Nuestro método tiene como objetivo generar células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco a partir de células madre embrionarias de ratón. Esta línea de células madre reportera de campo cardíaco permite el estudio de alto rendimiento de los mecanismos subyacentes a la cardiopatía congénita, proporcionando un sistema que es susceptible de manipulación genética y farmacológica. Existen varias enfermedades cardíacas congénitas específicas de la cámara.
Mediante la recapitulación de la cardiogénesis in vitro, este protocolo permite el estudio del mecanismo de la enfermedad y el desarrollo de futuras terapias regenerativas. Este protocolo puede proporcionar información sobre cómo se especifican las células progenitoras cardíacas de diferentes cámaras durante el desarrollo cardíaco. Comience por el cultivo de células madre embrionarias de ratón transgénicos en matraces T25 recubiertos con gelatina al 0,1%en un medio 2i.
Cuando las células alcancen el 70 al 80%confluencia, enjuague los cultivos con PBS y agregue un mililitro de trippsina por matraz para disociar el cultivo en células individuales a 37 grados centígrados durante tres minutos. Cuando las células se hayan desprendido, neutralice la reacción con cuatro mililitros 10 FBS en DMEM y cuente las células por un método adecuado. Diluir las células a aproximadamente tres veces 10 a las cinco células por concentración media fresca, y recoger las células por centrifugación.
A continuación, resuspender el pellet en cinco mililitros de medio 2i fresco para replating en nuevos matraces T25 recubiertos con gelatina 0.1%. Para la generación de CPC a partir de esferoides cardíacos, recoger 2,5 veces 10 a los seis de la muestra de célula madre embrionaria de ratón transgénico desprendido por centrifugación, y resuspend las células en 25 mililitros de medio SFD. Placa la suspensión celular en una placa estéril de 150 por 25 milímetros para incubación a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 48 horas.
Al final de la incubación, recoger los esferoides cardíacos en un tubo cónico. Sedimentar los esferoides por centrifugación para facilitar el aislamiento selectivo de los esferoides y evitar células individuales. Resuspender los esferoides en 25 mililitros de medio SFD fresco complementado con un nanogratro por mililitro de activin A y 1,5 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea cuatro.
Vuelva a encaminar los esferoides en la misma placa de cultivo para una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, recuerde todos los esferoides cardíacos por centrifugación. Resuspender los cuerpos embrionados diferenciados en 25 mililitros de medio SFD fresco para el enchapado en un matraz ultrabajo, matraz cuadrado de 75 centímetros en la incubadora de cultivo celular durante 48 horas.
Para el aislamiento del CPC específico del campo cardíaco utilizando reporteros fluorescentes, recoja los cuerpos embrionados por centrifugación y disocia las culturas 3D con un mililitro de tripsina a 37 grados centígrados durante tres minutos. Al final de la incubación, mezclar bien por pipeteo para disociar las células y neutralizar la reacción con cuatro mililitros de 10%FBS en DMEM. Pasar la mezcla sobre un colador de 70 micrómetros para eliminar los cuerpos embrionados no disociados, y sedimentar las células filtradas por centrifugación.
Para ordenar las CPC por su expresión fluorescente de reportero, resuspendir el pellet en 500 microlitros solución FACS y filtrar las células a través de un colador celular de 40 micrómetros en un tubo de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros sobre hielo. Luego ordene las células para aislar las células que expresan RFP y GFP por FACS, recogiendo las células en un mililitro de FBS. Para aislar los CPC de campo cardíaco primero frente al segundo basado en su expresión Cxcr4 de proteína superficial, resuspendir células madre embrionarias de ratón único células madre rfp-expresas células progenitoras en 300 microlitros de 10%FBS en PBS complementados con anticuerpo anti-Cxcr4 conjugado con fluorescencia.
Después de cinco minutos a temperatura ambiente, lave las células tres veces en uno o dos mililitros de PBS fresco y frío por lavado. Después del último lavado, resuspender las células en 500 microlitros de solución FACS y filtrar las células a través de un colador de 40 micrómetros en un tubo de cinco mililitros, de fondo redondo. Luego ordene las células por su expresión Cxcr4, recogiendo las poblaciones Cxcr4 positivas y negativas en tubos individuales que contienen un mililitro de FPS por tubo en hielo.
Para re-cultivar las células progenitoras cardíacas aisladas por FACS, específicas del campo cardíaco, recoja las células ordenadas por centrifugación y resusppend los pellets en medio SFD. Luego sembrar aproximadamente tres veces 10 a las cuatro células por pozo en un 0.1%recubierto de gelatina, placa de 384 pozos. Si se observa un aumento de la muerte celular después de la clasificación, agregue el inhibidor de ROCK de 10 micromolares a cada pozo.
Después de dos días de cultivo, se debe observar la paliza espontánea. Para analizar la capacidad de los CPC chapados para diferenciarse a los cardiomiocitos, recoja las células en el día 12 de diferenciación con tripina, como se ha demostrado, para aislar los cardiomiocitos individuales y resuspender las células en 4%paraformaldehído. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, recoger las células fijas por centrifugación y lavar el pellet en PBS para eliminar el exceso de fijador.
A continuación, resuspender las células en 10%FBS en PBS, e incubar la mitad de la muestra celular con anticuerpos anti-troponina T de ratón y utilizar la otra mitad de la muestra como un control negativo. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave las células dos veces en PBS fresco y resuspendir las muestras en 10%FBS más PBS complementado con un anticuerpo secundario apropiado. Después de otra incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, lave las células dos veces en PBS fresco por lavado y resuspendir las células en 200 microlitros de PBS por tubo para su análisis en un citómetro de flujo.
Después de aproximadamente 132 horas de diferenciación, las células progenitoras cardíacas Tbx1-RFP y Hcn4-GFP pueden detectarse mediante microscopía de fluorescencia. Generalmente, las células GFP y RFP aparecen aproximadamente alrededor del mismo tiempo, y las dos poblaciones de células progenitoras continúan expandiéndose en proximidad y típicamente en un patrón complementario. Ajustar las concentraciones de activin A y la proteína morfogenética ósea cuatro alterará los porcentajes de células progenitoras cardíacas del primer campo cardíaco frente a las células progenitoras cardíacas del segundo campo cardíaco.
Del mismo modo, utilizando una línea de células madre embrionarias de ratón reportero RFP, después de 132 horas de diferenciación, aparecen células progenitoras cardíacas positivas RFP. Después de la inmunostaining para Cxcr4, RFP-positivo, Cxcr4-positivo, y RFP-positivo, las células Cxcr4-negativas se pueden aislar. La inmunostaining para la troponina cardiaca T en el día 12 de diferenciación confirma que las células del primer campo cardíaco se diferencian principalmente en miocitos.
Del mismo modo, las células derivadas de RFP positivo, las células progenitoras cardíacas Cxcr4 negativas dan lugar a cardiomiocitos en porcentajes mucho más altos en comparación con las células progenitoras cardíacas positivas únicas cxcr4. Ocasionalmente, las células madre embrionarias de ratón no se diferencian eficientemente y forman un número muy bajo de células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco. El momento, la concentración y la consistencia de la adición de las citoquinas y el número de células son críticos para una generación exitosa de células progenitoras cardíacas específicas de la cámara.
Después de este procedimiento, los investigadores pueden analizar las propiedades fisiológicas de las diferentes poblaciones de células progenitoras cardíacas para obtener más información sobre su especificación y función.
