This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes e regulamentos relevantes e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do regulamento escritório UK Home 1. Perfusão e Cobrança celular (Figura 1) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figura 1:. Perfusão do fígado Após anestesia do rato, o tracto digestivo está deslocado lateralmente para a esquerda do abdómen de modo a tornar a veia porta (VP) acessível. O PV é canulada usando uma taxa de fluxo lento (1-3 mL / min) de solução de EGTA / HBSS e a veia veina inferior (IVC) é rompido imediatamente para evitar qualquer excesso de pressão dentro do fígado. Dentro da primeira hora de perfusão, a taxa de fluxo é aumentada gradualmente até 7 ml / min. A solução de colagenase é então perfundido a 10 ml / min, até que a sua digestão completa seja alcançada. <ol><li> Prepare recém todos os reagentes descritos na tabela de material. </li><li> Aquece-se a EGTA (etileno-glicol Tetra-ácido acético) / HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) de solução (50 ml por ratinho) e a solução de colagenase (100 ml por rato) durante 30 min a 40 ° C. </li><li> Lavar a bomba de tubo flexível primeiro com etanol 70%. Pour 40 ml de EGTA / solução de HBSS para um tubo de centrífuga imerso no banho de água e lavar a tubagem flexível com bomba de pré-aquecida de EGTA / solução de HBSS. </li><li> Realizar anestesia terminal usando um barbitúrico para produzir de forma confiável inconsciência antes que a depressão respiratória e morte. Injectar fenobarbitona a 1 mg / kg, ip num ratinho CD1 macho ou fêmea (35-45 g). Confirme a anestesia por beliscar dedo do pé. </li><li> Raspar os pêlos abdominais e esterilizar a superfície abdominal utilizando uma solução de etanol a 70%. </li><li> Cortar através da cavidade abdominal e expor a veia porta e veia cava inferior, movendo o intestino lateralmente para a esquerda do abdómen. </li><li> Estrelat a bomba a uma velocidade de 1-3 ml / min com solução de EGTA / HBSS e canular a veia portal usando uma agulha de borboleta de 23 g (asas corte). Prender a secção da veia porta canulada com a agulha 23 G e em seguida virar a pinça serrefine na superfície do abdómen aberto rato. O fígado deve rapidamente pálido nos primeiros 30 segundos de EGTA / Solução HBSS perfusão. </li><li> Rapidamente incisar a parte inferior da veia cava inferior para evitar a formação de excesso de pressão no fígado, e em seguida aumentar progressivamente o caudal de 7 ml / min, ao longo do primeiro minuto de perfusão. O animal morre devido a hemorragia secundária à da veia cava punção venosa. </li><li> Quando menos de 5 ml de EGTA / Solução HBSS é remanescente no tubo de centrífuga, encha-o com solução de colagenase (40-50 ml). Aumentar a taxa de fluxo gradualmente para 10 ml / min, ao longo de 30 seg. </li><li> Faça o swell fígado, aplicando pressão para a veia cava inferior, usando uma pinça, por 5-10 intervalos seg. This pode ser feito periodicamente (5-10 vezes durante a digestão). Este passo vai melhorar a dissociação das células do fígado e reduzir o tempo de perfusão com colagenase. </li><li> Quando menos do que 10 ml de solução de colagenase permanece dentro do tubo de centrifugação, derrame 40-50 mL de solução pré-aquecida de colagenase no tubo de centrífuga. </li><li> Após 10-15 min de perfusão e cerca de 70-80 ml de solução de colagenase perfundidos, aplicar uma pequena pressão sobre a superfície do fígado com uma pinça. Uma cópia da pressão indica que as células do fígado são dissociados. </li><li> Remover o fígado a partir da cavidade abdominal como uma só peça e colocá-lo em um tubo de centrífuga contendo 20-30 ml de células de Kupffer de isolamento médio. Mantenha as células do fígado em gelo ou a 4 ° C por um período máximo de 3 horas para evitar que afetam a viabilidade das células do fígado. </li><li> Repetir o procedimento de perfusão em vários animais, se necessário, ao mesmo tempo manter o fígado perfundido em gelo. Piscina 1-3 fígados para purificação e prosseguir com a fase 3. </li></ol> 2. Preparação do por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 2) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figura 2:. Preparação do gradiente de densidade Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. O SIP é preparado por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. A 5 ml de SIP são misturados com 15 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP são misturados com 10 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 50%. Um tubo de centrífuga contendo a solução de 50% de SIP (20 ml) é inclinada e a solução SIP 25% (20 ml) é adicionado lentamente, utilizando uma pipeta serológica 25 ml. <ol><li> Continue com as seguintes etapas (seção 2., 3. e 5.) sob condições estéreis e manter as células em gelo ou a 4 ° C. Prepara-se o SIP (Solução isotónica de partículas de sílica revestidas) por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. </li&gt; <li> Para fazer 20 ml de solução SIP 25%, mistura 5 ml de SIP com 15 ml de PBS. Para fazer 20 ml de solução SIP 50%, mistura de 10 ml de SIP com 10 ml de PBS. </li><li> Encher um tubo de centrífuga com 20 ml de solução a 50% de SIP. Inclinar o tubo de centrifugação com um ângulo próximo de 90 ° e adiciona-se lentamente a solução SIP 25% (20 ml) na parede lateral do tubo utilizando uma pipeta de 25 ml serológico, sem tocar na superfície da camada de SIP 50%. Quando a adição da solução SIP 25%, reduzir progressivamente o ângulo do tubo. Manter o gradiente de densidade em gelo até à utilização. </li></ol> 3. Purificação de Kupffer celular (Figura 3) <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figura 3:. Purificação de Kupfer células por centrifugação em gradiente de densidade e adesão celular Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. (A) após a ruptura da cápsula de Glisson, células do fígado são filtrados através de um 100 mm filtro. A suspensão é centrifugada a 50 x g para descartar hepatócitos (granulados) e recolher a fracção de células não-parenquimatosas (sobrenadante). Este passo é repetido três vezes. As células não-parenquimatosas são adicionadas no topo de um gradiente descontínuo isotónica e centrifugado a 800 xg durante 15 min. Células de Kupffer recolhidos a partir da almofada SIP 25% são purificados adicionalmente por selecção de adesão celular. (B) As células foram semeadas em placa de 24 poços e incubou-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 30 min. As células não aderentes são lavadas uma vez com 500 ul de HBSS. Células de Kupffer exibir a sua morfologia aderente 4 h após o plaqueamento, quando -CNTs f pode ser adicionado às células. A barra de escala representa 25 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Coloque um fígado perfundido em uma placa de Petri com 15 ml de Kupffer isolamento celular Médio. A ruptura da cápsula de Glisson (membrana do fígado), utilizando tesouras e libertar todas as células do fígado para o meio de isolamento de células de Kupffer. Filtrar a solução através de uma filtro de células 100 um a ser coletado em um tubo de centrífuga. Repita o procedimento de perfusão em fígados perfundidos adicionais e reunir as células no mesmo tubo de centrífuga (15 ml de um rato, até 45 ml de três ratos). </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Células parenquimatosas (hepatócitos) será no sedimento e células não-parenquimatosas (incluindo células de Kupffer) será no sobrenadante. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante num tubo de centrífuga limpo e centrifuga-se a 50 x g durante 2 minutos cada. Repita este passo três vezes mais. </li><li> Centrifugar a 1.350 xg durante 15 min para sedimentar as células não-parenquimatosas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de isolamento de células de Kupffer Médio. </li><li> Adicionar a solução de células não-parenquimatosas sobre o gradiente descontínuo isotónica 25/50%, tal como descrito em 2.3. Centavorifuge a 850 g durante 15 min sem aceleração ou pausa. </li><li> Localizar a fracção de célula de Kupffer enriquecido turvas na fracção SIP 25% nas proximidades da interface de SIP 25/50% (Figura 3). Utilizando uma pipeta de 10 mL serológico, aspirado de cerca de 12 ml da fracção de células enriquecida de Kupffer. Transferência de células para um tubo de centrífuga contendo 35-40 ml de isolamento de células de Kupffer meio. Misturar suavemente e centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as células. </li><li> Descarte as células sobrenadante e ressuspender em 5-10 ml de pré-aquecido celular Kupffer Meio de Cultura. Contagem de células (hemocitï¿½etro) e medir a viabilidade utilizando a coloração azul de tripano. </li><li> Placa as células não-parenquimatosas purificados em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10 5 células / poço. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 (Figura 3). Após 30 min, remover suavemente o meio, lava-se com pré-aquecido Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS), em seguida, uma vez substituircom 500 ul de fresco e pré-aqueceu-se Meio de Cultura celular de Kupffer (por poço). </li><li> Deixar as células de Kupffer durante pelo menos 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2 antes do tratamento com nanopartículas, para permitir que eles adquirem a sua morfologia aderente. </li></ol> 4. Caracterização <ol><li> As células Kupffer Pureza <ol><li> Preparar a solução de PBS / BSA fresca utilizada para manter a viabilidade das células de Kupffer. Lave as células uma vez com 500 ul de solução de PBS / BSA. Remover a solução de PBS / BSA e separar as células de Kupffer em 500 uL de solução de PBS / BSA fresco utilizando raspagem suave. Quando as células são plaqueadas em placas de 24 poços, encurtam as extremidades de lâminas de raspagem com uma tesoura para fazer a separação mais fácil de prosseguir. Transferência de células em tubos de citometria de fluxo. </li><li> Contagem de células de Kupffer, utilizando um hemocitómetro e centrifuga-se 1 x 10 5 células a 1350 x g. Ressuspender as células de Kupffer em 30 ul de F4 / 80 anticorpo (puro). Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Manter as células não coradas (não incubadas com o anticorpo) em gelo. </li><li> Adicionar 2 ml de solução de PBS / BSA em células coradas, centrifugar a 1350 g durante 5 min e desprezar o sobrenadante resultante. Ressuspender as células coradas em 200 ul de PBS / BSA. </li><li> Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-1 canal. </li><li> Repita o procedimento para as células de Kupffer manchadas mantendo as mesmas configurações utilizadas para a análise de citometria de fluxo de células de Kupffer não coradas. Escolher e quantificar a fluorescência de células coradas para avaliar a pureza de célula de Kupffer. </li></ol></li><li> Kupffer células fagocíticas Atividade <ol><li> Substituir meios com 0,5% (v / v) de partículas fluorescentes de Kupffer em meio de cultura celular e incubar durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> A fim de remover os grânulos não-internalizados, centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, diScard o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de PBS / BSA. Repita este passo mais 2 vezes. </li><li> Raspe células de Kupffer em 500 ul de células e de transferência de solução de PBS / BSA para um tubo de citometria de fluxo. </li><li> Centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, descartar as células sobrenadante e ressuspender em 200 ul de PBS / BSA. </li><li> Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-2 canais. </li></ol></li></ol> 5. Incubação de Quimicamente nanotubos de carbono funcionalizados (f -CNTs) <ol><li> Prepara-se uma dispersão de -CNTs f (1 mg / ml) em água por sonicação durante 15 min antes da utilização. -CNTs F são preparados em casa 22. </li><li> Prepare 2x CNTs concentrados f- dispersão em Kupffer meio de cultura celular. CNT f- sonicate dispersos em meio para2 min antes de prosseguir com o passo 5.3). </li><li> Para cada bem, substituir 250 ï¿½ de meio de idade com 250 ul de 2x dispersão -CNTs f. Poços não tratados (250 ul de meio condicionado + 250 ul de células de Kupffer fresco meio de cultura) e os poços tratados com 10% de DMSO são utilizados como controlo negativo e positivo, respectivamente. </li><li> Incubar as células de Kupffer a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 ou 72 h. </li></ol> 6. Avaliação da Toxicidade -CNTs f em células de Kupffer pela lactato desidrogenase (LDH) Ensaio de modificação <ol><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 200 uL (por poço da placa de 24 poços) de tampão de lise e incubar a 37 ° C durante 30 min-1 h. </li><li> Após a realização de pipetagem vigorosa, recolher lisadas células de Kupffer em tubos de microcentrifugação e centrifugar a 40000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que foram absorvidos pelas células e os restos celulares. </li><li> Recolher os sobrenadantes (ƒ-CNT livre) emmicrotubos e armazenar a -20 ° C ou vá para o passo 6.5). </li><li> Transferir 50 ul numa placa de 96 cavidades e adicionar um volume igual da solução de mistura de substrato (kit de LDH) a cada poço. Cobrir a placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes da adição de 50 ul da solução de paragem (kit de LDH). Adicionar triplicados de poços em branco, contendo 50 ul de tampão de lise, 50 ul de solução de mistura de substrato e 50 ul de solução de paragem. </li><li> Ler a absorvância a 490 nm num leitor de microplacas e utilizar a seguinte fórmula para calcular a (%) de viabilidade celular. </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Os passos seguintes são fundamentais para alcançar alta produtividade e alta viabilidade das células de Kupffer. Condições assépticas devem ser usadas para limitar o risco de contaminação bacteriana e fúngica. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes da utilização. Os reagentes devem ser preparadas antes de realizar o procedimento de isolamento. A escolha de colagenase IV, com baixa atividade tríptico, é crucial. Lotes diferentes do mesmo fornecedor tem actividade enz...

O campo da pesquisa nanotoxicology tem como objetivo caracterizar o efeito biológico das nanopartículas. Estudos toxicológicos in vivo com base em investigações continuam a ser os métodos mais precisos. No entanto, seu uso é limitado pelo seu custo, trabalho e requisitos de tempo um. Como alternativas, em ensaios in vitro têm sido utilizados por causa da sua simplicidade e da possibilidade de desenvolvimento de alto rendimento em plataformas de ensaios in vitro, 2 - estendendo-se assim o número de condições testadas. A maioria dos estudos nanotoxicological são realizados utilizando ensaios in vitro com linhas de células imortalizadas. Contudo, existem preocupações em relação à extrapolação destes resultados experimentais in vivo para efeitos toxicológicos 3. Na verdade, as propriedades das linhas celulares imortalizadas pode ser significativamente diferentes dos tecidos que foram derivados a partir de, por exemplo, transformação genética 4, deterioração das características morfológicas principais5, perda da polaridade celular 6 e alterações funcionais, tais como a regulação de mediadores inflamatórios 7. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e estão em contacto directo com o sangue, forrando a parede de sinusóides do fígado. Como parte do sistema reticulo-endotelial (RES), estes macrófagos são responsáveis ​​para a captura de nanopartículas de circulação e, por conseguinte, constituir um modelo altamente adequado para estudar a toxicidade de nanopartículas. In vivo 8 9 e in vitro estudos de respostas inflamatórias associadas com as células de Kupffer expostos a nanopartículas ter sido publicado anteriormente. Células de Kupffer também foram envolvidos na patogênese de doenças do fígado, como a doença hepática alcoólica 10, 11 fibrose hepática ou hepatite viral 12. Foi relatado que células de Kupffer isolado fornecer indicações úteis para descrever os mecanismos celulares involved em perturbações do fígado 13,14. Vários métodos têm sido relatados para isolar e purificar as células de Kupffer. Isolamento das células pode resultar de dissociação mecânica ou enzimática 15. Digestão de colagenase mostra a vantagem de conservar a integridade funcional das células de Kupffer, enquanto conduzindo a elevada produção de células de Kupffer 16. Muitas abordagens experimentais, que variam em complexidade e custos, foram usados ​​para separar células de Kupffer de outras populações de células de fígado. Por exemplo, células de Kupffer pureza pode ser conseguida por imunoafinidade 17, electroforese de fluxo 18, 16 a adesão selectiva ou por técnicas de centrífugas 16, que seleccionam as células de acordo com o seu tamanho e densidade. Uma combinação destes métodos podem ser escolhidos para aumentar a pureza da população 16. Não há consenso sobre o método ideal para o isolamento de células Kupffer, uma vez que na maior parte depende das aplicações e equipmen disponíveist. No entanto, no caso dos ensaios de toxicidade de nanopartículas, a simplicidade e elevado rendimento da técnica associada com a preservação funcional das células de Kupffer parecia ser mais adequado para esta aplicação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método foi modificado a partir do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et al. 16 concebido para o isolamento de células de fígado de rato. A maioria dos estudos relatados e descrito o isolamento de células de Kupffer do fígado de ratos. Aqui, nós descrevemos um método para isolar as células de Kupffer do fígado de rato, com um rendimento elevado e pureza. A utilização de ratinhos reduz o custo experimento e permite o processamento de vários fígados para obter grandes quantidades de células de Kupffer para testes de toxicidade de nanopartículas. No protocolo seguinte, as células de Kupffer foram incubadas com os nanotubos de carbono funcionalizadas (f </em&gt; -CNTs). As propriedades físico-químicas únicas de nanotubos de carbono - ou seja, alta proporção de comprimento para diâmetro e grande área superficial, fez CNT candidatos interessantes como vectores para fins de terapia e de diagnóstico. No entanto, têm surgido preocupações quanto à toxicidade dos nanotubos de carbono 19, e o desenvolvimento de novos ensaios in vitro destina-se a aumentar a compreensão das CNT efeito biológico. Toxicidade em células de Kupffer é associada com uma falta de integridade estrutural da membrana celular. Isto é medido pela perda da enzima LDH do citoplasma da célula para o sobrenadante. O princípio deste método é, portanto, para remover qualquer LDH libertada e medir o que é deixado nas células 20. Isto é feito, de preferência a medição do LDH libertado no sobrenadante, pois a presença de nanotubos de carbono no sobrenadante interfere com o ensaio de 21. Propomos o uso deste eficaz meto Kupffer isolamento de células simples e de custod para isolar elevado número de células de Kupffer funcionais. Isto permite o rastreio de toxicidade de uma grande variedade de nanopartículas, num modelo relevante macrófagos primários.

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital sodium)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 mice</td><td>Charles River&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS (Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;and Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free, with bicarbonate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS must be&amp;nbsp; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; free.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>E8145&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;selectively.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15630-056&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase type IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>CSL-4&amp;nbsp;</td><td>It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Low glucose DMEM&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D5523&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12633-012&amp;nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>First-Link&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>60-00-850&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan blue solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coated silica particle solution (Percoll)</td><td>GE Healtcare&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>17-0891-02&amp;nbsp;</td><td>Percoll&amp;reg; is very stable and can be kept for several years&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>D/4120/PB08&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LDH kit (CytoTox 96)&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G1781&amp;nbsp;</td><td>Keep protected from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM phenol red free</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>31053-028&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>F4/80 antibody (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Do not dilute, used neat for flow cytometry</td></tr><tr><td>Fluorescent beads</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td></tr><tr><td>Name of the Material</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>367288</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.22 &amp;mu;m Blue Rim)&amp;nbsp;</td><td>Minisart&amp;nbsp;</td><td>16534-K&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>35 2070&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (90 x 15 mm)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BSN 101VR20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump&amp;nbsp;</td><td>Watson Marlow&amp;nbsp;</td><td>SciQ 300&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine forceps</td><td>Hammacher GmbH&amp;nbsp;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow cytometry tubes</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&amp;nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td></tr><tr><td>Name of the Reagent</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#039;s Balanced Salt Solution) Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Isolation Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Culture Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td><td></td><td></td><td>Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp; with 15.3 ml of Percoll&amp;reg; to obtain 17mL of SIP.</td></tr><tr><td>25% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>DMEM media with 0.9% Triton X-100</td></tr><tr><td>PBS/BSA Solution</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

A grande maioria dos estudos in vitro nanotoxicological usaram linhas celulares imortalizadas para a sua viabilidade. No entanto, os resultados de testes de toxicidade de nanopartículas em linhas de células imortalizadas ou células primárias têm mostrado discrepâncias, destacando a necessidade de estender o uso de pilhas para ensaios in vitro. Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos de fígado de rato, células de Kupffer nomeados, e a sua utilização para estudar a toxicidade das nanopartículas. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e fazem parte do sistema retículo endotelial (RES), responsável pela captura de nanopartículas de circulação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método, baseado na digestão com colagenase e centrifugação de densidade, é uma adaptação do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et ai. projetado para rato isolatio células do fígadon e proporciona um rendimento elevado (até 14 x 10 6 culas por ratinho) e de alta pureza (&gt; 95%) das células de Kupffer. Este método de isolamento não requer equipamento sofisticado e caro e, por conseguinte, representa um compromisso ideal entre a complexidade e de rendimento celular. A utilização de ratos mais pesados ​​(35-45 g) melhora o rendimento do método de isolamento, mas também facilita notavelmente o procedimento de canulação da veia porta. A toxicidade de nanotubos de carbono funcionalizadas f -CNTs foi medido neste modelo pelo ensaio de LDH modificado. Este método avalia a viabilidade das células medindo a falta de integridade estrutural da membrana da célula de Kupffer, após incubação com -CNTs f. Toxicidade induzida pelo -CNTs f pode ser medido de forma consistente com este ensaio, destacando que as células de Kupffer isoladas são úteis para testes de toxicidade das nanopartículas. A compreensão global do nanotoxicology poderiam se beneficiar de tais modelos, tornando a seleção de nanopartículas para tradução clínica mais eficient.

O número de células não-parenquimatosas purificadas foi consistente e variou entre 8 e 14 x 10 6 culas por rato (17 isolamentos foram realizadas). Cada isolamento do mouse foi suficiente para a chapa 16-28 poços. A viabilidade das células por coloração com azul de tripano demonstrou a viabilidade das células ~ 95%. Células de Kupffer mostrou uma forma redonda dentro de 30 min de incubação a 37 ° C, relacionada com a sua morfologia aderente incompleta (Figura 4A). Às 4 horas de in...

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Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.7K visualizações.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

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Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

A remoção do Trace Elements por Óxido de Cupric nanopartículas de urânio<em&gt; In Situ</em&gt; Recuperação sangro água e seu efeito na viabilidade celular

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

Ambiente

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Imunologia e Infecção

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Bioengenharia

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor cells, CAFs regulate tumor progression and provide protection from antitumor immunity. Emerging anticancer strategies aim to remodel the tumor microenvironment through the ablation of pro-tumorigenic CAFs or reprogramming of CAFs functions and their activation status. A promising approach is the development of nanosized delivery agents able to target CAFs, thus allowing the specific delivery of drugs and active molecules. In this context, a cellular model of CAFs may provide a useful tool for in vitro screening and preliminary investigation of such nanoformulations.
This study describes the isolation and culture of primary CAFs from the syngeneic 4T1 murine model of triple-negative breast cancer. Magnetic beads were used in a 2-step separation process to extract CAFs from dissociated tumors. Immunophenotyping control was performed using flow cytometry after each passage to verify the process yield. Isolated CAFs can be employed to study the targeting capability of different nanoformulations designed to tackle the tumor microenvironment. Fluorescently labeled H-ferritin nanocages were used as candidate nanoparticles to set up the method. Nanoparticles, either bare or conjugated with a targeting ligand, were analyzed for their binding to CAFs. The results suggest that ex vivo extraction of breast CAFs may be a useful system to test and validate nanoparticles for the specific targeting of tumorigenic CAFs.

This paper aims to provide a protocol for the isolation and culture of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of triple-negative breast cancer and their application for the preclinical study of novel nanoparticles designed to target the tumor microenvironment.&#160;

Isolamento de fibroblastos associados ao câncer primário de um modelo de murina síndica do câncer de mama para o estudo de nanopartículas-alvo

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Pesquisa do câncer

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Neurociência

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Biologia

Isolation and Culture of Mouse Kupffer Cells

Source: Bourgognon, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52989">Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation of Kupffer cells or liver macrophages from the mouse liver. The liver is perfused with a digestion solution followed by density gradient separation. The isolated adherent Kupffer cells can be used for further analysis.

Isolamento e cultura de células de Kupffer de camundongo

Source: Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation ...