

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.