Name: kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing at JoVE.com

This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

모든 동물 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 처형되었다. 이 프로토콜은 영국 홈 오피스 규제의지도 및 승인하에 수행되었다 설명하는 1. 관류 및 셀 컬렉션 (그림 1) <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> 그림 1. 간 관류 마우스의 마취 후 소화관 측방 접근 간문맥 (PV)를 확인하기 위해 복부의 왼쪽으로 이동된다. PV 즉시 간 내의 과도한 압력을 피하기 위해 파열 EGTA / HBSS 용액의 느린 유속 (1-3 ml / 분) 및 열등한 veina 정맥 (IVC)은 캐 뉼러를 사용한다. 관류 제 분내, 유속은 점차 / 분 7 ml의 증가된다. 그것의 완전 분해가 달성 될 때까지 콜라게나 제 용액을 10 ㎖ / 분으로 관류된다. <ol><li> 처리장갓 재료 테이블에 설명 된 모든 시약을 다시. </li><li> EGTA (에틸렌 글리콜 테트라 아세트산) / HBSS (행크 균형 염 용액) 용액 (마우스 당 50 mL) 및 40 ° C에서 30 분 동안 콜라게나 제 용액 (마우스 당 100 ㎖)를 따뜻하게. </li><li> 처음 70 % 에탄올로 펌프 유연한 튜브를 씻어. 수조에 담가 원심 분리기 튜브에 EGTA / HBSS 용액 40 ml에 붓고 미리 예열 EGTA / HBSS 용액으로 펌프 유연한 튜브를 씻어. </li><li> 안정적으로 호흡 억제 및 사망하기 전에 무의식을 생산하는 바르비 투르 산염을 사용하여 단말기 마취를 수행합니다. 여성 또는 남성 CD1 마우스 (35-45g)로 1 ㎎ / ㎏, IP에 phenobarbitone을 주입한다. 발가락 집어 마취를 확인합니다. </li><li> 복부의 털을 면도하고 70 % 에탄올 용액을 사용하여 복부 표면 살균. </li><li> 복강을 통해 잘라 복부의 왼쪽 옆으로 장을 이동하여 포털 정맥과 하대 정맥을 노출. </li><li> 별t EGTA / HBSS 용액을 1-3 ml / 분의 속도로 펌프와 23g의 버터 플​​라이 니들을 이용하여 문맥을 cannulate (날개 절단). 23 G 바늘 유관 포털 정맥의 부분을 클램프하고 열린 마우스 복부의 표면에서 serrefine의 집게를 뒤집습니다. 간은 빨리 EGTA / HBSS 용액 관류의 첫 번째 30 초 이내에 창백합니다. </li><li> 급속 간 과잉 압력을 피하기 위해 건물 대정맥의 하부 부분을 절개 한 다음 제 관류 분 이상, 7 ㎖ / 분으로 서서히 유량을 증가시킨다. 동물에 의한 대정맥 정맥 천자를 베나하는 이차 출혈로 죽는다. </li><li> EGTA / HBSS 용액 미만 5 ml의 원심 분리 튜브에 남아있는 경우, 콜라게나 제 용액 (40-50 ml)로 그것을 채울. 30 초 이상, 10 ml / 분으로 점진적으로 유량을 증가시킨다. </li><li> 50-10 초 간격 들어 핀셋을 사용하여, 하대 정맥에 압력을인가함으로써 간 팽윤 만들기. 티들 (소화하는 동안 5 ~ 10 회) 정기적으로 수행 할 수 있습니다. 이 단계는 간세포 해리를 향상 콜라게나 재관류 시간을 단축한다. </li><li> 콜라게나 제 용액의 10 ml를 원심 분리 튜브 내에서 유지하는 경우, 원심 분리 튜브에 미리 가온 된 콜라게나 제 용액의 40-50 mL로 붓는다. </li><li> 관류 10-15 분, 콜라게나 제 관류 용액의 약 70 내지 80 ml의 후 집게로 간 표면에 작은 압력을 적용한다. 압력의 인쇄는 간 세포가 해리되어 있음을 나타냅니다. </li><li> 하나의 조각으로 복강에서 간을 제거하고 쿠퍼 세포 격리 중간의 20 ~ 30 ml의를 포함하는 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 간 세포 생존율에 영향을 피하기 위해 3 시간의 최대 시간 동안 얼음 상 또는 4 ℃에서 간 세포를 유지. </li><li> 얼음에 관류 간을 유지하면서, 필요한 경우 여러 동물 관류 절차를 반복합니다. 풀 정제를위한 세 가지 간 하나와 3 단계를 진행합니다. </li></ol> 원심 분리의 밀도 구배 2. 준비 (그림 2) <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> 그림 2 :. 밀도 구배의 준비는 모든 절차는 무균 상태에서 수행된다. SIP는 10 X 1.7 ml의 PBS로 코팅 된 실리카 입자 용액 15.3 ml를 혼합하여 제조된다. SIP의 5 ml를 20 ml의 25 %의 SIP 용액을 만들기 위해 PBS 15 ㎖로 혼합 하였다. SIP 10 ㎖를 20 ㎖의 50 %의 SIP 용액을 만들기 위해 PBS 10 mL로 혼합한다. SIP 50 % 용액 (20 ㎖) 및 기울어 SIP 25 % 용액 (20 ㎖)를 함유하는 원심 분리 관 천천히 혈청 25 ㎖ 피펫을 이용하여 첨가한다. <ol><li> 멸균 상태에서 다음 단계 (제 2, 3 및 5)을 진행하고 C 얼음 또는 4 °에서 세포를 유지합니다. (10)의 1.7 mL의 X PBS로 코팅 된 실리카 입자 용액 15.3 mL를 혼합함으로써 SIP (등장 성 코팅 된 실리카 입자 용액)을 준비한다. </lI&gt; <li> 25 %의 SIP 용액 20 ㎖을 PBS 15 ㎖로 SIP 5 mL를 혼합한다. PBS 10 mL로 SIP 10 ㎖를 혼합하여, 50 %의 SIP 용액 20 mL로한다. </li><li> SIP 50 % 용액 20 ㎖로 한 원심 관을 채운다. 90 °에 가까운 각도로 원심 관을 기울여 50 % SIP 층의 표면을 터치하지 않고, 25 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 튜브의 측벽에 천천히 25 % SIP 용액 (20 ml)에 추가한다. SIP 25 % 용액을 첨가 할 때 점진적으로 튜브의 각을 감소시킨다. 얼음에 사용할 때까지 밀도 구배를 유지합니다. </li></ol> 3. 쿠퍼 세포 정제 (그림 3) <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> 도 3 :. 밀도 구배 원심 분리 및 세포 유착에 의해 쿠퍼 세포의 정제 모든 절차는 멸균 조건 하에서 수행된다. (A) Glisson의 캡슐의 파열 후에, ​​간세포는 (1)를 통해 여과되고00 μm의 여과기입니다. 간세포 현탁액을 (펠릿)을 무시하고 비 실질 세포 분획 (상청액)을 수집 × 50 g에서 원심 분리된다. 이 단계는 3 회 반복된다. 비 실질 세포 등장액 불연속 구배의 상부에 첨가하고, 15 분 동안 800 XG에서 원심 분리된다. 25 % SIP 쿠션 수집 쿠퍼 세포는 세포 접착 선택에 의해 추가로 정제된다. (B) 세포를 24- 웰 플레이트에 도금 30 분 동안 CO 2, 37 ° C에서 배양 5 %이다. 비 - 부착 세포는 500 μL HBSS로 한번 세척 하였다. 쿠퍼 세포 F -CNTs가 세포에 첨가 할 수있는 도금 후에도 접착 형태 4 시간을 표시. 스케일 바는 25 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 쿠퍼 세포 격리 중간의 15 mL를 페트리 접시에 하나의 관류 간을 넣습니다. (Glisson의 캡슐을 파열간 막) 가위를 사용 쿠퍼 세포 분리 배지에 모든 간세포를 분리. 100 ㎛ 세포 스트레이너는 원심 분리 튜브에 수집 될지라도 용액 필터. 추가 관류 간에서 관류 절차를 반복하고 (세 쥐에서 45 ml의 최대 하나의 마우스에서 15 ml의) 같은 원심 분리기 튜브에 세포를 풀. </li><li> 4 ℃에서 2 분 동안 50 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 펠릿과 (쿠퍼 세포를 포함) 비 실질 세포 상층 액에있을 것입니다에 실질 세포 (간세포)입니다. </li><li> 2 분 각 50 XG에 깨끗한 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 수집합니다. 이 단계를 세 번 이상 반복합니다. </li><li> 15 분 동안 1,350 XG에 원심 분리기가 아닌 실질 세포 펠렛합니다. 뜨는을 취소하고 쿠퍼 세포 격리 중간 10ml에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 2.3에 기술 된 바와 같이 불연속 구배에 등장 50분의 25 %의 비 실질 세포 용액을 첨가. 센트가속 또는 휴식없이 15 분 동안 850 XG에 rifuge. </li><li> 50분의 25 %의 SIP 인터페이스에 가까운 25 % SIP 분획 (도 3) 내에 나타나는 혼탁 농후 쿠퍼 세포 분획 지역화. 10 ㎖의 혈청 학적 피펫, 기음 풍부한 쿠퍼 세포 분획의 약 12​​ ml의 사용. 쿠퍼 세포 격리 중간의 35-40 ml를 함유하는 원심 분리 관에 넣고 세포. 세포 펠렛 4 ℃에서 15 분 동안 1,350 XG에 부드럽게 원심 분리기 섞는다. </li><li> 미리 예열 쿠퍼 세포 배양 매체의 5 ~ 10 ㎖에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기하십시오. 세포 (혈구)를 카운트하고 트리 판 블루 염색을 사용하여 생존 능력을 측정한다. </li><li> / 웰의 5 X 105 세포의 밀도로 24 웰 플레이트에서 정제 된 비 실질 세포 접시. 37 ℃, 5 % CO 2 (그림 3)에서 세포를 품어. 30 분 후, 부드럽게 세척, 매체를 제거 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 한 번 교체를 미리 예열신선하고 미리 예열 쿠퍼 세포 배양 매체의 500 μL와 그것 (물론 당). </li><li> 그들의 부착 된 형태를 획득 할 수 있도록, 나노 입자로 처리하기 전에 37 ℃에서 적어도 4 시간과 5 % CO 2 쿠퍼 세포를 남겨. </li></ol> 4. 특성화 <ol><li> 쿠퍼 세포의 순도 <ol><li> 쿠퍼 세포 생존을 유지하는 데 사용되는 신선한 PBS / BSA 용액을 준비한다. PBS / BSA 용액 500 μL로 한 번 세포를 씻으십시오. PBS / BSA 솔루션을 제거하고 부드러운 스크래핑을 사용하여 신선한 PBS / BSA 용액 500 μL에 쿠퍼 세포를 분리. 세포를 24 웰 플레이트에 도금하는 경우, 계속하려면 분리를 쉽게하기 위해 가위 스크레이퍼 블레이드의 사지를 줄이십시오. 튜브 유동 세포 계측법에 세포를 전송합니다. </li><li> 혈구 원심 1,350 x g에서 1 × 105 세포를 사용 쿠퍼 세포 카운트. (깔끔한) F4 / 80 항체의 30 μL에 재현 탁 쿠퍼 세포. 잘 혼합 3 상온에서 부화0 분. 얼음에 흠 세포 (항체로 배양되지 않음)를 유지합니다. </li><li> 5 분 1,350g에서 염색 된 세포에서 원심 분리기를 PBS / BSA 용액 2 ㎖를 추가하고 결과 상층 액을 버린다. PBS / BSA 200 μL에 염색 된 세포를 재현 탁. </li><li> 유동 세포 계측법 분석의 경우, 게이트 10,000 크기 (정 분산) 및 입도 (측면 분산)에 따라 쿠퍼 세포를 염색. FL-1 채널 게이트 세포의 형광을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 흠 쿠퍼 세포의 유동 세포 계측법 분석에 사용 된 것과 동일한 설정을 유지하는 염색 쿠퍼 세포에 대해 절차를 반복한다. 선택 및 쿠퍼 세포의 순도를 평가하기 위해 염색 된 세포의 형광을 정량. </li></ol></li><li> 쿠퍼 세포 식세포 활동 <ol><li> 0.5 %로 용지를 교체 (v / v)의 쿠퍼 세포 배양 배지에서 형광 구슬은 37 ℃에서 4 시간 동안 품어 5 % CO 2. </li><li> 1350 XG, 다이에 비 내재화 비드, 원심 쿠퍼 세포를 제거하기 위해서500 μL PBS / BSA 용액에 뜨는에 resuspend 세포를 scard. 이 단계를 2 번 더 반복합니다. </li><li> 튜브 세포 계측법 흐름으로 PBS / BSA 솔루션 및 전송 세포 500 μL에 스크랩 쿠퍼 세포. </li><li> 원심 분리기 쿠퍼 세포는 1,350 XG에서, PBS / BSA 용액 200 μL에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기합니다. </li><li> 유동 세포 계측법 분석의 경우, 게이트 10,000 크기 (정 분산) 및 입도 (측면 분산)에 따라 쿠퍼 세포를 염색. FL-2 채널 게이트 세포의 형광을 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> (-CNTs F) 화학적으로 처리 된 탄소 나노 튜브의 5 배양 <ol><li> 사용하기 전에 15 분 동안 초음파로 물에 F -CNTs (1 ㎎ / ㎖)의 분산을 준비합니다. F -CNTs 사내 (22) 준비가되어 있습니다. </li><li> 배 농축 F-탄소 나노 튜브를 준비합니다 쿠퍼 세포 배양 배지에 분산. 대한 매질에 분산 초음파 처리 F-탄소 나노 튜브2 분) 단계 5.3를 진행하기 전에. </li><li> 각 웰의 경우, 2 배 F -CNTs 분산의 250 μL와 함께 오래 된 매체의 250 μl를 교체합니다. 처리되지 않은 웰 (신선한 쿠퍼 세포 배양액의 조정 배지 + 250 μL의 250 μL) 및 10 % DMSO로 처리 웰 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용된다. </li><li> 24 또는 72 시간 동안 CO 2, 37 ° C에서 쿠퍼 세포를 인큐베이션하고, 5 %. </li></ol> 수정 된 젖산 탈수소 효소 (LDH) 분석에 의한 쿠퍼 세포의 F -CNTs 6. 독성 평가 <ol><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 용해 버퍼의 (24 웰 플레이트의 웰 당) 200 μl를 추가하고 30 분 - 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 10 분 세포 및 세포 파편에 의해 흡수 된 F -CNTs 펠렛 대한 격렬한 피펫 팅을 수행 한 후, 40,000 XG에서 마이크로 원심 튜브 원심 분리기로 쿠퍼 세포를 용해 모은다. </li><li> 상층 액 (ƒ-CNT 무료)에 수집마이크로 원심 튜브 및 -20 ° C에서 저장 또는)은 6.5 단계로 진행합니다. </li><li> 96- 웰 플레이트에 넣고 50 μL와 각 웰에 기질 혼합 용액 (LDH 키트)의 동일 부피를 추가한다. 플레이트를 덮고 정지 용액 (LDH 키트) 50 μl를 첨가하기 전에 15 분 동안 실온에서 배양한다. 용해 버퍼의 50 μL, 기판의 혼합 용액 50 μL 및 정지 용액 50 μl를 포함하는 빈 우물의 삼중를 추가합니다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더에서 490 nm에서 흡광도를 읽고 (%) 세포 생존율을 계산하려면 다음 수식을 사용합니다. </li></ol><img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Decorated+Multiwalled+Carbon+Nanotubes+as+Dual+MRI+and+SPECT+Contrast+Agents.">Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents.</a> Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).</li><li>Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+to+isolate+and+culture+mouse+Kupffer+cells.">An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells.</a> Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).</li><li>Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+liver+Kupffer+cells.">Isolation of liver Kupffer cells.</a> Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

다음 단계는 높은 수율 및 쿠퍼 세포의 높은 가능성을 달성하기 위해 중요하다. 무균 조건은 세균 및 진균의 오염의 위험을 제한하기 위해 사용되어야한다. 모든 장비는 사용하기 전에 소독해야합니다. 시약 갓 분리 절차를 수행하기 전에 준비를해야합니다. 콜라게나 제 IV의 선택은 낮은 트립신 활성, 결정적이다. 동일한 공급자로부터 다른 많은 다른 효소 활성을 가지고 있...

나노 독성 연구 분야는 나노 입자의 생물학적 효과의 특성을 목표로한다. 생체 내 연구에 기초한 독성 연구는 가장 정확한 방법이 남아있다. 그러나, 그들의 사용은 자신의 비용, 노동과 시간 요구 사항 (1)에 의해 제한된다. 대안, 시험 관내 분석은 그들의 단순성 및 시험 관내 시험에서 플랫폼이 높은 처리량을 개발의 가능성으로서 사용되고있다 - 그렇게 시험 조건의 수를 확장. 대부분의 nanotoxicological 연구는 불멸화 세포주와 체외 분석에 사용하여 수행됩니다. 그러나, 생체 내 독성 학적 영향 (3)이 실험 결과의 추정에 대한 우려가있다. 실제로, 불멸화 세포주의 특성들이 조직으로부터 유래 된, 예를 들어 유전 적 변형 4 열쇠 형태 적 특징의 열화와 크게 상이 할 수있다5, 6 및 셀룰러 극성 염증성 매개체 (7)의 조정 등의 기능 변화의 손실. 쿠퍼 세포는 체내에서 가장 풍부한 식세포 인구이며 간 정현파의 벽을 라이닝하여 혈액과 직접 접촉한다. 세망 내피 시스템 (RES)의 일환으로,이 대 식세포는 나노 입자를 순환하기 때문에 캡처에 대한 책임, 나노 입자의 독성을 연구하기 위해 매우 적합 모델을 구성한다. 생체 내 (8) 체외에서 나노 입자에 노출 쿠퍼 세포와 관련된 염증 반응의 9 연구는 다른 곳에서 발표되었다. 쿠퍼 세포는 또한 알콜 성 간 질환 (10), 간 섬유증 (11) 또는 (12)로 바이러스 성 간염, 간 질환의 발병 기전에 관여하고있다. 그것은 절연 쿠퍼 세포가 세포기구 반전을 설명하는 유용한 통찰을 제공 할 것으로 알려졌다간 장애 (13, 14)에 olved. 여러 방법은 분리 및 쿠퍼 세포를 정화하는 것으로보고되었다. 세포 분리는 기계적 또는 효소 분해 (15)에서 발생할 수 있습니다. 콜라게나 제 소화 높은 쿠퍼 세포의 생산량 (16)에 이르는 동안, 쿠퍼 세포의 기능적 완전성을 보존하는 장점을 보여준다. 복잡성과 비용 가변 많은 실험 방법은, 다른 간세포 집단에서 쿠퍼 세포를 분리하는데 사용되어왔다. 예를 들면, 쿠퍼 세포 면역 순도 17 전기 흐름 (18) (16)에 의해 선택적으로 부착 또는 크기와 밀도에 따라 세포를 원심 선택 기법 (16)에 의해 달성 될 수있다. 이들 방법의 조합이 인구 (16)의 순도를 증가시키기 위해 선택 될 수있다. 그것은 대부분의 응용 프로그램 및 사용 가능한 기술 장비에 따라 달라집니다로 쿠퍼 세포 분리를위한 이상적인 방법에 대한 합의는 없다T. 그러나, 나노 입자의 독성 시험의 경우에는, 단순 및 쿠퍼 세포의 보존 기능과 관련된 기술의 높은 수율이 애플리케이션에 가장 적합한 것으로 나타났다. 여기에보고 된 쿠퍼 세포 분리 방법은 밀도 구배에 의해 정제 하였다 2 단계 관류 법에 기초한다. 방법은 Smedsrød 동부 등에 의해 개발 된 기존의 프로토콜에서 변성시켰다. 16 래트 간세포 분리 설계된. 대부분의 연구는보고 된 쥐의 간에서 쿠퍼 세포의 분리를 설명. 여기서, 우리는 높은 수율 및 순도, 마우스 간에서 쿠퍼 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 마우스의 사용은 실험 비용을 감소시키고, 간 몇몇의 처리는 나노 입자에 대한 독성 시험 쿠퍼 세포 다량 수득 할 수있다. 다음의 프로토콜에서, 쿠퍼 세포 (F 기능화 된 탄소 나노 튜브와 함께 배양 하였다 </EM&gt; -CNTs). 탄소 나노 튜브의 고유의 물리 화학적 특성 - 치료 및 진단 목적을위한 벡터로서 CNT를 흥미 후보 만든, 직경 비 표면적이 높은 길이 즉. 그러나, 문제는 탄소 나노 튜브 (19)의 독성 및 시험 관내 시험에서의 새로운 개발 CNT 생물학적 효과의 이해를 증가시키는 것을 목적 관한 제기되었다. 쿠퍼 세포 독성은 세포막의 구조적 무결성의 부족과 관련된다. 이것은 상등액으로 세포로부터 세포질 효소 LDH의 손실에 의해 측정된다. 이 방법의 원리에 따라서, 어떤 공개 LDH를 제거하고, 세포 (20)에 남아 있는지를 측정하는 것이다. 상등액 중 탄소 나노 튜브의 존재는 21 분석법을 방해하기 때문 상청 LDH 방출의 측정에 우선하여 수행된다. 우리는이 간단하고 비용 효과적인 쿠퍼 세포 분리 운전 방식의 사용을 제안D는 기능 쿠퍼 세포의 높은 숫자를 분리합니다. 이는 관련 차 대식 세포 모델에서, 나노 입자의 범위의 독성 검사를 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital sodium)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 mice</td><td>Charles River&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS (Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;and Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free, with bicarbonate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS must be&amp;nbsp; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; free.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>E8145&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;selectively.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15630-056&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase type IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>CSL-4&amp;nbsp;</td><td>It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Low glucose DMEM&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D5523&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12633-012&amp;nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>First-Link&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>60-00-850&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan blue solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coated silica particle solution (Percoll)</td><td>GE Healtcare&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>17-0891-02&amp;nbsp;</td><td>Percoll&amp;reg; is very stable and can be kept for several years&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>D/4120/PB08&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LDH kit (CytoTox 96)&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G1781&amp;nbsp;</td><td>Keep protected from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM phenol red free</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>31053-028&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>F4/80 antibody (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Do not dilute, used neat for flow cytometry</td></tr><tr><td>Fluorescent beads</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td></tr><tr><td>Name of the Material</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>367288</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.22 &amp;mu;m Blue Rim)&amp;nbsp;</td><td>Minisart&amp;nbsp;</td><td>16534-K&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>35 2070&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (90 x 15 mm)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BSN 101VR20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump&amp;nbsp;</td><td>Watson Marlow&amp;nbsp;</td><td>SciQ 300&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine forceps</td><td>Hammacher GmbH&amp;nbsp;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow cytometry tubes</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&amp;nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td></tr><tr><td>Name of the Reagent</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#039;s Balanced Salt Solution) Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Isolation Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Culture Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td><td></td><td></td><td>Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp; with 15.3 ml of Percoll&amp;reg; to obtain 17mL of SIP.</td></tr><tr><td>25% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>DMEM media with 0.9% Triton X-100</td></tr><tr><td>PBS/BSA Solution</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

시험 관내 연구 nanotoxicological 대다수는 실용성 불멸화 세포주를 사용 하였다. 그러나, 불멸화 세포주 또는 일차 전지에 나노 입자 독성 시험의 결과는 시험 관내 분석법 일차 전지의 사용을 확장 할 필요성을 강조 불일치를 보여 주었다. 이 프로토콜은 마우스 간 대 식세포의 분리라는 쿠퍼 ​​세포 및 나노 입자의 독성을 연구하는 사용을 설명합니다. 쿠퍼 세포는 체내에서 가장 풍부한 식세포 인구이며, 나노 입자 순환 캡쳐 책임 세망 내피 체계 (RES)의 일부를 구성한다. 여기에보고 된 쿠퍼 세포 분리 방법은 밀도 구배에 의해 정제 하였다 2 단계 관류 법에 기초한다. 콜라게나 제 소화 밀도 원심 분리에 기초한 방법은, Smedsrød 동부 등에 의해 개발 된 기존의 프로토콜에서 적응된다. 래트 간세포 isolatio 설계된N과 높은 수율을 제공하며, 쿠퍼 세포의 고순도 (&gt; 95 %) (14 × 10 (6) 마우스 당 세포까지). 이 분리 방법은 복잡한 또는 고가의 장비를 필요로하기 때문에 복잡성과 세포 수율 사이의 이상적인 타협을 대표하지 않습니다. 무거운 마우스 (35-45g)의 사용은 분리 방법의 수율을 현저하게 향상시킬뿐만 아니라, 문맥 삽관의 절차를 용이하게한다. -CNTs F 기능화 된 탄소 나노 튜브의 독성 변성 LDH 분석으로이 모델에서 측정되었다. 이 방법은 F -CNTs 함께 배양 후 쿠퍼 세포막의 구조적 무결성의 부족을 측정함으로써 세포 생존 능력을 평가한다. F -CNTs 의해 유도 된 독성 절연 쿠퍼 세포 나노 독성 시험에 유용한 것을 강조,이 분석을 이용하여 지속적으로 측정 할 수있다. 나노 독성학의 전반적인 이해는 임상 번역 더 effi의 나노 입자 선택을, 같은 모델의 혜택을 누릴 수 있습니다효율적인.

비 정제 실질 세포의 수와 일치 하였다 (절연 부 (17)를 실시했다) 마우스 당 6 10 8 내지 14 X 세포였다. 각 마우스 격리는 16-28 우물을 판에 충분했다. 트립 판 블루 염색법에 의해 세포 생존율은 세포 생존 ~ 95 %를 보였다. 쿠퍼 세포들은 불완전한 접착 형태 (도 4a)과 관련된, 37 ° C에서 배양 한 후 30 분 이내에 둥근 형상을 나타내었다. 4 시간 배양과 이후에, 세포는 확산 및 세포 ?...

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Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

나노 입자 독성 테스트를위한 쿠퍼 세포 격리

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.6K 조회수.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

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Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

우라늄에서 구리 산화물 나노 입자에 의한 미량 원소의 제거<em&gt; 현장에서</em&gt; 복구 블리드 물과 세포 생존에 미치는 영향

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

연구

환경과학

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

면역학 및 감염병학

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

생체공학

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor cells, CAFs regulate tumor progression and provide protection from antitumor immunity. Emerging anticancer strategies aim to remodel the tumor microenvironment through the ablation of pro-tumorigenic CAFs or reprogramming of CAFs functions and their activation status. A promising approach is the development of nanosized delivery agents able to target CAFs, thus allowing the specific delivery of drugs and active molecules. In this context, a cellular model of CAFs may provide a useful tool for in vitro screening and preliminary investigation of such nanoformulations.
This study describes the isolation and culture of primary CAFs from the syngeneic 4T1 murine model of triple-negative breast cancer. Magnetic beads were used in a 2-step separation process to extract CAFs from dissociated tumors. Immunophenotyping control was performed using flow cytometry after each passage to verify the process yield. Isolated CAFs can be employed to study the targeting capability of different nanoformulations designed to tackle the tumor microenvironment. Fluorescently labeled H-ferritin nanocages were used as candidate nanoparticles to set up the method. Nanoparticles, either bare or conjugated with a targeting ligand, were analyzed for their binding to CAFs. The results suggest that ex vivo extraction of breast CAFs may be a useful system to test and validate nanoparticles for the specific targeting of tumorigenic CAFs.

This paper aims to provide a protocol for the isolation and culture of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of triple-negative breast cancer and their application for the preclinical study of novel nanoparticles designed to target the tumor microenvironment.&#160;

표적 나노 입자의 연구를 위한 유방암의 합성 Murine 모형에서 1 차적인 암 관련섬유세포의 격리

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

암 연구학

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

나노 입자 신경 독성을 결정하는 대리 바이오 센서로 미세 아교 세포

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

신경과학

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

생물학

Isolation and Culture of Mouse Kupffer Cells

Source: Bourgognon, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52989">Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation of Kupffer cells or liver macrophages from the mouse liver. The liver is perfused with a digestion solution followed by density gradient separation. The isolated adherent Kupffer cells can be used for further analysis.

Mouse Kupffer 세포의 분리 및 배양

Source: Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation ...