This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

Todos los experimentos con animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, los reglamentos y las agencias reguladoras. El protocolo que se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación del reglamento oficina del Reino Unido Inicio 1. Perfusión y Cell Collection (Figura 1) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figura 1:. Liver perfusión Después de la anestesia del ratón, el tracto digestivo se mueve lateralmente hacia la izquierda del abdomen con el fin de hacer que la vena portal (PV) accesible. El PV se canula utilizando una tasa de flujo lento (1-3 ml / min) de solución de EGTA / HBSS y el Veina cava inferior (IVC) es inmediatamente roto para evitar cualquier exceso de presión dentro del hígado. Dentro de la primera minutos de perfusión, el caudal se incrementa gradualmente a 7 ml / min. La solución de colagenasa se perfunde después a 10 ml / min hasta que se logra su digestión completa. <ol><li> Prepare recién todos los reactivos descritos en la tabla de material. </li><li> Calentar el EGTA (etilenglicol Tetra-ácido acético) / HBSS (solución salina equilibrada de Hank) solución (50 ml por ratón) y la solución de colagenasa (100 ml por ratón) durante 30 min a 40 ° C. </li><li> Enjuague el tubo flexible de la bomba primero con etanol al 70%. Verter 40 ml de solución de EGTA / HBSS en un tubo de centrífuga sumergida en el baño de agua y enjuagar el tubo flexible de la bomba con la solución de EGTA / HBSS precalentado. </li><li> Realizar la anestesia terminal usando un barbitúrico para producir de forma fiable la inconsciencia antes de la depresión respiratoria y la muerte. Inyectar fenobarbital a 1 mg / kg, ip en un ratón CD1 hembra o macho (35-45 g). Confirme la anestesia mediante pellizcos dedo del pie. </li><li> Afeitado pelos abdominales y esterilizar la superficie abdominal con solución de etanol al 70%. </li><li> Corte a través de la cavidad abdominal y exponer la vena porta y la vena cava inferior moviendo el intestino lateralmente a la izquierda del abdomen. </li><li> Estrellat la bomba a una velocidad de 1-3 ml / min con solución de EGTA / HBSS y canular la vena portal usando una aguja de 23 g mariposa (alas cortadas). Abrazadera de la sección de la vena portal canulado con la aguja 23 G y, a continuación voltear el fórceps serrefine en la superficie del abdomen del ratón abierto. El hígado debe pálido rápidamente dentro de los primeros 30 segundos de la perfusión EGTA Solución / HBSS. </li><li> Rápidamente incisión en la parte inferior de la vena cava inferior para evitar edificio exceso de presión en el hígado, y luego aumentar la velocidad de flujo gradualmente a 7 ​​ml / min, sobre la primera minutos de perfusión. El animal muere debido a la hemorragia secundaria a la vena cava punción venosa. </li><li> Cuando menos de 5 ml de solución EGTA / HBSS es permanecer en el tubo de centrífuga, llenarlo con colagenasa solución (40-50 ml). Aumentar la tasa de flujo gradualmente a 10 ml / min, durante 30 s. </li><li> Hacer que el hígado se inflame mediante la aplicación de presión a la vena cava inferior, usando pinzas, para los intervalos de 5-10 seg. This se puede hacer periódicamente (5-10 veces durante la digestión). Este paso va a mejorar la disociación de células del hígado y reducir el tiempo de perfusión con colagenasa. </li><li> Cuando menos de 10 ml de solución de colagenasa se mantiene dentro del tubo de centrífuga, se vierte 40-50 ml de la solución de pre-calentado colagenasa en el tubo de centrífuga. </li><li> Después de 10-15 min de perfusión y unos 70-80 ml de solución de colagenasa perfundidos, aplicar una pequeña presión sobre la superficie del hígado con un fórceps. Una impresión de la presión indica que las células hepáticas se disocian. </li><li> Retire el hígado de la cavidad abdominal como una sola pieza y colocarla en un tubo de centrífuga que contiene 20 a 30 ml de células Kupffer Aislamiento medio. Mantenga las células del hígado en hielo oa 4 ° C durante un período máximo de 3 horas para no afectar la viabilidad celular hepática. </li><li> Repita el procedimiento de perfusión en varios animales si es necesario, manteniendo el hígado perfundido en hielo. Piscina dos y cincuenta y nueve hígados para la purificación y proceder con la etapa 3. </li></ol> 2. Preparación del gradiente de densidad para la centrifugación (Figura 2) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figura 2:. Preparación del gradiente de densidad Todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones estériles. El SIP se prepara mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice revestido con 1,7 ml de 10 x PBS. A 5 ml de SIP se mezclan con 15 ml de PBS para hacer una solución SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP se mezclan con 10 ml de PBS para hacer una solución SIP 20 ml de 50%. Un tubo de centrífuga que contiene la solución de 50% SIP (20 ml) se inclina y la solución SIP 25% (20 ml) se añade lentamente usando una pipeta serológica de 25 ml. <ol><li> Continúe con los pasos siguientes (artículo 2., 3. y 5.) bajo condiciones estériles y mantener las células en hielo oa 4 ° C. Prepare el SIP (Solución de partículas de sílice recubiertas isotónica) mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice revestido con 1,7 ml de 10 x PBS. </li&gt; <li> Para hacer 20 ml de solución de SIP 25%, mezclar 5 ml de SIP con 15 ml de PBS. Para hacer 20 ml de solución de SIP 50%, mezclar 10 ml de SIP con 10 ml de PBS. </li><li> Llene un tubo de centrífuga con 20 ml de la solución de SIP 50%. Incline el tubo de centrífuga en un ángulo próximo a 90 ° y se añade lentamente la solución SIP 25% (20 ml) en la pared lateral del tubo utilizando una pipeta serológica de 25 ml, sin tocar la superficie de la capa de SIP 50%. Cuando la adición de la solución SIP 25%, reducir progresivamente el ángulo del tubo. Mantenga el gradiente de densidad en hielo hasta su uso. </li></ol> 3. Kupffer Purificación celular (Figura 3) <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figura 3:. La purificación de las células de Kupffer por centrifugación en gradiente de densidad y la adhesión celular Todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones estériles. (A) Después de la rotura de la cápsula de Glisson, las células del hígado se filtran a través de un 100 micras colador. La suspensión se centrifugó a 50 x g para descartar hepatocitos (pellets) y recoger la fracción de células no parenquimatosas (sobrenadante). Este paso se repite 3 veces. Las células no parenquimatosas se añaden en la parte superior de un gradiente discontinuo isotónica y se centrifugaron a 800 xg durante 15 min. Las células de Kupffer recogidos de la almohadilla SIP 25% se purifican adicionalmente por la selección de la adhesión celular. (B) Las células se sembraron en placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO2 durante 30 min. Las células no adherentes se lavaron una vez con 500 l de HBSS. Las células de Kupffer muestran su morfología adherente 4 hr después de la siembra, cuando -CNTs f se pueden añadir a las células. La barra de escala representa 25 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Poner un hígado perfundido en un plato de Petri con 15 ml de aislamiento de células Kupffer Medium. Romper la cápsula de Glisson (membrana del hígado) usando tijeras y liberar todas las células hepáticas en el medio de aislamiento de células Kupffer. Filtrar la solución a través de un filtro de células de 100 micras que se recoge en un tubo de centrífuga. Repita el procedimiento de perfusión de hígados perfundidos adicionales y poner en común las células en el mismo tubo de centrífuga (15 ml de un ratón, hasta 45 ml de tres ratones). </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Las células del parénquima (hepatocitos) estarán en el sedimento y las células no parenquimatosas (incluyendo células de Kupffer) estarán en el sobrenadante. </li><li> Recoger el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio y centrifugar a 50 xg durante 2 min cada una. Repita este paso tres veces más. </li><li> Centrifugar a 1350 xg durante 15 min para sedimentar las células no parenquimatosas. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de Kupffer aislamiento de células Medio. </li><li> Añadir la solución de células no parenquimatosas en el gradiente isotónico discontinua 25/50% como se describe en 2.3. Centavorifuge a 850 xg durante 15 min sin aceleración o descanso. </li><li> Localizar la fracción de células Kupffer enriquecido que aparece turbia dentro de la fracción SIP 25% cerca de la interfaz de SIP 25/50% (Figura 3). Usando una pipeta serológica de 10 ml, aspirado sobre 12 ml de la fracción de células Kupffer enriquecido. La transferencia de células en un tubo de centrífuga que contiene 35 a 40 ml de Kupffer aislamiento de células Medio. Mezclar suavemente y centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar las células. </li><li> Deseche las células sobrenadante y resuspender en 5-10 ml de pre-calentado célula Kupffer medio de cultivo. Recuento de células (hemocitómetro) y medir la viabilidad mediante la tinción de azul de tripano. </li><li> Placa de las células no parenquimatosas purificadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 10 5 células / pocillo. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 (Figura 3). Después de 30 minutos, retire con cuidado el medio, lavar con pre-calentado solución salina equilibrada de Hank (HBSS) una vez que vuelva a colocarcon 500 l de fresco y pre-calentado Kupffer Cell Culture Medium (por pocillo). </li><li> Deja células de Kupffer durante al menos 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2 antes del tratamiento con nanopartículas, para permitir que adquieran su morfología adherente. </li></ol> 4. Caracterización <ol><li> Las células de Kupffer Pureza <ol><li> Preparar fresca solución de PBS / BSA utilizado para mantener la viabilidad de células de Kupffer. Lavar las células una vez con 500 l de solución de PBS / BSA. Retire la solución de PBS / BSA y separar las células de Kupffer en 500 l de solución de PBS / BSA fresca utilizando raspado suave. Cuando las células se sembraron en placas de 24 pocillos, acortar los extremos de las cuchillas raspadoras con tijeras para hacer más fácil el desprendimiento de proceder. Transferencia de células en tubos de citometría de flujo. </li><li> Contar las células de Kupffer utilizando un hemocitómetro y centrifugar 1 x 10 5 células a 1350 x g. Resuspender las células de Kupffer en 30 l de F4 / 80 anticuerpo (puro). Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Mantener las células no teñidas (no incubadas con el anticuerpo) en hielo. </li><li> Añadir 2 ml de solución de PBS / BSA en células teñidas, se centrifuga a 1350 g durante 5 min y descartar el sobrenadante resultante. Resuspender las células teñidas en 200 l de PBS / BSA. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo, puerta 10000 sin teñir las células de Kupffer de acuerdo a su tamaño (dispersión hacia adelante) y granularidad (dispersión lateral). Analizar la fluorescencia de las células cerradas en FL-1 canal. </li><li> Repita el procedimiento para las células de Kupffer manchadas manteniendo los mismos ajustes utilizados para la citometría de flujo análisis de las células de Kupffer sin teñir. Seleccionar y cuantificar la fluorescencia de las células teñidas para evaluar la pureza de las células de Kupffer. </li></ol></li><li> Kupffer célula fagocítica Actividad <ol><li> Reemplace los medios con un 0,5% (v / v) perlas fluorescentes en Kupffer Cultivo Celular Medio e incubar durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Con el fin de eliminar las perlas no internalizadas, células de Kupffer de centrífuga a 1350 xg, discard las células sobrenadante y resuspender en 500 l de PBS Solución / BSA. Repita este paso 2 veces más. </li><li> Raspe células de Kupffer en 500 l de células de la solución y de transferencia de PBS / BSA en un tubo de citometría de flujo. </li><li> Centrifugar las células de Kupffer en 1350 xg, descartan las células sobrenadante y resuspender en 200 l de PBS Solución / BSA. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo, puerta 10000 sin teñir las células de Kupffer de acuerdo a su tamaño (dispersión hacia adelante) y granularidad (dispersión lateral). Analizar la fluorescencia de las células cerradas en FL-2 canal. </li></ol></li></ol> 5. La incubación de carbono funcionalizados químicamente nanotubos (f -CNTs) <ol><li> Preparar una dispersión de -CNTs f (1 mg / ml) en agua por tratamiento con ultrasonidos durante 15 minutos antes de su uso. -CNTs F se preparan en la casa 22. </li><li> Preparar 2x CNT f- concentrados dispersión en Kupffer Cell Culture Medium. CNT f- sonicado dispersas en un medio para2 min antes de proceder con el paso 5.3). </li><li> Para cada bien, sustituya 250 l de edad media con 250 l de 2x dispersión -CNTs f. Pozos sin tratar (250 l de medio acondicionado + 250 l de fresco Kupffer Cell Culture Medium) y los pocillos tratados con 10% de DMSO se utilizan como control negativo y positivo, respectivamente. </li><li> Se incuban las células de Kupffer a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 o 72 horas. </li></ol> 6. Evaluación de la toxicidad de -CNTs f en células de Kupffer por la lactato deshidrogenasa (LDH) Ensayo Modificado <ol><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 200 l (por pocillo de placa de 24 pocillos) de tampón de lisis y se incuba a 37 ° C durante 30 min-1 hr. </li><li> Después de llevar a cabo el pipeteo vigoroso, recoja lisaron las células de Kupffer en tubos de microcentrífuga y se centrifuga a 40.000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que fueron tomados por las células y los restos celulares. </li><li> Reunir los sobrenadantes (ƒ-CNT gratuita) entubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C o vaya al paso 6.5). </li><li> Transferencia de 50 l en una placa de 96 pocillos y añadir un volumen igual de la solución de mezcla de sustrato (kit LDH) a cada pocillo. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes de añadir 50 l de la solución de parada (kit LDH). Añadir triplicados de pocillos de blanco que contienen 50 l de tampón de lisis, 50 l de solución de mezcla de sustrato y 50 l de solución de parada. </li><li> Leer la absorbancia a 490 nm en un lector de microplacas y utilizar la siguiente fórmula para calcular el (%) la viabilidad celular. </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Los siguientes pasos son fundamentales para lograr un alto rendimiento y una alta viabilidad de las células de Kupffer. Las condiciones asépticas deben utilizarse para limitar el riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. Todos los instrumentos deben ser esterilizados antes de su uso. Los reactivos deben prepararse justo antes de llevar a cabo el procedimiento de aislamiento. La elección de la colagenasa IV, con baja actividad tríptico, es crucial. Los diferentes lotes del mismo pro...

El campo de la investigación nanotoxicología pretende caracterizar el efecto biológico de las nanopartículas. Los estudios toxicológicos sobre la base de las investigaciones in vivo siguen siendo los métodos más precisos. Sin embargo, su uso está limitado por sus requisitos de coste, tiempo y trabajo 1. Como los ensayos de alternativas, in vitro se han utilizado debido a su simplicidad y la posibilidad de desarrollar de alto rendimiento en plataformas de pruebas in vitro 2 - así se amplía el número de condiciones ensayadas. La mayoría de los estudios nanotoxicological se realizan usando ensayos in vitro con líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, hay preocupaciones con respecto a la extrapolación de estos resultados experimentales in vivo a los efectos toxicológicos 3. De hecho, las propiedades de las líneas celulares inmortalizadas pueden ser significativamente diferentes de los tejidos que se derivan de, por ejemplo, la transformación genética 4, el deterioro de las características morfológicas principales5, la pérdida de la polaridad celular 6 y alteraciones funcionales tales como la regulación de los mediadores de la inflamación 7. Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y están directamente en contacto con la sangre por el forro de la pared de los sinusoides hepáticos. Como parte del sistema retículo-endotelial (RES), estos macrófagos son responsables de la captura de las nanopartículas de circulación y por lo tanto, constituyen un modelo muy adecuado para estudiar la toxicidad de nanopartículas. In vivo 8 e in vitro 9 estudios de respuestas inflamatorias asociadas con las células de Kupffer expuestos a nanopartículas se han publicado en otros lugares. Las células de Kupffer también se han involucrado en la patogénesis de las enfermedades hepáticas como la enfermedad alcohólica del hígado 10, fibrosis hepática o hepatitis viral 11 12. Se informó de que las células de Kupffer aisladas proporcionan información útil para describir los mecanismos celulares involved en la interrupción del hígado 13,14. Varios métodos han sido reportados para aislar y purificar las células de Kupffer. Aislamiento de la célula puede resultar de la mecánica o enzimática de disociación 15. Digestión con colagenasa muestra la ventaja de conservar la integridad funcional de las células de Kupffer, mientras que lleva a rendimiento celular de alta Kupffer 16. Muchos enfoques experimentales, que varían en complejidad y los costes, se han utilizado para separar las células de Kupffer de otras poblaciones de células de hígado. Por ejemplo, la pureza de células Kupffer se puede lograr por inmunoafinidad 17, electroforesis de flujo 18, 16 adhesión selectiva o mediante técnicas centrífugas 16, que seleccionan las células en función de su tamaño y densidad. Una combinación de estos métodos puede ser elegido para aumentar la pureza de la población 16. No hay consenso sobre el método ideal para el aislamiento de células de Kupffer, ya que depende principalmente de la aplicación y equipamiento disponiblest. Sin embargo, en el caso de los ensayos de toxicidad de nanopartículas, la simplicidad y de alto rendimiento de la técnica asociada con la conservación funcional de las células de Kupffer parecían ser más adecuado para esta aplicación. El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método se modificó a partir del protocolo original desarrollado por Smedsrød et al. 16 diseñado para el aislamiento de células de hígado de rata. La mayoría de los estudios informaron y describen el aislamiento de las células de Kupffer de hígado de rata. En este documento, se describe un método para aislar células de Kupffer de hígado de ratón, con un alto rendimiento y pureza. El uso de ratones reduce el coste experimento y permite el procesamiento de varios hígados para obtener grandes cantidades de células de Kupffer para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas. En el siguiente protocolo, las células de Kupffer se incubaron con nanotubos de carbono funcionalizados (f </em&gt; -CNTs). Las propiedades físico-químicas únicas de CNTs - es decir, de alta relación de longitud a diámetro y gran área de superficie, han hecho CNTs candidatos interesantes como vectores para fines de terapia y el diagnóstico. Sin embargo, han surgido preocupaciones con respecto a la toxicidad de los nanotubos de carbono 19, y el desarrollo de nuevos ensayos in vitro tiene por objeto aumentar la comprensión del efecto biológico CNT. Toxicidad en células de Kupffer se asocia con una falta de integridad estructural de la membrana celular. Esto se mide por la pérdida de la enzima LDH citoplásmica de la célula en el sobrenadante. El principio de este método, por lo tanto, es eliminar cualquier LDH liberada y medir lo que queda en las células 20. Esto se realiza con preferencia a la medición de la LDH liberada en el sobrenadante debido a la presencia de nanotubos de carbono en el sobrenadante interfiere con el ensayo 21. Proponemos el uso de este simple y rentable metho aislamiento de células Kupfferd aislar alto número de células de Kupffer funcionales. Esto permite el cribado de toxicidad de una gama de nanopartículas, en un modelo de macrófagos primaria pertinente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td dir="LTR">Euthatal (pentobarbital sodium)</td>
			<td dir="LTR">Merial</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">CD1 mice</td>
			<td dir="LTR">Charles River&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">-</td>
			<td dir="LTR">Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">14175-053</td>
			<td dir="LTR">HBSS must be&#160; Ca2+ free.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">E8145&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">HEPES (1M)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">15630-056&#160;</td>
			<td dir="LTR">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Collagenase type IV&#160;</td>
			<td dir="LTR">Worthington&#160;</td>
			<td dir="LTR">CSL-4&#160;</td>
			<td dir="LTR">It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">&#160;Low glucose DMEM&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">D5523&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax&#174;)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">12633-012&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Penicillin/Steptomycin&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">15140-122</td>
			<td dir="LTR">100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td dir="LTR">First-Link&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">60-00-850&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Trypan blue solution&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR">T8154&#160;</td>
			<td dir="LTR">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Coated silica particle solution (Percoll&#174;)</td>
			<td dir="LTR">GE Healtcare&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">17-0891-02&#160;</td>
			<td dir="LTR">Percoll&#174; is very stable and can be kept for several years&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">1x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">10010-023</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">10x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">70011-036</td>
			<td dir="LTR">500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td dir="LTR">Fisher&#160;</td>
			<td dir="LTR">D/4120/PB08&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">LDH kit (CytoTox 96&#174;)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Promega&#160;</td>
			<td dir="LTR">G1781&#160;</td>
			<td dir="LTR">Keep protected from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">DMEM phenol red free</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">31053-028&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">F4/80 antibody (Alexa 488)</td>
			<td dir="LTR">AbD Serotec</td>
			<td dir="LTR">MCA497A488</td>
			<td dir="LTR">Do not dilute, used neat for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Fluorescent beads</td>
			<td dir="LTR">Sigma</td>
			<td dir="LTR">L2778</td>
			<td dir="LTR">Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of the Material</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog number&#160;</td>
			<td>Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing)&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD&#160;</td>
			<td dir="LTR">367288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Syringe Filters (0.22 &#956;m Blue Rim)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Minisart&#160;</td>
			<td dir="LTR">16534-K&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD Biosciences, Falcon&#160;</td>
			<td dir="LTR">35 2070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Petri dish (90 x 15 mm)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Thermo Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BSN 101VR20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">100 &#956;m cell strainer&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Peristaltic pump&#160;</td>
			<td dir="LTR">Watson Marlow&#160;</td>
			<td dir="LTR">SciQ 300&#160;&#160;</td>
			<td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">24-well plates</td>
			<td dir="LTR">Corning&#160;&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">96-well plates&#160;</td>
			<td dir="LTR">Corning&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Serrefine forceps</td>
			<td>Hammacher GmbH&#160;</td>
			<td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td>
			<td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon&#160;</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Elkay</td>
			<td>&#160; 000-MICR-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Cell scraper</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>353086</td>
			<td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Name of the Reagent</td>
			<td dir="LTR">Company&#160;</td>
			<td dir="LTR">Catalog number&#160;</td>
			<td dir="LTR">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">&#160;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution) Solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Collagenase Solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Kupffer Cell Isolation Medium&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&#174; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Kupffer Cell Culture Medium&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&#174; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&#160; with 15.3 ml of Percoll&#174; to obtain 17mL of SIP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">25% SIP solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">50% SIP solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Lysis Buffer</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">DMEM media with 0.9% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">PBS/BSA Solution</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

La gran mayoría de los estudios in vitro nanotoxicological han utilizado líneas celulares inmortalizadas por su practicidad. Sin embargo, los resultados de las pruebas de toxicidad de nanopartículas en líneas celulares inmortalizadas o células primarias han mostrado discrepancias, destacando la necesidad de extender el uso de células primarias de ensayos in vitro. Este protocolo describe el aislamiento de los macrófagos del hígado del ratón, las células de Kupffer con nombre, y su uso para estudiar la toxicidad de nanopartículas. Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y constituyen parte del sistema retículo-endotelial (RES), responsable de la captura de las nanopartículas de circulación. El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método, basado en la digestión de colagenasa y centrifugación de densidad, es una adaptación del protocolo original desarrollada por Smedsrød et al. diseñado para la rata isolatio células hepáticasn y proporciona un alto rendimiento (hasta 14 x 10 6 células por ratón) y alta pureza (&gt; 95%) de las células de Kupffer. Este método de aislamiento no requiere equipo sofisticado o caro y por lo tanto representa un compromiso ideal entre la complejidad y el rendimiento celular. El uso de ratones más pesados ​​(35-45 g) mejora el rendimiento del método de aislamiento sino que también facilita notablemente el procedimiento de canulación de la vena porta. La toxicidad de los nanotubos de carbono funcionalizados f -CNTs se midió en este modelo por el ensayo de LDH modificado. Este método evalúa la viabilidad celular mediante la medición de la falta de integridad estructural de la membrana de las células de Kupffer después de la incubación con -CNTs f. Inducida por -CNTs f toxicidad puede medirse constantemente utilizando este ensayo, destacando que las células de Kupffer aisladas son útiles para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas. La comprensión global de nanotoxicología podría beneficiarse de este tipo de modelos, por lo que la selección de nanopartículas para la traducción clínica más eficiente.

El número de células parenquimatosas no purificadas era consistente y varió entre 8 y 14 x 10 6 células por ratón (se realizaron 17 aislamientos). Cada aislamiento ratón era suficiente a la placa 16 a 28 pozos. La viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano demostró la viabilidad celular ~ 95%. Las células de Kupffer mostraron una forma redonda dentro de 30 min de incubación a 37 ° C, en relación con su morfología adherente incompletos (Figura 4A). A las 4 horas de in...

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Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.5K vistas.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

Video: Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultivo Celular

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections may be one possible cause. The typical animal model used for studying BA is established by inoculating a neonatal mouse with a rhesus rotavirus. Silver nanoparticles have been shown to exert antibacterial and antiviral effects; their function in the BA mouse model is evaluated in this study. Currently, in BA animal experiments, the methods used to improve the symptoms of BA mice are generally symptomatic treatments given via food or other drugs. The aim of this study is to demonstrate a new method for ameliorating BA syndrome in mice by the intraperitoneal injection of silver nanoparticles and to provide detailed methods for preparing the silver nanoparticle gel formulation. This method is simple and widely applicable and can be used to research the mechanism of BA, as well as in clinical treatments. Based on the BA mouse model, when the mice exhibit jaundice, the prepared silver nanoparticle gel is injected intraperitoneally to the surface of the lower liver. The survival status is observed, and biochemical indicators and liver histopathology are examined. This method allows a more intuitive understanding of both the establishment of the BA model and novel BA treatments.

This article describes in detail a method based on silver nanoparticles for ameliorating biliary atresia syndrome in an experimental biliary atresia mouse model. A solid understanding of the reagent preparation process and the neonatal mouse injection technique will help familiarize researchers with the method used in neonatal mouse model studies.

Forma de nanopartículas de plata para paliar el síndrome de Atresia biliar en ratones

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...