Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e della Ricerca (Bernstein Focus Neurotechnology concedere 01GQ0810, a T. Moser, e MED-EL Germania); la Fondazione tedesca per la ricerca attraverso il Centro per Nanoscale Microscopia e Fisiologia Molecolare del Cervello (FZT 103, T. Moser) e attraverso il SFB889, a N. Strenzke e T. Moser).

Tutti gli esperimenti presentati in questo lavoro sono stati condotti con gli standard etici definiti dalla legge tedesca per la protezione degli animali da esperimento. L&#39;Università di Goettingen bordo per il benessere degli animali e il benessere degli animali ufficio dello stato della Bassa Sassonia ha approvato gli esperimenti. 1 Preparazione di μLED-stimolatore <ol><li> Per μLEDs, prima preparare il-stimolatore μLED. Utilizzare LED blu con 200 da 200 micron superficie attiva (μLED, vedi Materiali Tavolo). </li><li> Saldare i fili al μLED. Poi, incapsulare il μLED e le connessioni con colla epossidica. Lasciare il dispositivo durante la notte per consentire la cura epossidica. </li><li> Per la stabilità meccanica e isolamento elettrico imbuto i fili attraverso un capillare di vetro sottile, usare 1 mm di diametro esterno capillari borosilicato e sigillare la giunzione con resina epossidica (Figura 1D) tale che il capillare può essere montato su un manipolatore meccanico. NOTA: Tqui è un trade-off di rendere la capsula di spessore sufficiente per ottenere un buon isolamento elettrico (per evitare artefatti di stimolazione), ma abbastanza sottile per lasciare il LED muoversi liberamente all&#39;interno della bulla e per individuarlo sul cocleostomia. E &#39;una buona pratica per preparare più di un LED. </li><li> Per confermare buon isolamento elettrico, prima di preparare un piatto di Petri con il 0,9% di NaCl e dip 3 fili di rame nudo chiusi nel liquido. Questo serve per simulare un animale con elettrodi ABR. Collegare i fili al ABR-amplificatore e da lì a un oscilloscopio. </li><li> Quindi, collegare il LED allo stimolatore e immergerlo nella soluzione fino a quando non è completamente coperto. Guidare il LED con impulsi (vedere il punto 3.1.1) alla corrente massima consentita per più di 20 minuti e controllare artefatti di stimolazione. Se appaiono, scartare il LED e provare uno nuovo. </li></ol> 2 Procedura chirurgica <ol><li> Utilizzare 4-10 settimana-vecchio topi transgenici che esprimono ChR2 sotto il promotore Thy1.2 (linea 9in Wang et al. 13). Per manipolare l&#39;animale e di eseguire l&#39;intervento chirurgico, utilizzare sempre strumenti chirurgici puliti e ben identificati. </li><li> Anestetizzare animali con una iniezione ip di una miscela di uretano (1,32 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), e buprenorfina 0,1 mg / g diluito in soluzione di NaCl allo 0,9% sterile e posizionare il mouse su una piastra riscaldante per mantenere il corpo temperatura a 37 ° C. Con questa dose, l&#39;anestesia di solito dura per tutto il protocollo sperimentale. <ol><li> Inizio 10 minuti dopo il check induzione dell&#39;anestesia iniziale per segni di eccitazione da parte del riflesso ritiro zampa. Nel caso di movimenti, applica dosi di uretano (0,66 mg / kg) e buprenorfina (0,05 mcg / g) diluito in soluzione di NaCl allo 0,9% sterile (senza xilazina) manutenzione. Controllare di nuovo il riflesso di ritiro zampa e procedere solo se il riflesso è assente. </li></ol></li><li> Radersi con cura la zona retroauricolare in preparazione dell&#39;incisione. Utilizzare un retroauricolareavvicinarsi per raggiungere la bolla (contenente aria cavità dell&#39;orecchio medio). <ol><li> Con un micro pinza sezionare con cura e / o rimuovere una parte dei muscoli del collo, per esempio, platisma, sternocleidomastoideo e scaleni. </li><li> Trovare ed esporre la bulla (Figura 1A). Identificare la bolla come una struttura ossea di forma sferica caratteristico con un anello sulla superficie bolla che indica l&#39;inserimento della membrana timpanica (Figura 1A). Fare un foro con la punta di un ago da insulina sotto questo anello. Avviare lì, rimuovere l&#39;osso che copre la bulla con una multa Rongeur (roditore) o microforceps in modo tale che la promontorium della coclea è esposta (Figura 1B). </li></ol></li><li> Per il cocleostomia, delicatamente radersi la capsula ossea per aprire una piccola finestra (cocleostomia: ~ 500-800 micron), avendo cura di lasciare intatto il labirinto membranoso (Figura 1B). Eseguire la cocleostomia sul secondo coclearegirare in quanto è abbastanza lontano dalla arteria stapediale e dall&#39;apice. Aprendo l&#39;apice potrebbe produrre la rottura della coclea tra cui una frattura del modiolus. </li><li> Per un inserimento finestra rotonda di una fibra ottica o μLED-impianto a scala timpani, allargare con cautela la finestra nicchia rotonda graffiando la nicchia ossea con la punta di un bisturi affilato (un numero lama 11 è una buona opzione). Usare sempre una nuova lama o bisturi. Fate molta attenzione in quanto l&#39;arteria stapediale corre molto vicino alla finestra rotonda (Figura 1B). </li></ol> 3. Stimolazione ottico Uso Due approcci <ol><li> Per la stimolazione transcochlear, uso μLEDs o un laser in fibra accoppiata. <ol><li> Montare il capillare che porta la μLED su un manipolatore meccanico e con attenzione posizionare il μLED sul cocleostomia. Uso OABr, suscitata da 3-10 stimolazione msec lungo da un generatore di corrente (tipicamente 5-40 mA a 2,7 V) a 1-5 Hz, come mezzo per ottimizzare la posizione e oientation del μLED. </li><li> Per la stimolazione laser, utilizzare un nm laser a onda continua 473 e una fibra ottica di 250 micron (vedi Materiali). Coppia la fibra ottica di una sorgente laser blu che offre idealmente controllo analogico veloce di potenza (altrimenti utilizzare un dispositivo acusto-ottico o un otturatore veloce per definire lo stimolo ottico). Utilizzando un micromanipolatore, individuare la punta della fibra direttamente sul cocleostomia e fissarla lì con cemento dentale (stimolazione transcochlear). </li></ol></li><li> Per la stimolazione intracochlear, inserire la fibra attraverso la finestra rotonda nella scala timpanica. Quindi utilizzare 3-10 impulsi laser msec di 10-30 mW (potenza di uscita fibra) a 1-5 Hz a suscitare OABr. La grande ampiezza di OABr consente sperimentatore di osservare OABr evocata da stimoli singoli sull&#39;oscilloscopio per ottimizzare la posizione e l&#39;orientamento dell&#39;emettitore (μLED o fibra) utilizzando OABr ampiezza come-out lettura. </li><li> Una volta buona OABr sono stati raggiunti, fissare la fibra con cyanoacrylate colla o cemento dentale e attendere fino a quando la colla è solido. NOTA: È normale osservare un liquido che esce dalla coclea. Tuttavia per evitare problemi con la polimerizzazione del cemento, si consiglia di asciugare la regione utilizzando stoppini di cotone. </li></ol> 4. registrazioni di OABr <ol><li> Inserire agoelettrodi sotto il padiglione auricolare, sul vertice e sul retro vicino alle gambe e collegarli all&#39;amplificatore. </li><li> Amplifica la differenza di potenziale tra il vertice e mastoide aghi sottocutanei. Campione ad una velocità di 50 kHz e filtro (1-10,000 Hz). Visualizzare la differenza di potenziale su un oscilloscopio idealmente vicino alla configurazione di registrazione per ottimizzare la posizione dello stimolatore ottico. Utilizzare media del segnale (50-1,000x) e memorizzare i dati su un computer per l&#39;analisi offline. </li></ol> 5. Registrazioni di potenziali otticamente Evocati locale campo <ol><li> Posizionare l&#39;animale in una cornice stereotassica. Utilizzando pinze centraduno tirare la cute sovrastante il cranio ed eseguire una incisione mediana con le forbici che si estende da circa mezzo agli occhi al punto in cui i muscoli del collo si attaccano al cranio. <ol><li> Riflettere la pelle lateralmente. Tagliare il periostio longitudinalmente lungo la sutura sagittale e rimuoverlo lateralmente strofinando delicatamente l&#39;osso cranico esposta con un batuffolo di cotone. </li></ol></li><li> Posizionare una piastra metallica su ordine sul cranio esposto lasciando circa 1 mm di spazio tra l&#39;estremità caudale della piastra e lambda. Con un diametro di 0,7 millimetri praticare attentamente praticare un foro nell&#39;osso parietale. </li><li> Avvitare delicatamente in una vite di diametro 0,85 millimetri - per servire come riferimento per potenziali registrate dal collicolo inferiore (IC) - tenendo la vite con una pinza fino a quando la vite non è fissata saldamente. Garantire un buon contatto tra vite e dura senza penetrare nel cervello. Incollare la vite e la piastra metallica sul cranio con colla cianoacrilato. </li><li> Allentare il nmuscoli Eck delicatamente dal cranio. Tirare i muscoli del collo caudale per circa 1-2 mm. Identificare l&#39;intersezione del seno longitudinale superiore (SSS) e il seno trasverso (TS). Se necessario, aumentare la trasparenza del cranio inumidendo l&#39;osso con soluzione fisiologica NaCl. <ol><li> Identificare l&#39;IC nei topi come mentire direttamente caudale fino all&#39;intersezione SSS e TS. Dopo l&#39;identificazione della posizione del IC lentamente e con attenzione eseguire un ca. trapanazione estende 0,5 millimetri rostralmente a 1,5 mm caudalmente al TS e circa 3 mm in direzione laterale. </li><li> Evitare qualsiasi pregiudizio per la SSS e TS in quanto questi precluderebbe un esperimento riuscito. Qui, verificare se l&#39;osso trapanato si è sciolto da dolcemente spingendolo. Uso pinze lentamente sollevare l&#39;osso. </li></ol></li><li> Con un adattatore adeguato allegare una matrice multicanale e headstage su un micromanipolatore. Per evitare di distruggere la matrice di registrazione multicanale durante l&#39;inserimento nel IC, rimuovere con attenzione la duracon una punta piegata di un piccolo ago ipodermico iniziando vicino ad un bordo osso. <ol><li> Rimuovere l&#39;animale dal telaio stereotassico. Fissare la piastra di metallo su una barra di rimanere fissazione stereotassica. Posizionare la sonda di registrazione sul IC e inserirla sotto controllo microscopico tale che la maggior canale superiore è appena visibile in superficie. </li></ol></li><li> Amplificare la differenza di potenziale tra i singoli canali della matrice registrazione e la vite di riferimento nell&#39;osso parietale, campione ad una velocità di 32 kHz, filtro passa-basso (300 Hz) e memorizzare in un computer per l&#39;analisi offline. </li><li> Tutti gli animali devono essere umanamente eutanasia al termine della procedura prima del recupero anestetico in conformità alle linee guida pertinenti eutanasia. Metodi adatti di eutanasia possono includere dislocazione cervicale o CO 2 inalazione. </li></ol>

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R., Peca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Transgenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2.">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li><li>Tomita, H., Sugano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Properties+of+Transgenic+Rats+Harboring+the+Channelrhodopsin-2+Gene+Regulated+by+the+Thy-1.2+Promoter.">Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter.</a> PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Gli esperimenti descritti dimostrano la stimolazione optogenetic delle SGNs, e possono, in linea di principio, essere utilizzati anche per stimolare le cellule ciliate interne e / o esterne, a condizione che l&#39;espressione di opsine. Questi esperimenti richiedono molta pazienza e cura. Come detto prima, i passaggi più critici sono una buona / inserimento cocleostomia finestra rotonda e una posizione appropriata e l&#39;orientamento della sorgente luminosa. Ci sono limitazioni con stimola...

Secondo l&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità, 360 milioni di persone nel mondo soffrono di perdita dell&#39;udito. Nei soggetti non udenti, la stimolazione elettrica diretta del SGNs da CIS abilitare aperto comprensione discorso nella maggior parte di essi 1,2,4,5. Anche se i CI sono stati impiantati in più di 200.000 persone, quindi essendo il neuroprosthesis di maggior successo, la codifica audio guidato dagli attuali impianti cocleari è limitata. CI sono basati su stimolazione elettrica di un certo numero di elettrodi in cui ognuno attiva una regione tonotopic del nervo uditivo bypassando così l&#39;organo sensoriale disfunzionale del Corti nella coclea. Ascoltatori udito normale possono discriminare più di 2.000 frequenze, tuttavia IC odierni utilizzano solo fino a 12-22 canali di frequenza 4. Ciò è dovuto alla diffusa flusso di corrente da ciascun elettrodo stimolante 7,9, attivando un gran numero di SGNs che rappresentano molte diverse frequenze sonore 8,15. Questolimitazione può essere migliorata mediante stimolazione multipolare ma a scapito di una maggiore potenza assorbita 16,17. La loro uscita gamma dinamica per intensità del suono è anche limitata, di solito sotto 6-20 dB 4,18. Per queste ragioni, migliorando la frequenza e la risoluzione intensità sono obiettivi importanti per aumentare le prestazioni CI per migliorare il riconoscimento vocale in ambienti rumorosi, comprensione prosodia e percezione musicale. Una scelta diversa per stimolare il nervo uditivo è la stimolazione ottica. La luce può essere focalizzata comodamente a bersaglio una piccola popolazione SGN, promettendo una migliore confinamento spaziale, aumentando la risoluzione di frequenza e ampliare anche la gamma dinamica, con conseguente risoluzione intensità migliore. Infatti, la stimolazione cocleare con luce infrarossa ha dimostrato un&#39;eccellente risoluzione in frequenza in modelli animali 10,11,19. Uno svantaggio di questo tipo di stimolazione è che richiede energie superiori a stimolazione elettrica <sup&gt; 10,11. Inoltre, le preoccupazioni circa la capacità del metodo di stimolare direttamente i neuroni uditivi sono state sollevate 12,20. In alternativa alla stimolazione infrarossi, impieghiamo optogenetics rendere SGNs sensibile alla luce. Optogenetics è un nuovo approccio che combina tecniche genetiche e ottici per non invasivo e controllo specificamente cellule con alta precisione temporale (recensioni 21- 23). La modalità attualmente utilizzata più frequentemente impiega l&#39;espressione del microbica channelrhodopsin 2 (ChR2) gene di Chlamydomonas reinhardtii e sue varianti, che codifica per un canale cationico luce-dipendenti 24. ChR2 è una proteina transmembrana-7-elica che, quando trasdotto in neuroni e attivato dalla luce blu, agisce come canale cationico non selettivo, depolarizzanti così le cellule di 24 27. ChR2 è stato ben caratterizzato 24,28- 31 e molte varianti sono state sviluppate per modificare action spettro, gating e permeabilità proprietà 32,33. Lo scopo del nostro lavoro è quello di stabilire optogenetics cocleare per l&#39;attivazione della via uditiva. Notiamo che l&#39;approccio optogenetic per stimolare il nervo uditivo richiede manipolazione genetica del ganglio spirale per l&#39;espressione di channelrhodopsin. Lavorando con topi e ratti consente l&#39;utilizzo di animali transgenici disponibili 13,34,35, che forniscono espressione di channelrhodopsin con poca variabilità lungo l&#39;asse tonotopic e attraverso gli animali 36. La combinazione di alleli condizionali 37 con le opportune linee Cre prevede per l&#39;espressione specifica delle cellule. Il trasferimento genico nel ganglio spirale di altri animali richiede l&#39;uso di virus come il virus adeno-associato che è un approccio standard in optogenetics 38 e che abbiamo dimostrato di lavorare bene nei topi 36. La manipolazione genetica ed espressione di transgeni codificanti per proteine ​​estranee rischi orso di effetti negativi come immurisposte e / o proliferazione ne, condizione compromessa o addirittura la morte delle cellule geneticamente manipolate. Ai fini di questa dimostrazione usiamo topi transgenici che esprimono ChR2 nei neuroni gangliari a spirale sotto il Thy-1 promotore 13 per stimolare visivamente il percorso uditivo. Notiamo che altre varianti channelrhodopsin possono essere utilizzati per lo stesso scopo, come abbiamo dimostrato con il trasferimento virus-mediata delle catture variante 14 in SGNs 39. Mentre optogenetics cocleare richiede manipolazione genetica, che offre la sintonizzazione molecolare per la stimolazione SGN ottimizzata e promesse migliorato la frequenza e la risoluzione di intensità rispetto alla stimolazione elettrica. Stimolazione optogenetic della via uditiva è molto rilevante per ascoltare la ricerca. Ad esempio, promette progressi negli studi della raffinatezza attività-dipendente di tonotopy durante lo sviluppo, nell&#39;analisi del requisito di integrazione spettrale localizat suonoione e del grado di interazione tra specifica frequenza proiezioni afferenti al sistema uditivo centrale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U2500-100G</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl</td>
			<td>RXV</td>
			<td></td>
			<td>Sedative and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td></td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Only to be used to hold soft tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>To open the skin and help with the muscle dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lempert Rongeurs&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16004-16</td>
			<td>They are very useful to easily remove the bone from the bulla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473-nm laser&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>MLL-III473</td>
			<td>100 mW solid state 473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser driver&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>DPSSL MLL 100 mW</td>
			<td>TTL operated laser driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;m optical fiber</td>
			<td>Any comercial ; e.g. Thorlabs</td>
			<td>M42L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>PCAOM VIS</td>
			<td>Control the amount of light coupled into the fiber from the laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>160T1-8SAR-24-0.8</td>
			<td>Control the acousto-optic modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo2 laser power &#38; energy meter</td>
			<td>Gentec-EO</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue &#181;LED</td>
			<td>Cree</td>
			<td>C470UT200</td>
			<td>It is necessary to build several &#956;LED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDT System&#160;</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>RZ6-A-P1</td>
			<td>It can be used any system for stimulus generation&#160; presentation and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-shank, 16-channel silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&#160;</td>
			<td>These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill Steel Burrs</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19007-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self tapping bone screw</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19010-10</td>
			<td>Reference screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis</td>
			<td></td>
			<td>Positioning of recording probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic stimulation of the auditory nerve

Stimolazione elettrica diretta di spirale neuroni gangliari (SGNs) per gli impianti cocleari (IC) permette aperto comprensione discorso nella maggior parte dei soggetti sordi impiantati 1- 6. Tuttavia, codifica audio con IC correnti ha scarsa frequenza e intensità risoluzione a causa ampia diffusione corrente da ciascun contatto elettrodo attivando un gran numero di SGNs lungo l&#39;asse tonotopic della coclea 7- 9. Stimolazione ottica viene proposto come alternativa alla stimolazione elettrica che promette spazialmente più limitata attivazione di SGNs e, di conseguenza, la risoluzione maggiore frequenza di codifica. Negli ultimi anni, illuminazione infrarossa diretta della coclea è stato usato per evocare risposte nel nervo uditivo 10. Tuttavia richiede energie superiori a stimolazione elettrica 10,11 e l&#39;incertezza rimane per quanto riguarda il meccanismo sottostante 12. Qui si descrive un metodo basato sulla optogenetics per stimolare SGNsa bassa intensità di luce blu, usando topi transgenici con espressione neuronale di channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 o espressione virus-mediata del pescato ChR2-variante 14. Abbiamo utilizzato micro-diodi emettitori di luce (μLEDs) e laser in fibra-accoppiato per stimolare SGNs ChR2-esprimono attraverso una piccola apertura artificiale (cocleostomia) o la finestra rotonda. Abbiamo dosato le risposte da registrazioni del cuoio capelluto dei potenziali evocati (light-optogenetic uditivi del tronco encefalico risposta: OABr) o da registrazioni di microelettrodi del percorso uditivo e li abbiamo confrontati con stimolazione acustica ed elettrica.

<html> Un cocleostomia ottimale è critico e aumenta la probabilità di un esperimento riuscito. Ciò significa che la finestra è regolare, piccolo, e non vi è alcun pregiudizio delle strutture cocleari interne. Ad esempio, sanguinamento indica un danno del vascularis stria. Un buon esempio è presentato nella Figura 1B. Utilizzando topi ChR2-transgenici, ChR2 si esprime nei SGNs all&#39;interno della coclea (Figura 1C). Blu illuminazione a...

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Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Gli impianti cocleari (IC) consentire l&#39;udito attraverso la stimolazione elettrica diretta del nervo uditivo. Tuttavia, la scarsa frequenza e la risoluzione intensità limita la qualità di ascoltare con IC. Qui si descrive la stimolazione optogenetic del nervo uditivo nei topi come una strategia alternativa per la ricerca e lo sviluppo uditivo futuri CI.

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K Views.  University Medical Center Goettingen.  Gli impianti cocleari (IC) consentire l'udito attraverso la stimolazione elettrica diretta del nervo uditivo. Tuttavia, la scarsa frequenza e la risoluzione intensità limita la qualità di ascoltare con IC. Qui si descrive la stimolazione optogenetic del nervo uditivo nei topi come una strategia alternativa per la ricerca e lo sviluppo uditivo futuri CI. 

Video: Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Utilizzo del Theta Burst protocollo Esplora Mechasnism di plasticità in individui con Sindrome X Fragile e autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Ricerca

Neuroscienze

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

Il dispositivo TMS NeuroStar: Condurre la FDA ha approvato protocollo per il trattamento della depressione

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

L&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Valutazione della Neuromuscolare Funzione Con percutanea stimolazione elettrica del nervo

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Methods Article

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo