Name: kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing at JoVE.com

This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden durchgeführt. Das Protokoll demonstriert wurde unter der Leitung und Genehmigung des britischen Innenministeriums Regelung durchgeführt 1. Perfusion and Cell Collection (Figur 1) <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Abb. 1: Leberperfusion Nach Anästhesie der Maus, der Verdauungstrakt ist seitlich nach links des Bauches, um die Pfortader (PV) zugänglich zu machen bewegt. Der Istwert mit einer langsamen Flussgeschwindigkeit (1-3 ml / min) von EGTA / HBSS-Lösung und die untere Veina cava (IVC) kanüliert sofort aufgebrochen, um überschüssige Druck in der Leber zu vermeiden. Innerhalb der ersten Minute der Perfusion wird die Fließgeschwindigkeit allmählich zu 7 ml / min erhöht. Die Collagenase-Lösung wird dann bei 10 ml / min perfundiert, bis zu seiner vollständigen Verdauung erreicht wird. <ol><li> PrepaWieder frisch alle in der Materialtabelle beschriebenen Reagenzien. </li><li> Warm das EGTA (Ethylenglykol-Tetra-Essigsäure) / HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Lösung (50 ml pro Maus) und die Kollagenase-Lösung (100 ml pro Maus) 30 Minuten lang bei 40 ° C. </li><li> Zuerst mit 70% Ethanol spülen Sie den flexiblen Pumpschlauch. Gießen Sie 40 ml EGTA / HBSS-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen im Wasserbad getaucht und spülen Sie den flexiblen Pumpschlauch mit vorgewärmter EGTA / HBSS Lösung. </li><li> Führen Terminal Anästhesie mit einem Barbiturat zuverlässig Bewusstlosigkeit erzeugen, bevor die Atemdepression und Tod. Injizieren Phenobarbital bei 1 mg / kg, ip in einen weiblichen oder männlichen CD1-Maus (35-45 g). Bestätigen Sie die Anästhesie durch toe Kneifen. </li><li> Rasieren Bauchhaare und sterilisieren die Bauchfläche mit 70% Ethanol-Lösung. </li><li> Messer durch die Bauchhöhle und setzen die Pfortader und Vena cava inferior durch Bewegen des Darms seitlich nach links des Bauches. </li><li> Start die Pumpe bei einer Geschwindigkeit von 1-3 ml / min mit EGTA / HBSS-Lösung und kanülieren die Pfortader mit einer 23 g Schmetterlingsnadel (Flügel geschnitten). Klemmen Sie den Abschnitt der Pfortader mit der 23 G-Nadel einer Kanüle versehen, und dann drehen Sie die serrefine Zange an der Oberfläche des geöffneten Mausunterleib. Die Leber sollte rasch blass innerhalb der ersten 30 sec von EGTA / HBSS-Lösung Perfusion. </li><li> Der untere Teil der unteren Hohlvene rasch einzuschneiden, um überschüssige Druckaufbau in der Leber vermieden, und erhöhen die Fließgeschwindigkeit allmählich zu 7 ml / min, über der ersten Minute der Perfusion. Das Tier stirbt wegen Blutungen sekundär zu Venenpunktion Vena cava. </li><li> Wenn weniger als 5 ml EGTA / HBSS Lösung wird in die Zentrifugenröhrchen verbleibenden, füllen Sie es mit Kollagenase-Lösung (40-50 ml). Erhöhung der Strömungsrate allmählich auf 10 ml / min, über 30 sec. </li><li> Stellen Sie die Leber anschwellen, indem Druck auf die untere Hohlvene, mit einer Pinzette, für 5-10 sec Intervallen. This kann in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden (5-10 mal während der Verdauung). Mit diesem Schritt wird die Leberzelle Dissoziation zu verbessern und mit Collagenase reduzieren die Durchblutung Zeit. </li><li> Wenn weniger als 10 ml Kollagenase-Lösung innerhalb des Zentrifugenröhrchens bleibt, gießt 40-50 ml vorgewärmtes Collagenaselösung in dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Nach 10-15 min Perfusion und etwa 70-80 ml Kollagenase-Lösung perfundiert, eine kleine Druck auf die Oberfläche der Leber mit einer Pinzette. Ein Druck des Druck zeigt an, dass Leberzellen dissoziiert. </li><li> Entfernen Sie die Leber aus der Bauchhöhle als ein Stück und legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen mit 20-30 ml Kupffer-Zellen Isolierung Medium. Halten Sie Leberzellen auf Eis oder bei 4 ° C für einen Zeitraum von maximal 3 Stunden zu vermeiden, die Leberzelllebensfähigkeit. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang auf Perfusion mehrere Tiere, wenn nötig, während die Leber perfundiert auf Eis. Pool 1-3 Lebern für die Reinigung und fahren Sie mit Stufe 3. </li></ol> 2. Herstellung des Dichtegradienten für die Zentrifugation (Figur 2) <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Abb. 2: Vorbereitung des Dichtegradienten Alle Vorgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Der SIP wird durch Mischen von 15,3 ml von beschichteten Silicapartikel-Lösung mit 1,7 ml 10 x PBS hergestellt. Ein 5 ml SIP werden mit 15 ml PBS gemischt und 20 ml 25% SIP Lösung herzustellen. 10 ml von SIP werden mit 10 ml PBS gemischt und 20 ml 50% SIP Lösung herzustellen. Zentrifugenröhrchen, das 50% SIP-Lösung (20 ml) gekippt wird und die 25% SIP-Lösung (20 ml) wird langsam mit einer serologischen 25 ml-Pipette. <ol><li> Fahren Sie mit den folgenden Schritten (Abschnitt 2., 3. und 5.) unter sterilen Bedingungen und halten Zellen auf Eis oder bei 4 ° C. Bereiten Sie die SIP (Lösung von Isotonische beschichteten Siliciumdioxid-Teilchen) durch Mischen von 15,3 ml von beschichteten Silicapartikel-Lösung mit 1,7 ml 10 x PBS. </li&gt; <li> Zu 20 ml 25% SIP-Lösung zu machen, mischen Sie 5 ml SIP mit 15 ml PBS. Zu 20 ml 50% SIP-Lösung zu machen, mischen 10 ml SIP mit 10 ml PBS. </li><li> Füllen eines Zentrifugenröhrchen mit 20 ml der 50% igen Lösung SIP. Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen in einem Winkel nahe 90 ° und fügen Sie langsam die 25% SIP-Lösung (20 ml) auf der Seitenwand der Röhre mit einem 25 ml serologische Pipette, ohne Berührung der Oberfläche des 50% SIP-Schicht. Beim Hinzufügen von 25% SIP Lösung progressiv den Winkel der Röhre zu verringern. Halten Sie den Dichtegradienten auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol> 3. Kupfferzelle Reinigung (Figur 3) <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Fig. 3: Reinigung von Kupffer-Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und Zelladhäsion Alle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. (A) Nach dem Bruch der Glisson-Kapsel, werden Leberzellen durch eine 1 gefilterten00 &amp; mgr; m Sieb. Die Suspension wird bei 50 x g zentrifugiert, um Hepatozyten zu verwerfen (Pellets) zu sammeln und das nicht-parenchymalen Zellfraktion (Überstand). Diese Stufe wird 3 mal wiederholt. Nicht-parenchymalen Zellen auf einem diskontinuierlichen isotonischen Gradienten gegeben und bei 800 · g für 15 min zentrifugiert. Kupffer-Zellen von 25% SIP Kissen gesammelt werden durch Zelladhäsion Selektion gereinigt. (B) Die Zellen werden in 24-Well-Platte ausplattiert und bei 37 ° C für 30 min inkubiert und 5% CO 2. Nicht-adhärente Zellen werden einmal mit 500 ul HBSS gewaschen. Kupffer-Zellen zeigen ihre haft Morphologie 4 Stunden nach der Plattierung, wenn f -CNTs können zu den Zellen gegeben werden. Der Maßstab entspricht 25 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Setzen Sie einen perfundierten Leber in einer Petrischale mit 15 ml Kupffer Zelle Isolierung Medium. Bruch der Glisson-Kapsel (Membran der Leber) mit einer Schere und lassen alle Leberzellen in den Kupffer-Zellisolierung Medium. Die Lösung wird, obwohl ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb in ein Zentrifugenröhrchen gesammelt werden. Wiederholen Sie den Vorgang auf zusätzliche Perfusion perfundierten Leber und bündeln die Zellen in der gleichen Zentrifugenröhrchen (15 ml von einer Maus, bis zu 45 ml von drei Mäusen). </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 g für 2 min bei 4 ° C. Parenchymale Zellen (Hepatozyten) wird in dem Pellet und nicht-parenchymale Zellen (einschließlich Kupffer-Zellen) werden in dem Überstand sein. </li><li> Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 50 g für 2 min je. Wiederholen Sie diesen Schritt drei weitere Male. </li><li> Zentrifuge bei 1.350 × g für 15 min pelletiert nicht-parenchymalen Zellen. Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml von Kupffer Zellen Isolierung Medium. </li><li> In den nicht-Parenchymzelle Lösung auf dem diskontinuierlichen isotonischen Gradienten 25/50%, wie in 2.3 beschrieben. Centrifuge bei 850 × g für 15 min ohne Beschleunigung oder Pause. </li><li> Lokalisieren des angereicherten Kupfferzelle Fraktion innerhalb 25% SIP Fraktion in der Nähe des 25/50% SIP-Schnittstelle (Figur 3) erscheinen trüb. Mit einem 10 ml serologische Pipette absaugen etwa 12 ml der angereicherten Kupffer Zellfraktion. Übertragungszellen in ein Zentrifugenröhrchen mit 35-40 ml Kupfferzelle Isolationsmedium. Vorsichtig mischen und Zentrifugieren bei 1.350 xg für 15 min bei 4 ° C Zellen zu pelletieren. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 5-10 ml vorgewärmtes Kupffer Zellkulturmedium. Count-Zellen (Hämozytometer) und messen die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau-Färbung. </li><li> Platte der gereinigten nicht-Parenchymzellen in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 5 Zellen / Vertiefung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 (Figur 3). Nach 30 Minuten, entfernen Sie vorsichtig das Medium, waschen mit vorgewärmter Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) einmal ersetzenes mit 500 ul frisch und vorgewärmte Kupffer Zellkulturmedium (pro Vertiefung). </li><li> Verlassen Kupffer Zellen für mindestens 4 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2 vor der Behandlung mit Nanopartikeln, damit sie ihre haft Morphologie erhalten. </li></ol> 4. Charakterisierung <ol><li> Kupffer-Zellen Purity <ol><li> Bereiten Sie frisch verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten Kupffer PBS / BSA-Lösung. Wasche die Zellen einmal mit 500 ul PBS / BSA-Lösung. Entfernen Sie die PBS / BSA-Lösung und nehmen Kupffer-Zellen in 500 ul frischem PBS / BSA-Lösung mit leichtem Kratzen. Wenn Zellen in 24-Well-Platten, kürzen Sie die Enden der Schaberklingen mit einer Schere, um das Lösen einfacher zu fahren. Übertragen Sie Zellen in der Durchflusszytometrie Röhren. </li><li> Zählen Kupffer-Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Zentrifuge 1 x 10 5 Zellen bei 1350 x g. Resuspendieren Kupffer-Zellen in 30 ul F4 / 80-Antikörper (unverdünnt). Gut mischen und bei Raumtemperatur für 30 min. Halten Sie die ungefärbten Zellen (nicht mit dem Antikörper) auf Eis. </li><li> 2 ml PBS / BSA-Lösung in gefärbten Zellen, Zentrifuge bei 1.350 g für 5 min und entsorgen Sie die resultierende Überstand. Resuspendieren gefärbten Zellen in 200 ul PBS / BSA. </li><li> Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Tor 10.000 unbefleckt Kupffer-Zellen nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung) und Granularität (side scatter). Analysieren Fluoreszenz gated Zellen in FL-1-Kanal. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für Bunt Kupffer-Zellen halten die gleichen Einstellungen für die Durchflusszytometrie-Analyse von ungefärbten Kupffer-Zellen verwendet. Auszuwählen und Quantifizierung der Fluoreszenz von gefärbten Zellen, die Reinheit Kupfferzelle beurteilen. </li></ol></li><li> Kupffer Zelle Phagozytoseaktivität <ol><li> Ersetzen Medien mit 0,5% (v / v) fluoreszierenden Kügelchen in Kupffer Cell Culture Medium und Inkubation für 4 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Um nicht verinnerlicht Perlen, Zentrifuge Kupffer-Zellen bei 1350 · g, di entfernenscard den Überstand und resuspendieren Zellen in 500 ul PBS / BSA-Lösung. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. </li><li> Scrape Kupffer-Zellen in 500 ul PBS / BSA-Lösung und Transfer Zellen in ein Durchflußzytometrie Röhre. </li><li> Centrifuge Kupffer-Zellen bei 1350 · g, den Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 200 ul PBS / BSA-Lösung. </li><li> Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Tor 10.000 unbefleckt Kupffer-Zellen nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung) und Granularität (side scatter). Analysieren Fluoreszenz gated Zellen in FL-2-Kanal. </li></ol></li></ol> 5. Die Inkubation von chemisch funktionalisierte Kohlenstoffnanoröhren (f -CNTs) <ol><li> Bereiten Sie eine Dispersion f -CNTs (1 mg / ml) in Wasser durch Ultraschallbehandlung für 15 Minuten vor dem Gebrauch. F -CNTs werden im eigenen Haus 22 vorbereitet. </li><li> Bereiten 2x konzentriert f- CNTs Dispersion in Kupffer Zellkulturmedium. Beschallen f- CNTs in Medium dispergiert2 Minuten, bevor Sie mit Schritt 5.3 fortfahren). </li><li> Für jeden gut, ersetzen Sie 250 ul alten Medien mit 250 ul 2x f -CNTs Dispersion. Unbehandelten Vertiefungen (250 &amp; mgr; l konditioniertes Medium + 250 &amp; mgr; l frisches Kupffer Cell Culture Medium) und Vertiefungen, die mit 10% DMSO behandelt werden als negative und positive Kontrolle verwendet wurden. </li><li> Inkubieren Kupffer Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 oder 72 Stunden. </li></ol> 6. Toxizität Beurteilung f -CNTs in Kupffer-Zellen nach dem modifizierten Lactatdehydrogenase (LDH) Assay <ol><li> Überstand verwerfen. </li><li> Fügen Sie 200 ul (pro Well Platte mit 24 Vertiefungen) von Lysis Buffer und bei 37 ° C für 30 min-1 Std. </li><li> Nach Durchführung heftiges Pipettieren, sammeln bei 40.000 xg in Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge lysiert Kupffer-Zellen für 10 Minuten, um zu pelletieren f -CNTs, die von den Zellen und der Zelltrümmer aufgenommen wurden. </li><li> Sammeln Sie die Überstände (ƒ-CNT frei) inReaktionsgefäße und bei -20 ° C oder fahren Sie mit Schritt 6.5). </li><li> Transfer 50 ul in eine Platte mit 96 Vertiefungen und dasselbe Volumen des Substrats Mix-Lösung (LDH-Kit) in jede Vertiefung. Streifen abdecken und bei Raumtemperatur für 15 min vor Zugabe von 50 &amp; mgr; l der Stopplösung (LDH-Kit). In dreifacher Ausführung von leeren Vertiefungen, die 50 &amp; mgr; l Lysepuffer 50 ul Substrat-Mix-Lösung und 50 ul Stop-Lösung. </li><li> Die Absorption bei 490 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät und verwenden Sie die folgende Formel, um die (%) Zelllebensfähigkeit zu berechnen. </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

<ol>
	<li>Hoffmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+novel+kidney+biomarkers+in+preclinical+toxicity+studies.">Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies.</a> Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).</li><li>Nel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial+Toxicity+Testing+in+the+21st+Century:+Use+of+a+Predictive+Toxicological+Approach+and+High-Throughput+Screening.">Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening.</a> Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).</li><li>Bregoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+antimony+trioxide+nanoparticles+on+human+hematopoietic+progenitor+cells+and+comparison+to+cell+lines.">Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines.</a> Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).</li><li>Yamasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Aberrations+and+Cellular+Heterogeneity+in+SV40-Immortalized+Human+Corneal+Epithelial+Cells.">Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology, &amp; Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).</li><li>Motoyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megalin+contributes+to+the+early+injury+of+proximal+tubule+cells+during+nonselective+proteinuria.">Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria.</a> Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).</li><li>Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+characteristics+and+expression+of+cell+adhesion+molecules+in+proximal+tubule-derived+cell+lines+commonly+used+for+in+vitro+toxicity+studies.">Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies.</a> Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Kermanizadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kupffer+cells+in+the+hepatic+response+to+silver+nanoparticles.">The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles.</a> Nanotoxicology. , (2013).</li><li>Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+Primary+Liver+Macrophages+for+Studying+Quantum+Dot+Interactions+with+Biological+Systems.">Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems.</a> Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).</li><li>Wan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Kupffer+Cells+Promote+M1+Kupffer+Cell+Apoptosis:+A+Protective+Mechanism+Against+Alcoholic+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease.">M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).</li><li>Matsuoka, M., Tsukamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+hepatic+lipocyte+collagen+production+by+Kupffer+cell-derived+transforming+growth+factor+&#946;:+Implication+for+a+pathogenetic+role+in+alcoholic+liver+fibrogenesis.">Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor &#946;: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis.</a> Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).</li><li>Polakos, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer+Cell-Dependent+Hepatitis+Occurs+during+Influenza+Infection.">Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection.</a> The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).</li><li>Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+enzymes+released+by+liver+macrophages+may+promote+hepatic+injury+in+a+rat+model+of+hepatic+damage.">Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage.</a> Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).</li><li>Knittel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+parenchymal+and+non-parenchymal+cells+of+rat+liver:+regulation+by+TNF-&#945;+and+TGF-&#946;1.">Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-&#945; and TGF-&#946;1.</a> Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).</li><li>Branster, M. V., Morton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Intact+Liver+Cells.">Isolation of Intact Liver Cells.</a> Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+endothelial+cells+of+adult+rat+liver+as+resolved+by+sedimentation+velocity+and+flow+cytometry.">Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry.</a> J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).</li><li>Miller, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+cells+from+livers+of+carcinogen-treated+rats+by+free-flow+electrophoresis.">Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis.</a> Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).</li><li>Firme, C. P., Bandaru, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+issues+in+the+application+of+carbon+nanotubes+to+biological+systems.">Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems.</a> Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).</li><li>Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+assessment+of+carbon+nanotube+interaction+with+cell+cultures.">Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+correcting+for+carbon+nanotube+interferences+with+a+commercial+LDH+cytotoxicity+assay.">Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay.</a> Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).</li><li>Wang, J. T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Decorated+Multiwalled+Carbon+Nanotubes+as+Dual+MRI+and+SPECT+Contrast+Agents.">Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents.</a> Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).</li><li>Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+to+isolate+and+culture+mouse+Kupffer+cells.">An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells.</a> Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).</li><li>Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+liver+Kupffer+cells.">Isolation of liver Kupffer cells.</a> Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die folgenden Schritte sind entscheidend für die hohe Ausbeute und hohe Rentabilität der Kupffer-Zellen zu erreichen. Aseptischen Bedingungen zu verwenden, um das Risiko einer bakteriellen und Pilzkontamination zu begrenzen. Alle Instrumente müssen vor Gebrauch sterilisiert werden. Reagenzien werden frisch vor der Durchführung der Isolationsverfahren hergestellt werden. Die Wahl der Collagenase IV, mit niedrigen Trypsinaktivität, ist von entscheidender Bedeutung. Verschiedene Partien vo...

Der Bereich der Toxikologie Forschung zielt auf die biologische Wirkung von Nanopartikeln zu charakterisieren. Toxikologische Untersuchungen auf Basis von in vivo Untersuchungen bleiben die genauesten Methoden. Allerdings ist ihr Einsatz durch ihre Kosten, Arbeit und Zeitaufwand 1 beschränkt. Als Alternative, in vitro-Assays wurden aufgrund ihrer Einfachheit und der Möglichkeit der Entwicklung von Hochdurchsatz in vitro Testplattformen 2 verwendet wurden - so Erweiterung der Anzahl von Bedingungen getestet. Esten nanotoxikologische Untersuchungen werden mit Hilfe von in-vitro-Assays mit immortalisierten Zelllinien. Es gibt jedoch Bedenken hinsichtlich der Extrapolation dieser experimentellen Befunde in vivo toxikologische 3. Tatsächlich können die Eigenschaften der immortalisierten Zelllinien signifikant von Geweben sie abgeleitet wurden, zum Beispiel genetische Transformation 4. Verschlechterung von wichtigen morphologischen Merkmale sein5, Verlust der Zellpolarität 6 und funktionellen Veränderungen wie die Regulierung von Entzündungsmediatoren 7. Kupffer-Zellen sind die häufigsten Makrophagenpopulation im Körper und sind in direktem Kontakt mit Blut durch Auskleiden der Wand Lebersinusoide. Als Teil des retikuloendothelialen Systems (RES), sind diese Makrophagen für die Erfassung von zirkulierenden Nanopartikel und damit verantwortlich, bilden eine sehr geeignetes Modell, um die Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. In vivo 8 und In-vitro-Studien 9 von Entzündungsreaktionen mit Kupffer-Zellen zu Nanopartikeln ausgesetzt zugeordnet wurden an anderer Stelle veröffentlicht. Kupffer-Zellen wurden ebenfalls in der Pathogenese von Lebererkrankungen wie alkoholische Leberkrankheit 10, Leberfibrose 11 oder Virushepatitis 12 beteiligt. Es wurde berichtet, dass isolierte Kupffer-Zellen liefern nützliche Einblicke in zelluläre Mechanismen inv beschreibenLeberstörungen 13,14 olved. Mehrere Verfahren wurden berichtet, zu isolieren und zu reinigen, Kupffer-Zellen. Zellisolierung aus mechanischen oder enzymatischen Dissoziation 15 führen. Kollagenaseverdau zeigt den Vorteil, dass die Erhaltung der Funktionsfähigkeit der Kupffer-Zellen, während die zu hohen Kupffer Zellausbeute 16. Viele experimentelle Ansätze unterschiedlicher Komplexität und die Kosten, sind verwendet worden, um den Kupffer-Zellen von anderen Leberzellpopulationen zu trennen. Beispielsweise kann Kupfferzelle Reinheit durch Immunoaffinitätschromatographie 17. Strömungs Elektrophorese 18, 16 oder selektive Adhäsion durch die Zentrifugalkraft Techniken 16, die Zellen auszuwählen entsprechend ihrer Größe und Dichte erreicht werden. Eine Kombination dieser Verfahren kann gewählt werden, um die Reinheit der Bevölkerung 16 zu erhöhen. Es besteht kein Konsens über die ideale Methode für die Kupffer-Zellisolierung, da sie größtenteils abhängig von der Anwendung und den verfügbaren equipment. Im Falle von Nanopartikeln Toxizitätstests, die Einfachheit und eine hohe Ausbeute der Technik mit der funktionellen Erhaltung Kupffer Zellen assoziiert ist jedoch zu dem als am besten geeignet für diese Anwendung. Die Kupfferzellen Isolierverfahren hier berichtet wird, auf einem 2-Schritt-Perfusionsverfahren, gefolgt von Reinigung über Dichtegradientenzentrifugation basieren. Die Methode wurde von dem vom Smedsr d et al ursprüngliche Protokoll geändert. 16 für Rattenleberzellisolierung konzipiert. Die meisten Studien berichtet und beschrieben die Isolierung von Kupffer-Zellen aus Rattenlebern. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kupffer-Zellen aus Mäuseleber isoliert, in hoher Ausbeute und Reinheit. Die Verwendung von Mäusen, vermindert die Kosten und Experiment erlaubt die Verarbeitung mehrerer Lebern, große Mengen von Kupffer-Zellen zur Nanopartikeltoxizitätstests erhalten. Im folgenden Protokoll wurden Kupffer-Zellen mit funktionalisierten Kohlenstoff-Nanoröhren inkubiert (f </em&gt; -CNTs). Die einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften von CNTs - also hohen Länge-Durchmesser-Verhältnis und eine große Oberfläche haben CNTs interessante Kandidaten als Vektoren für die Therapie und Diagnosezwecken hergestellt. Allerdings wurde die Sorge in Bezug auf die Toxizität von CNTs 19, und die Entwicklung neuer in vitro-Tests zielt darauf ab, das Verständnis der CNT biologische Wirkung erhöht. Toxizität in Kupffer Zelle mit einem Mangel an struktureller Integrität der Zellmembran assoziiert. Dies wird durch den Verlust der zytoplasmatischen Enzyms LDH aus der Zelle in den Überstand gemessen. Das Prinzip dieses Verfahrens ist es daher, um jede freigesetzte LDH zu entfernen und zu messen, was in den Zellen 20 belassen. Dies wird bevorzugt, um die Messung des freigesetzten LDH im Überstand durchgeführt, da das Vorhandensein von CNTs in dem Überstand stört den Test 21. Wir schlagen vor, die Verwendung dieser einfachen und kostengünstigen Kupffer Zellisolierung method zu hoher Anzahl funktioneller Kupffer-Zellen zu isolieren. Dies ermöglicht das Screening von Toxizität einer Reihe von Nanopartikeln in einem relevanten primären Makrophagenmodell.

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital sodium)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 mice</td><td>Charles River&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS (Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;and Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free, with bicarbonate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS must be&amp;nbsp; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; free.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>E8145&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;selectively.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15630-056&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase type IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>CSL-4&amp;nbsp;</td><td>It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Low glucose DMEM&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D5523&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12633-012&amp;nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>First-Link&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>60-00-850&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan blue solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coated silica particle solution (Percoll)</td><td>GE Healtcare&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>17-0891-02&amp;nbsp;</td><td>Percoll&amp;reg; is very stable and can be kept for several years&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>D/4120/PB08&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LDH kit (CytoTox 96)&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G1781&amp;nbsp;</td><td>Keep protected from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM phenol red free</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>31053-028&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>F4/80 antibody (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Do not dilute, used neat for flow cytometry</td></tr><tr><td>Fluorescent beads</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td></tr><tr><td>Name of the Material</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>367288</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.22 &amp;mu;m Blue Rim)&amp;nbsp;</td><td>Minisart&amp;nbsp;</td><td>16534-K&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>35 2070&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (90 x 15 mm)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BSN 101VR20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump&amp;nbsp;</td><td>Watson Marlow&amp;nbsp;</td><td>SciQ 300&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine forceps</td><td>Hammacher GmbH&amp;nbsp;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow cytometry tubes</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&amp;nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td></tr><tr><td>Name of the Reagent</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#039;s Balanced Salt Solution) Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Isolation Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Culture Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td><td></td><td></td><td>Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp; with 15.3 ml of Percoll&amp;reg; to obtain 17mL of SIP.</td></tr><tr><td>25% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>DMEM media with 0.9% Triton X-100</td></tr><tr><td>PBS/BSA Solution</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

Die große Mehrheit der in-vitro-Studien haben nanotoxikologische immortalisierten Zelllinien auf ihre Praxistauglichkeit verwendet. Jedoch haben Ergebnisse aus Nanopartikeln Toxizität in immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen Diskrepanzen zeigt, die die Notwendigkeit, die Verwendung von primären Zellen für in vitro-Assays zu erweitern. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Mausleber Makrophagen, Kupffer-Zellen genannt, und ihre Verwendung zur Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. Kupffer-Zellen sind die häufigsten Makrophagenpopulation im Körper und Teil des retikuloendothelialen Systems (RES), für die Erfassung von zirkulierenden Nanopartikel verantwortlich. Die Kupfferzellen Isolierverfahren hier berichtet wird, auf einem 2-Schritt-Perfusionsverfahren, gefolgt von Reinigung über Dichtegradientenzentrifugation basieren. Wobei das Verfahren, bezogen auf Kollagenaseverdau und Dichte der Zentrifugation wird der von Smedsr d et al ursprüngliche Protokoll angepasst. für Rattenleberzell isolatio ausgelegtn und bietet hohe Ausbeute (bis 14 x 10 6 Zellen pro Maus) und hoher Reinheit (&gt; 95%) von Kupffer-Zellen. Diese Isolierung Methode erfordert keine teure Ausrüstung oder anspruchsvoll und stellt somit einen idealen Kompromiss zwischen Komplexität und Zellausbeute. Die Verwendung von schwereren Mäuse (35-45 g) die Ausbeute an dem Isolierungsverfahren, sondern erleichtert auch bemerkenswert, das Verfahren der Pfortader Kanülierung. Die Toxizität von Kohlenstoffnanoröhren f -CNTs wurde in diesem Modell durch das modifizierte LDH-Assay gemessen. Dieses Verfahren bewertet die Lebensfähigkeit der Zellen durch Messen der Mangel an struktureller Integrität Kupffer Zellmembran nach Inkubation mit f -CNTs. Toxizität von f induzierte -CNTs konsistent mit diesem Assay gemessen werden, Hervorhebung, dass isolierte Kupffer-Zellen sind für die Prüfung der Toxizität von Nanopartikeln. Das Gesamtverständnis der Nanotoxikologie können von diesen Modellen profitieren, so dass die Nanopartikel-Auswahl für die klinische Übersetzung effizient.

Die Anzahl der nicht-gereinigten Parenchymzellen war konsistent und lag im Bereich zwischen 8 und 14 x 10 6 Zellen pro Maus (17 Isolierungen wurden durchgeführt). Jede Maus Isolation war ausreichend, um 16 bis 28 Brunnen zu plattieren. Die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Färbung zeigten die Zelllebensfähigkeit ~ 95%. Kupffer-Zellen zeigten eine runde Form innerhalb von 30 min Inkubation bei 37 ° C, das unvollständige adhärente Morphologie (4A) bezogen. Bei 4 h Inkubation un...

Watch this Scientific Journal Video about Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing at JoVE.com

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Kupffer Zelle Isolierung für die Toxizität von Nanopartikeln Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.6K Aufrufe.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

Serie: Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

Die Entfernung der Spurenelemente von Kupferoxid Nanopartikeln aus Uranium<em&gt; In-situ-</em&gt; Wiederherstellung Blutwasser und Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

Forschung

Umwelt

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Immunologie und Infektion

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Biotechnik

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor cells, CAFs regulate tumor progression and provide protection from antitumor immunity. Emerging anticancer strategies aim to remodel the tumor microenvironment through the ablation of pro-tumorigenic CAFs or reprogramming of CAFs functions and their activation status. A promising approach is the development of nanosized delivery agents able to target CAFs, thus allowing the specific delivery of drugs and active molecules. In this context, a cellular model of CAFs may provide a useful tool for in vitro screening and preliminary investigation of such nanoformulations.
This study describes the isolation and culture of primary CAFs from the syngeneic 4T1 murine model of triple-negative breast cancer. Magnetic beads were used in a 2-step separation process to extract CAFs from dissociated tumors. Immunophenotyping control was performed using flow cytometry after each passage to verify the process yield. Isolated CAFs can be employed to study the targeting capability of different nanoformulations designed to tackle the tumor microenvironment. Fluorescently labeled H-ferritin nanocages were used as candidate nanoparticles to set up the method. Nanoparticles, either bare or conjugated with a targeting ligand, were analyzed for their binding to CAFs. The results suggest that ex vivo extraction of breast CAFs may be a useful system to test and validate nanoparticles for the specific targeting of tumorigenic CAFs.

This paper aims to provide a protocol for the isolation and culture of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of triple-negative breast cancer and their application for the preclinical study of novel nanoparticles designed to target the tumor microenvironment.&#160;

Isolierung primärer krebsseziensässiger Fibroblasten aus einem syngenen murinen Modell von Brustkrebs zur Untersuchung gezielter Nanopartikel

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Krebsforschung

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Neurowissenschaften

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Biologie

Isolation and Culture of Mouse Kupffer Cells

Source: Bourgognon, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52989">Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation of Kupffer cells or liver macrophages from the mouse liver. The liver is perfused with a digestion solution followed by density gradient separation. The isolated adherent Kupffer cells can be used for further analysis.

Isolierung und Kultivierung von Maus-Kupffer-Zellen

Source: Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation ...