Name: kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing at JoVE.com

This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

全ての動物実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局に準拠して実施されました。実証されているプロトコルは、英国のホームオフィスの規制の指導と承認の下で実施しました 1.灌流および細胞コレクション（図1） <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> 図1：肝灌流マウスを麻酔した後に、消化管は、横方向に門脈（PV）がアクセスできるようにするために、腹部の左側に移動します。 PVはすぐに肝臓内の任意の過剰な圧力を避けるために、破壊されるEGTA / HBSSソリューションと劣るveina静脈（IVC）の遅い流速（1-3 ml /分）を用いてカニューレを挿入します。灌流の最初の分以内、流速は徐々に7ml /分に増加させます。その完全な消化が達成されるまで、コラゲナーゼ溶液を、次いで、10 ml /分で灌流されます。 <ol><li> Prepaたての材料表に記載されているすべての試薬を再度。 </li><li> EGTA（エチレングリコール四酢酸）/ HBSS（ハンクス液）溶液（マウス当たり50ml）と40℃で30分間、コラゲナーゼ溶液（マウス当たり100ミリリットル）を温めます。 </li><li>最初の70％エタノールでポンプフレキシブルチューブを洗浄します。水浴に浸漬遠心分離管にEGTA / HBSS溶液40mlを注ぎ、予め温めておいたEGTA / HBSSソリューションとポンプフレキシブルチューブをすすぎます。 </li><li>確実に呼吸抑制と死の前に無意識を生成するためにバルビツール酸塩を用いて端末麻酔を実行します。女性または男性のCD1マウス（35〜45グラム）には1mg / kg、腹腔内でのフェノバルビトンを注入します。つま先のピンチによって麻酔を確認します。 </li><li>腹部の毛を剃る、70％エタノール溶液を用いて腹部表面を殺菌。 </li><li>腹腔を切断し、腹部の左側に横方向に腸を動かすことにより、門脈および下大静脈を露出させます。 </li><li>スターT EGTA / HBSS溶液で1〜3ミリリットル/分の速度でポンプと23グラム蝶の針を使用して、門脈にカニューレを挿入（翼はカット）。 23 G針でカニューレを挿入し、門脈の部分をクランプした後、開かれたマウスの腹部の表面に止血小鉗子鉗子を反転。肝臓は迅速にEGTA / HBSS溶液灌流の最初の30秒以内に淡い必要があります。 </li><li>急速に肝臓での過剰な圧力の建物を避けるために、 下大静脈の下部を切開し、その後灌流の最初の分を介して、7ミリリットル/分に徐々に流量を増加させます。動物は、大静脈穿刺を静脈する二次出血による死亡します。 </li><li> EGTA / HBSSソリューション未満の5mlを遠心分離管に残っている場合には、コラゲナーゼ溶液（40〜50ミリリットル）でそれを埋めます。 30秒かけて、10ml /分に徐々に流量を増加させます。 </li><li> 5-10秒間隔のために、ピンセットを使用して、 下大静脈に圧力を適用することにより、肝臓うねりを作ります。ティSは（消化中に5〜10倍）を定期的に行うことができます。このステップは、肝細胞の分離を改善し、コラゲナーゼ潅流時間を減少させます。 </li><li>コラゲナーゼ溶液未満の10mlを遠心分離管の中に残っている場合には、遠心分離管に予め温めたコラゲナーゼ溶液を40〜50ミリリットル注ぎます。 </li><li>灌流の10〜15分後、約70〜80ミリリットルのコラゲナーゼ溶液の灌流、鉗子で肝臓の表面に小さな圧力を加えます。圧力の記録は、肝細胞が解離されることを示しています。 </li><li>ワンピースとして腹腔から肝臓を取り出して、クッパー細胞の単離中20〜30 mlを含む遠心管に入れます。肝細胞の生存率への影響を回避するために3時間の最大期間氷上または4℃で肝細胞を保管してください。 </li><li>氷の上に灌流肝臓を維持しながら、必要に応じていくつかの動物で灌流手順を繰り返します。プールを精製するための3つの肝臓への1つ、ステージ3に進みます。 </li></ol>遠心分離のための密度勾配（図2）の調製<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> 図2：密度勾配の調製すべての操作は、無菌状態下で行われます。 SIPは、10×PBS 1.7 mlの被覆シリカ粒子溶液15.3 mlと混合することによって調製されます。 SIP 5mlの25％のSIP溶液20mlを作るためにPBS 15mlで混合されます。 SIP 10mlの50％のSIP溶液20mlを作るために10mlのPBSと混合します。 50％SIP溶液（20ml）で傾斜している、25％のSIP溶液（20ml）に含む遠心管をゆっくり25mLの血清学的ピペットを使用して追加されます。 <ol><li>無菌状態の下で、次のステップ（部2、3＆5）に進み、氷上で、または4℃で細胞を維持します。 10×PBS 1.7 mlの被覆シリカ粒子溶液の15.3ミリリットルを混合することにより、SIP（等張性被覆シリカ粒子溶液）を準備します。 </lI&gt; <li> 25％のSIP溶液20mlを作るために、PBS 15mlでSIPの5ミリリットルを混ぜます。 50％のSIP溶液20mlを作るために、PBS 10mlでSIPの10ミリリットルを混ぜます。 </li><li> 50％のSIP溶液20mlで1遠心管を埋めます。 90°に近い角度で遠心チューブを傾けて、50％のSIP層の表面に触れることなく、25ミリリットルの血清学的ピペットを用いてチューブの側壁に徐々に25％SIP溶液（20ml）に加えます。 25％のSIPソリューションを追加する場合は、漸進的にチューブの角度を減少させます。使用するまで氷上で密度勾配を維持します。 </li></ol> 3.クッパー細胞精製（図3） <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> 図3：密度勾配遠心分離および細胞接着によってクッパー細胞の精製は、すべての手順は、無菌条件下で行われます。 （A）グリソン鞘が破裂した後に、肝細胞は、1で濾過します00ミクロンストレーナ。懸濁液は、肝細胞（ペレット）を破棄し、非実質細胞画分（上清）を収集するために×50 gで遠心分離します。この工程を3回繰り返します。非実質細胞は、不連続等張勾配の最上部に添加し、15分間、800×gで遠心分離します。 25％のSIPクッションから収集クッパー細胞は、細胞接着の選択によりさらに精製されます。 （B）細胞を、24ウェルプレートに播種し、30分間37℃、5％CO 2でインキュベートします。非接着細胞を500μlのHBSSで一回洗浄します。クッパー細胞を f -CNTsを細胞に添加することができる場合には、メッキ後に接着形態4時間を表示します。スケールバーは25μmで表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <ol><li> 1灌流肝臓はクッパー細胞の単離培地15mlでペトリ皿に入れてください。 （グリソン鞘を破裂肝臓の膜）はさみを使用し、クッパー細胞の単離培地にすべての肝細胞を放出します。 100μmのセルストレーナーを遠心管に収集することができるためにかかわらず、ソリューションをフィルタリングします。追加の灌流肝臓に灌流手順を繰り返し、（3匹のマウスから45ミリリットルまで、マウスを一回から15ミリリットル）同じ遠心チューブに細胞をプール。 </li><li> 4℃で2分間、50×gで細胞懸濁液を遠心。実質細胞（肝細胞）は、ペレットになり、（クッパー細胞を含む）の非実質細胞を上清になります。 </li><li> 2分ごとに、50×gで清潔な遠心チューブと遠心分離機で上清を収集します。このステップをさらに3回繰り返します。 </li><li>非実質細胞をペレット化するために15分間、1,350×gで遠心分離します。上清を捨て、クッパー細胞の単離培地10mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> 2.3で説明したように不連続等張勾配に関して25/50％を非実質細胞溶液を追加します。セント加速度や休憩なしで15分間、850×gでrifuge。 </li><li> 50分の25％のSIPインターフェースに近い25％のSIP画分（ 図3）内に濁っ現れる富むクッパー細胞画分をローカライズ。約12ミリリットル濃縮されたクッパー細胞画分の、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて吸引します。クッパー細胞の単離中35〜40 mlを含む遠心チューブに細胞を移します。細胞をペレット化し、4℃で15分間、1,350×gで静かにして遠心混ぜます。 </li><li>予め温めておいたクッパー細胞培養培地5〜10mlの中で上清と再懸濁細胞を捨てます。細胞（血球計）をカウントし、トリパンブルー染色を用いて生存率を測定します。 </li><li> /ウェルで5×10 5細胞の密度で24ウェルプレート中の精製非実質細胞をプレート。 37℃、5％CO 2（ 図3）で細胞をインキュベートします。 30分後、静かに置き換える一旦予め温めたハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し、培地を除去新鮮で予め温めておいたクッパー細胞培養培地500μlでそれ（ウェル）。 </li><li>彼らの付着形態を獲得できるようにするために、ナノ粒子を用いた治療の前に37℃で少なくとも4時間、5％CO 2のためのクッパー細胞のままにしておきます。 </li></ol> 4.特性<ol><li>クッパー細胞の純度<ol><li>クッパー細胞生存率を維持するために使用される新鮮なPBS / BSA溶液を調製します。 PBS / BSA溶液500μlで細胞を1回洗浄します。 PBS / BSA溶液を除去し、穏やかなスクレイピングを使用して、新鮮なPBS / BSA溶液500μlのクッパー細胞を切り離します。細胞を24ウェルプレートにプレーティングされている場合、続行するには着脱を容易にするためにハサミでスクレーパーブレードの先端を短縮。チューブ、フローサイトメトリーに細胞を移します。 </li><li>血球計および遠心1,350×gで1×10 5個の細胞を用いて、クッパー細胞をカウントします。 F4 / 80抗体（ニート）の30μlに再懸濁クッパー細胞。よく混ぜ、3室温でインキュベート0分。氷上で染色されていない細胞（抗体とインキュベートしていない）を保持します。 </li><li> 5分間1350グラムで、染色された細胞内で遠心分離機をPBS / BSA溶液2mlを添加し、得られた上清を捨てます。 PBS / BSA200μlの染色細胞を再懸濁します。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために、ゲート万未染色のクッパー細胞、そのサイズ（前方散乱）および粒度（側方散乱）に従って。 FL-1チャンネルでゲートされた細胞の蛍光を分析します。 </li><li>未染色のクッパー細胞のフローサイトメトリー分析に使用したのと同じ設定を維持染色クッパー細胞のための手順を繰り返します。選択し、クッパー細胞の純度を評価するために染色された細胞の蛍光を定量化します。 </li></ol></li><li>クッパー細胞貪食能<ol><li>クッパー細胞培養培地（v / v）の蛍光ビーズを0.5％と、メディアを交換し、37℃で4時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li> 1,350×gで、二に、非内在化ビーズを、遠心クッパー細胞を除去するために500μlのPBS / BSA溶液中の上清および再懸濁細胞をSCARD。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li>フローサイトメトリーチューブにPBS / BSAソリューションおよび転送細胞の500μlの中でかき取りクッパー細胞。 </li><li> 1,350×gで遠心分離しクッパー細胞は、PBS / BSA溶液の200μlの上清と再懸濁した細胞を捨てます。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために、ゲート万未染色のクッパー細胞、そのサイズ（前方散乱）および粒度（側方散乱）に従って。 FL-2チャンネルでゲートされた細胞の蛍光を分析します。 </li></ol></li></ol> （-CNTs f）は 、化学的に機能カーボンナノチューブの5インキュベーション<ol><li>使用前に15分間の超音波処理により水中のF -CNTs（1mg / ml）の分散液を調製します。F -CNTsは、社内で22用意されています。 </li><li> 2倍濃縮したF-CNTを準備 クッパー細胞培養培地中での分散。 超音波処理をするための媒体中に分散されたCNTをF-ステップ5.3に進む前に2分）。 </li><li>各ウェルについて、2×F -CNTs分散液250μlの古いメディアの250μlのを交換してください。未処理のウェル（新鮮なクッパー細胞培養培地の馴化培地+ 250μlと250μl）を、10％のDMSOで処理したウェルを、それぞれ陰性および陽性対照として使用されています。 </li><li> 24または72時間、CO 2、37℃で、5％クッパー細胞をインキュベートします。 </li></ol>変更された乳酸脱水素酵素（LDH）アッセイによるクッパー細胞中のF -CNTsの6毒性評価<ol><li>上清を捨てます。 </li><li>溶解バッファーの（24ウェルプレートのウェルあたり）200μlを添加して、30分〜1時間、37℃でインキュベートします。 </li><li>激しいピペッティングを行った後、細胞と細胞の破片によって取り込まれた-CNTs fをペレット化し、10分間40,000×gでマイクロ遠心チューブと遠心分離機に溶解したクッパー細胞を収集します。 </li><li>に上清（ƒ-CNT無料）を収集マイクロ遠心チューブ、-20℃で保存または）は、6.5に進みます。 </li><li> 96ウェルプレートに50μLを移し、各ウェルに基質混合溶液（LDHキット）の同体積を追加します。プレートをカバーし、停止溶液（LDHキット）を50μlを添加する前に室温で15分間インキュベートします。溶解緩衝液50μlを、基質混合液50μlの停止溶液50μlを含むブランクウェルの三重を加えます。 </li><li>マイクロプレートリーダーで490 nmの吸光度を読んで、（％）細胞生存率を計算するために、次の式を使用しています。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

次の手順では、高収率とクッパー細胞の高い生存率を達成することが重要です。無菌状態は、細菌および真菌の汚染の危険性を制限するために使用されるべきです。すべての器具は、使用前に滅菌する必要があります。試薬は、新たに単離手順を実行する前に準備する必要があります。 コラゲナーゼIVの選択は、低いトリプシン活性を有する、非常に重要です。同一の供...

nanotoxicology研究の分野は、ナノ粒子の生物学的効果を特徴づけることを目的とします。 in vivoでの調査に基づいて、毒性試験は、最も正確な方法のまま。しかし、その使用は、コスト、労力と時間の要件1によって制限されます。その試験した条件の数を拡張する-代替案としては、in vitroアッセイであるため、そのシンプルさとインビトロ試験プラットフォーム2 に高スループットの開発の可能性を使用されています。ほとんどnanotoxicological研究は、不死化細胞株を用いたin vitro アッセイを用いて実施されます。しかし、in vivoでの毒性効果3に、これらの実験結果の外挿に関する懸念があります。実際には、不死化細胞株の特性は、それらが由来した組織、 例えば、遺伝的形質転換4、鍵の形態学的特徴の劣化が著しく異なる可能性が5、携帯極性6などの炎症性メディエーター7の調節などの機能変化の損失。 クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、肝臓の類洞の壁の内側を覆うことにより、血液と直接接触しています。細網内皮系（RES）の一環として、これらのマクロファージは、ナノ粒子を循環、したがってのキャプチャを担当している、ナノ粒子の毒性を研究するために非常に適したモデルを構成している。 インビボ 8 in vitroでのナノ粒子に曝露されクッパー細胞に関連する炎症反応の9研究が他の場所で公開されています。クッパー細胞はまた、アルコール性肝疾患10、肝線維症11またはウイルス性肝炎12のような肝疾患の病因に関与しています。これは、INV、単離されたクッパー細胞は、細胞メカニズムを説明するための有用な洞察を提供することが報告されました肝臓破壊13,14にolved。 いくつかの方法は、クッパー細胞を単離し、精製することが報告されています。細胞の単離は、機械的または酵素的解離15から生じ得ます。コラゲナーゼ消化は高クッパー細胞収率16につながるながら、クッパー細胞の機能的完全性を保存することの利点を示しています。複雑さとコストが異なる多くの実験的なアプローチは、他の肝細胞集団からのクッパー細胞を分離するために使用されています。例えば、クッパー細胞の純度は、イムノ17、フロー電気泳動18、選択的接着16によって、またはそれらのサイズおよび密度に応じてセルを選択し、遠心技術16、によって達成することができます。これらの方法の組み合わせは、人口16の純度を高めるように選択することができます。それは、ほとんどのアプリケーションと利用可能なequipmenに依存するようにクッパー細胞の単離のための理想的な方法についての合意はありませんが、T。しかし、ナノ粒子の毒性試験の場合には、単純さとクッパー細胞の機能維持に関連付けられた技術の高い収率は、このアプリケーションのために最も適していると思われました。 ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。この方法は、Smedsrød らが開発した独自プロトコルから変更されました。16は、ラット肝細胞の単離のために設計されています。ほとんどの研究が報告され、ラットの肝臓のクッパー細胞の単離を記載しています。ここで、我々は、高い収率及び純度で、マウス肝臓のクッパー細胞を単離する方法を記載します。マウスの使用は、実験のコストを削減し、いくつかの肝臓の処理は、ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞を大量に得ることができます。 以下のプロトコルは、クッパー細胞を官能基化カーボンナノチューブ（Fと共にインキュベートしました</em&gt;の-CNTs）。 CNTの固有の物理化学的特性-直径比と大きな表面積、即ち高い長さ、治療および診断目的のためのベクターとしてのCNTの興味深い候補を行いました。しかし、懸念は、カーボンナノチューブ19の毒性に関して提起されており、in vitro試験で 、新しいの開発は、CNTの生物学的効果の理解を高めることを目指しています。クッパー細胞における毒性は、細胞膜の構造的完全性の欠如に関連しています。これは、上清中に細胞から細胞質酵素LDHの損失によって測定されます。この方法の原理は、従って、任意の放出されたLDHを除去し、セル20に残っているものを測定することです。上清中のカーボンナノチューブの存在は、アッセイ21に干渉するので、これは上清中に放出されたLDHの測定に優先して行われます。 我々は、このシンプルでコスト効率のクッパー細胞の単離メトの使用を提案していますdは、機能クッパー細胞の数が多いを単離します。これは、関連する主要なマクロファージモデルでは、ナノ粒子の範囲の毒性のスクリーニングを可能にします。

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital sodium)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 mice</td><td>Charles River&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS (Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;and Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free, with bicarbonate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS must be&amp;nbsp; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; free.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>E8145&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;selectively.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15630-056&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase type IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>CSL-4&amp;nbsp;</td><td>It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Low glucose DMEM&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D5523&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12633-012&amp;nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>First-Link&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>60-00-850&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan blue solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coated silica particle solution (Percoll)</td><td>GE Healtcare&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>17-0891-02&amp;nbsp;</td><td>Percoll&amp;reg; is very stable and can be kept for several years&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>D/4120/PB08&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LDH kit (CytoTox 96)&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G1781&amp;nbsp;</td><td>Keep protected from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM phenol red free</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>31053-028&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>F4/80 antibody (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Do not dilute, used neat for flow cytometry</td></tr><tr><td>Fluorescent beads</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td></tr><tr><td>Name of the Material</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>367288</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.22 &amp;mu;m Blue Rim)&amp;nbsp;</td><td>Minisart&amp;nbsp;</td><td>16534-K&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>35 2070&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (90 x 15 mm)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BSN 101VR20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump&amp;nbsp;</td><td>Watson Marlow&amp;nbsp;</td><td>SciQ 300&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine forceps</td><td>Hammacher GmbH&amp;nbsp;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow cytometry tubes</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&amp;nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td></tr><tr><td>Name of the Reagent</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#039;s Balanced Salt Solution) Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Isolation Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Culture Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td><td></td><td></td><td>Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp; with 15.3 ml of Percoll&amp;reg; to obtain 17mL of SIP.</td></tr><tr><td>25% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>DMEM media with 0.9% Triton X-100</td></tr><tr><td>PBS/BSA Solution</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

インビトロ nanotoxicological研究の大多数は、その実用性のための不死化細胞株を使用しています。しかし、不死化細胞株または初代細胞中でのナノ粒子の毒性試験からの結果は、in vitroアッセイのための一次細胞の使用を拡張する必要性を強調し、不一致を示しています。このプロトコルは、マウス肝臓マクロファージの単離、というクッパー細胞、およびナノ粒子の毒性を研究するためのそれらの使用が記載されています。クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、循環するナノ粒子の取り込みを担う細網内皮系（RES）の一部を構成します。ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。コラゲナーゼ消化および密度遠心分離に基づく方法は、Smedsrød らによって開発されたオリジナルのプロトコルから適合されています。ラット肝細胞のために設計さisolationおよび高い収率を提供し、クッパー細胞の高純度（&gt; 95％）（14×10 6マウス当たりの細胞まで）。この分離方法は、洗練された、または高価な装置を必要とし、したがって、複雑さと細胞収量の間の理想的な妥協点を表していません。重いマウス（35〜45グラム）の使用は、単離方法の収率を向上させるだけでなく、非常に門脈カニュレーションの手順を容易にします。 -CNTs F官能基化カーボンナノチューブの毒性は、変性されたLDHアッセイにより、このモデルで測定しました。この方法は、F -CNTsとのインキュベーション後のクッパー細胞膜の構造的完全性の欠如を測定することによって、細胞の生存率を評価します。 F -CNTsにより誘発される毒性は、単離されたクッパー細胞は、ナノ粒子の毒性試験のために有用であることを強調し、このアッセイを使用して、一貫して測定することができます。 nanotoxicologyの全体的な理解は、臨床の翻訳よりEFFIためのナノ粒子の選択を行うこと、そのようなモデルから利益を得ることができますcient。

非精製実質細胞の数が一致したと（17単離を行った）は、マウスあたり10 6 8〜14×細胞の範囲でした。各マウスの単離は、16から28をプレートウェルに十分でした。トリパンブルー染色によって細胞生存率は、細胞生存率〜95％を示しました。クッパー細胞は、その不完全な接着形態（ 図4A）に関連し、37℃でのインキュベーションの30分以内に丸い形状を示しました。 4時間...

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Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.6K ビュー.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

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Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去<em&gt;その場での</em&gt;回復ブリード水と細胞生存率への影響

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

環境学

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

免疫・感染学

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

生物工学

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor cells, CAFs regulate tumor progression and provide protection from antitumor immunity. Emerging anticancer strategies aim to remodel the tumor microenvironment through the ablation of pro-tumorigenic CAFs or reprogramming of CAFs functions and their activation status. A promising approach is the development of nanosized delivery agents able to target CAFs, thus allowing the specific delivery of drugs and active molecules. In this context, a cellular model of CAFs may provide a useful tool for in vitro screening and preliminary investigation of such nanoformulations.
This study describes the isolation and culture of primary CAFs from the syngeneic 4T1 murine model of triple-negative breast cancer. Magnetic beads were used in a 2-step separation process to extract CAFs from dissociated tumors. Immunophenotyping control was performed using flow cytometry after each passage to verify the process yield. Isolated CAFs can be employed to study the targeting capability of different nanoformulations designed to tackle the tumor microenvironment. Fluorescently labeled H-ferritin nanocages were used as candidate nanoparticles to set up the method. Nanoparticles, either bare or conjugated with a targeting ligand, were analyzed for their binding to CAFs. The results suggest that ex vivo extraction of breast CAFs may be a useful system to test and validate nanoparticles for the specific targeting of tumorigenic CAFs.

This paper aims to provide a protocol for the isolation and culture of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of triple-negative breast cancer and their application for the preclinical study of novel nanoparticles designed to target the tumor microenvironment.&#160;

標的ナノ粒子の研究のための乳癌の同質性マウスモデルからの原発癌関連線維芽細胞の分離

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

がん研究

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

ナノ粒子神経毒性を決定するために、代理バイオセンサーとしてミクログリア

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

神経科学

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

生物学

Isolation and Culture of Mouse Kupffer Cells

Source: Bourgognon, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52989">Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation of Kupffer cells or liver macrophages from the mouse liver. The liver is perfused with a digestion solution followed by density gradient separation. The isolated adherent Kupffer cells can be used for further analysis.

マウスクッパー細胞の単離と培養

Source: Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation ...