This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

全ての動物実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局に準拠して実施されました。実証されているプロトコルは、英国のホームオフィスの規制の指導と承認の下で実施しました 1.灌流および細胞コレクション（図1） <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> 図1：肝灌流マウスを麻酔した後に、消化管は、横方向に門脈（PV）がアクセスできるようにするために、腹部の左側に移動します。 PVはすぐに肝臓内の任意の過剰な圧力を避けるために、破壊されるEGTA / HBSSソリューションと劣るveina静脈（IVC）の遅い流速（1-3 ml /分）を用いてカニューレを挿入します。灌流の最初の分以内、流速は徐々に7ml /分に増加させます。その完全な消化が達成されるまで、コラゲナーゼ溶液を、次いで、10 ml /分で灌流されます。 <ol><li> Prepaたての材料表に記載されているすべての試薬を再度。 </li><li> EGTA（エチレングリコール四酢酸）/ HBSS（ハンクス液）溶液（マウス当たり50ml）と40℃で30分間、コラゲナーゼ溶液（マウス当たり100ミリリットル）を温めます。 </li><li>最初の70％エタノールでポンプフレキシブルチューブを洗浄します。水浴に浸漬遠心分離管にEGTA / HBSS溶液40mlを注ぎ、予め温めておいたEGTA / HBSSソリューションとポンプフレキシブルチューブをすすぎます。 </li><li>確実に呼吸抑制と死の前に無意識を生成するためにバルビツール酸塩を用いて端末麻酔を実行します。女性または男性のCD1マウス（35〜45グラム）には1mg / kg、腹腔内でのフェノバルビトンを注入します。つま先のピンチによって麻酔を確認します。 </li><li>腹部の毛を剃る、70％エタノール溶液を用いて腹部表面を殺菌。 </li><li>腹腔を切断し、腹部の左側に横方向に腸を動かすことにより、門脈および下大静脈を露出させます。 </li><li>スターT EGTA / HBSS溶液で1〜3ミリリットル/分の速度でポンプと23グラム蝶の針を使用して、門脈にカニューレを挿入（翼はカット）。 23 G針でカニューレを挿入し、門脈の部分をクランプした後、開かれたマウスの腹部の表面に止血小鉗子鉗子を反転。肝臓は迅速にEGTA / HBSS溶液灌流の最初の30秒以内に淡い必要があります。 </li><li>急速に肝臓での過剰な圧力の建物を避けるために、 下大静脈の下部を切開し、その後灌流の最初の分を介して、7ミリリットル/分に徐々に流量を増加させます。動物は、大静脈穿刺を静脈する二次出血による死亡します。 </li><li> EGTA / HBSSソリューション未満の5mlを遠心分離管に残っている場合には、コラゲナーゼ溶液（40〜50ミリリットル）でそれを埋めます。 30秒かけて、10ml /分に徐々に流量を増加させます。 </li><li> 5-10秒間隔のために、ピンセットを使用して、 下大静脈に圧力を適用することにより、肝臓うねりを作ります。ティSは（消化中に5〜10倍）を定期的に行うことができます。このステップは、肝細胞の分離を改善し、コラゲナーゼ潅流時間を減少させます。 </li><li>コラゲナーゼ溶液未満の10mlを遠心分離管の中に残っている場合には、遠心分離管に予め温めたコラゲナーゼ溶液を40〜50ミリリットル注ぎます。 </li><li>灌流の10〜15分後、約70〜80ミリリットルのコラゲナーゼ溶液の灌流、鉗子で肝臓の表面に小さな圧力を加えます。圧力の記録は、肝細胞が解離されることを示しています。 </li><li>ワンピースとして腹腔から肝臓を取り出して、クッパー細胞の単離中20〜30 mlを含む遠心管に入れます。肝細胞の生存率への影響を回避するために3時間の最大期間氷上または4℃で肝細胞を保管してください。 </li><li>氷の上に灌流肝臓を維持しながら、必要に応じていくつかの動物で灌流手順を繰り返します。プールを精製するための3つの肝臓への1つ、ステージ3に進みます。 </li></ol>遠心分離のための密度勾配（図2）の調製<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> 図2：密度勾配の調製すべての操作は、無菌状態下で行われます。 SIPは、10×PBS 1.7 mlの被覆シリカ粒子溶液15.3 mlと混合することによって調製されます。 SIP 5mlの25％のSIP溶液20mlを作るためにPBS 15mlで混合されます。 SIP 10mlの50％のSIP溶液20mlを作るために10mlのPBSと混合します。 50％SIP溶液（20ml）で傾斜している、25％のSIP溶液（20ml）に含む遠心管をゆっくり25mLの血清学的ピペットを使用して追加されます。 <ol><li>無菌状態の下で、次のステップ（部2、3＆5）に進み、氷上で、または4℃で細胞を維持します。 10×PBS 1.7 mlの被覆シリカ粒子溶液の15.3ミリリットルを混合することにより、SIP（等張性被覆シリカ粒子溶液）を準備します。 </lI&gt; <li> 25％のSIP溶液20mlを作るために、PBS 15mlでSIPの5ミリリットルを混ぜます。 50％のSIP溶液20mlを作るために、PBS 10mlでSIPの10ミリリットルを混ぜます。 </li><li> 50％のSIP溶液20mlで1遠心管を埋めます。 90°に近い角度で遠心チューブを傾けて、50％のSIP層の表面に触れることなく、25ミリリットルの血清学的ピペットを用いてチューブの側壁に徐々に25％SIP溶液（20ml）に加えます。 25％のSIPソリューションを追加する場合は、漸進的にチューブの角度を減少させます。使用するまで氷上で密度勾配を維持します。 </li></ol> 3.クッパー細胞精製（図3） <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> 図3：密度勾配遠心分離および細胞接着によってクッパー細胞の精製は、すべての手順は、無菌条件下で行われます。 （A）グリソン鞘が破裂した後に、肝細胞は、1で濾過します00ミクロンストレーナ。懸濁液は、肝細胞（ペレット）を破棄し、非実質細胞画分（上清）を収集するために×50 gで遠心分離します。この工程を3回繰り返します。非実質細胞は、不連続等張勾配の最上部に添加し、15分間、800×gで遠心分離します。 25％のSIPクッションから収集クッパー細胞は、細胞接着の選択によりさらに精製されます。 （B）細胞を、24ウェルプレートに播種し、30分間37℃、5％CO 2でインキュベートします。非接着細胞を500μlのHBSSで一回洗浄します。クッパー細胞を f -CNTsを細胞に添加することができる場合には、メッキ後に接着形態4時間を表示します。スケールバーは25μmで表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <ol><li> 1灌流肝臓はクッパー細胞の単離培地15mlでペトリ皿に入れてください。 （グリソン鞘を破裂肝臓の膜）はさみを使用し、クッパー細胞の単離培地にすべての肝細胞を放出します。 100μmのセルストレーナーを遠心管に収集することができるためにかかわらず、ソリューションをフィルタリングします。追加の灌流肝臓に灌流手順を繰り返し、（3匹のマウスから45ミリリットルまで、マウスを一回から15ミリリットル）同じ遠心チューブに細胞をプール。 </li><li> 4℃で2分間、50×gで細胞懸濁液を遠心。実質細胞（肝細胞）は、ペレットになり、（クッパー細胞を含む）の非実質細胞を上清になります。 </li><li> 2分ごとに、50×gで清潔な遠心チューブと遠心分離機で上清を収集します。このステップをさらに3回繰り返します。 </li><li>非実質細胞をペレット化するために15分間、1,350×gで遠心分離します。上清を捨て、クッパー細胞の単離培地10mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> 2.3で説明したように不連続等張勾配に関して25/50％を非実質細胞溶液を追加します。セント加速度や休憩なしで15分間、850×gでrifuge。 </li><li> 50分の25％のSIPインターフェースに近い25％のSIP画分（ 図3）内に濁っ現れる富むクッパー細胞画分をローカライズ。約12ミリリットル濃縮されたクッパー細胞画分の、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて吸引します。クッパー細胞の単離中35〜40 mlを含む遠心チューブに細胞を移します。細胞をペレット化し、4℃で15分間、1,350×gで静かにして遠心混ぜます。 </li><li>予め温めておいたクッパー細胞培養培地5〜10mlの中で上清と再懸濁細胞を捨てます。細胞（血球計）をカウントし、トリパンブルー染色を用いて生存率を測定します。 </li><li> /ウェルで5×10 5細胞の密度で24ウェルプレート中の精製非実質細胞をプレート。 37℃、5％CO 2（ 図3）で細胞をインキュベートします。 30分後、静かに置き換える一旦予め温めたハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し、培地を除去新鮮で予め温めておいたクッパー細胞培養培地500μlでそれ（ウェル）。 </li><li>彼らの付着形態を獲得できるようにするために、ナノ粒子を用いた治療の前に37℃で少なくとも4時間、5％CO 2のためのクッパー細胞のままにしておきます。 </li></ol> 4.特性<ol><li>クッパー細胞の純度<ol><li>クッパー細胞生存率を維持するために使用される新鮮なPBS / BSA溶液を調製します。 PBS / BSA溶液500μlで細胞を1回洗浄します。 PBS / BSA溶液を除去し、穏やかなスクレイピングを使用して、新鮮なPBS / BSA溶液500μlのクッパー細胞を切り離します。細胞を24ウェルプレートにプレーティングされている場合、続行するには着脱を容易にするためにハサミでスクレーパーブレードの先端を短縮。チューブ、フローサイトメトリーに細胞を移します。 </li><li>血球計および遠心1,350×gで1×10 5個の細胞を用いて、クッパー細胞をカウントします。 F4 / 80抗体（ニート）の30μlに再懸濁クッパー細胞。よく混ぜ、3室温でインキュベート0分。氷上で染色されていない細胞（抗体とインキュベートしていない）を保持します。 </li><li> 5分間1350グラムで、染色された細胞内で遠心分離機をPBS / BSA溶液2mlを添加し、得られた上清を捨てます。 PBS / BSA200μlの染色細胞を再懸濁します。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために、ゲート万未染色のクッパー細胞、そのサイズ（前方散乱）および粒度（側方散乱）に従って。 FL-1チャンネルでゲートされた細胞の蛍光を分析します。 </li><li>未染色のクッパー細胞のフローサイトメトリー分析に使用したのと同じ設定を維持染色クッパー細胞のための手順を繰り返します。選択し、クッパー細胞の純度を評価するために染色された細胞の蛍光を定量化します。 </li></ol></li><li>クッパー細胞貪食能<ol><li>クッパー細胞培養培地（v / v）の蛍光ビーズを0.5％と、メディアを交換し、37℃で4時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li> 1,350×gで、二に、非内在化ビーズを、遠心クッパー細胞を除去するために500μlのPBS / BSA溶液中の上清および再懸濁細胞をSCARD。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li>フローサイトメトリーチューブにPBS / BSAソリューションおよび転送細胞の500μlの中でかき取りクッパー細胞。 </li><li> 1,350×gで遠心分離しクッパー細胞は、PBS / BSA溶液の200μlの上清と再懸濁した細胞を捨てます。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために、ゲート万未染色のクッパー細胞、そのサイズ（前方散乱）および粒度（側方散乱）に従って。 FL-2チャンネルでゲートされた細胞の蛍光を分析します。 </li></ol></li></ol> （-CNTs f）は 、化学的に機能カーボンナノチューブの5インキュベーション<ol><li>使用前に15分間の超音波処理により水中のF -CNTs（1mg / ml）の分散液を調製します。F -CNTsは、社内で22用意されています。 </li><li> 2倍濃縮したF-CNTを準備 クッパー細胞培養培地中での分散。 超音波処理をするための媒体中に分散されたCNTをF-ステップ5.3に進む前に2分）。 </li><li>各ウェルについて、2×F -CNTs分散液250μlの古いメディアの250μlのを交換してください。未処理のウェル（新鮮なクッパー細胞培養培地の馴化培地+ 250μlと250μl）を、10％のDMSOで処理したウェルを、それぞれ陰性および陽性対照として使用されています。 </li><li> 24または72時間、CO 2、37℃で、5％クッパー細胞をインキュベートします。 </li></ol>変更された乳酸脱水素酵素（LDH）アッセイによるクッパー細胞中のF -CNTsの6毒性評価<ol><li>上清を捨てます。 </li><li>溶解バッファーの（24ウェルプレートのウェルあたり）200μlを添加して、30分〜1時間、37℃でインキュベートします。 </li><li>激しいピペッティングを行った後、細胞と細胞の破片によって取り込まれた-CNTs fをペレット化し、10分間40,000×gでマイクロ遠心チューブと遠心分離機に溶解したクッパー細胞を収集します。 </li><li>に上清（ƒ-CNT無料）を収集マイクロ遠心チューブ、-20℃で保存または）は、6.5に進みます。 </li><li> 96ウェルプレートに50μLを移し、各ウェルに基質混合溶液（LDHキット）の同体積を追加します。プレートをカバーし、停止溶液（LDHキット）を50μlを添加する前に室温で15分間インキュベートします。溶解緩衝液50μlを、基質混合液50μlの停止溶液50μlを含むブランクウェルの三重を加えます。 </li><li>マイクロプレートリーダーで490 nmの吸光度を読んで、（％）細胞生存率を計算するために、次の式を使用しています。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

次の手順では、高収率とクッパー細胞の高い生存率を達成することが重要です。無菌状態は、細菌および真菌の汚染の危険性を制限するために使用されるべきです。すべての器具は、使用前に滅菌する必要があります。試薬は、新たに単離手順を実行する前に準備する必要があります。 コラゲナーゼIVの選択は、低いトリプシン活性を有する、非常に重要です。同一の供...

nanotoxicology研究の分野は、ナノ粒子の生物学的効果を特徴づけることを目的とします。 in vivoでの調査に基づいて、毒性試験は、最も正確な方法のまま。しかし、その使用は、コスト、労力と時間の要件1によって制限されます。その試験した条件の数を拡張する-代替案としては、in vitroアッセイであるため、そのシンプルさとインビトロ試験プラットフォーム2 に高スループットの開発の可能性を使用されています。ほとんどnanotoxicological研究は、不死化細胞株を用いたin vitro アッセイを用いて実施されます。しかし、in vivoでの毒性効果3に、これらの実験結果の外挿に関する懸念があります。実際には、不死化細胞株の特性は、それらが由来した組織、 例えば、遺伝的形質転換4、鍵の形態学的特徴の劣化が著しく異なる可能性が5、携帯極性6などの炎症性メディエーター7の調節などの機能変化の損失。 クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、肝臓の類洞の壁の内側を覆うことにより、血液と直接接触しています。細網内皮系（RES）の一環として、これらのマクロファージは、ナノ粒子を循環、したがってのキャプチャを担当している、ナノ粒子の毒性を研究するために非常に適したモデルを構成している。 インビボ 8 in vitroでのナノ粒子に曝露されクッパー細胞に関連する炎症反応の9研究が他の場所で公開されています。クッパー細胞はまた、アルコール性肝疾患10、肝線維症11またはウイルス性肝炎12のような肝疾患の病因に関与しています。これは、INV、単離されたクッパー細胞は、細胞メカニズムを説明するための有用な洞察を提供することが報告されました肝臓破壊13,14にolved。 いくつかの方法は、クッパー細胞を単離し、精製することが報告されています。細胞の単離は、機械的または酵素的解離15から生じ得ます。コラゲナーゼ消化は高クッパー細胞収率16につながるながら、クッパー細胞の機能的完全性を保存することの利点を示しています。複雑さとコストが異なる多くの実験的なアプローチは、他の肝細胞集団からのクッパー細胞を分離するために使用されています。例えば、クッパー細胞の純度は、イムノ17、フロー電気泳動18、選択的接着16によって、またはそれらのサイズおよび密度に応じてセルを選択し、遠心技術16、によって達成することができます。これらの方法の組み合わせは、人口16の純度を高めるように選択することができます。それは、ほとんどのアプリケーションと利用可能なequipmenに依存するようにクッパー細胞の単離のための理想的な方法についての合意はありませんが、T。しかし、ナノ粒子の毒性試験の場合には、単純さとクッパー細胞の機能維持に関連付けられた技術の高い収率は、このアプリケーションのために最も適していると思われました。 ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。この方法は、Smedsrød らが開発した独自プロトコルから変更されました。16は、ラット肝細胞の単離のために設計されています。ほとんどの研究が報告され、ラットの肝臓のクッパー細胞の単離を記載しています。ここで、我々は、高い収率及び純度で、マウス肝臓のクッパー細胞を単離する方法を記載します。マウスの使用は、実験のコストを削減し、いくつかの肝臓の処理は、ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞を大量に得ることができます。 以下のプロトコルは、クッパー細胞を官能基化カーボンナノチューブ（Fと共にインキュベートしました</em&gt;の-CNTs）。 CNTの固有の物理化学的特性-直径比と大きな表面積、即ち高い長さ、治療および診断目的のためのベクターとしてのCNTの興味深い候補を行いました。しかし、懸念は、カーボンナノチューブ19の毒性に関して提起されており、in vitro試験で 、新しいの開発は、CNTの生物学的効果の理解を高めることを目指しています。クッパー細胞における毒性は、細胞膜の構造的完全性の欠如に関連しています。これは、上清中に細胞から細胞質酵素LDHの損失によって測定されます。この方法の原理は、従って、任意の放出されたLDHを除去し、セル20に残っているものを測定することです。上清中のカーボンナノチューブの存在は、アッセイ21に干渉するので、これは上清中に放出されたLDHの測定に優先して行われます。 我々は、このシンプルでコスト効率のクッパー細胞の単離メトの使用を提案していますdは、機能クッパー細胞の数が多いを単離します。これは、関連する主要なマクロファージモデルでは、ナノ粒子の範囲の毒性のスクリーニングを可能にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td dir="LTR">Euthatal (pentobarbital sodium)</td>
			<td dir="LTR">Merial</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">CD1 mice</td>
			<td dir="LTR">Charles River&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">-</td>
			<td dir="LTR">Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">14175-053</td>
			<td dir="LTR">HBSS must be&#160; Ca2+ free.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">E8145&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">HEPES (1M)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">15630-056&#160;</td>
			<td dir="LTR">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Collagenase type IV&#160;</td>
			<td dir="LTR">Worthington&#160;</td>
			<td dir="LTR">CSL-4&#160;</td>
			<td dir="LTR">It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">&#160;Low glucose DMEM&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">D5523&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax&#174;)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">12633-012&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Penicillin/Steptomycin&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">15140-122</td>
			<td dir="LTR">100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td dir="LTR">First-Link&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">60-00-850&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Trypan blue solution&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR">T8154&#160;</td>
			<td dir="LTR">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Coated silica particle solution (Percoll&#174;)</td>
			<td dir="LTR">GE Healtcare&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">17-0891-02&#160;</td>
			<td dir="LTR">Percoll&#174; is very stable and can be kept for several years&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">1x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">10010-023</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">10x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">70011-036</td>
			<td dir="LTR">500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td dir="LTR">Fisher&#160;</td>
			<td dir="LTR">D/4120/PB08&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">LDH kit (CytoTox 96&#174;)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Promega&#160;</td>
			<td dir="LTR">G1781&#160;</td>
			<td dir="LTR">Keep protected from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">DMEM phenol red free</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">31053-028&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">F4/80 antibody (Alexa 488)</td>
			<td dir="LTR">AbD Serotec</td>
			<td dir="LTR">MCA497A488</td>
			<td dir="LTR">Do not dilute, used neat for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Fluorescent beads</td>
			<td dir="LTR">Sigma</td>
			<td dir="LTR">L2778</td>
			<td dir="LTR">Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of the Material</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog number&#160;</td>
			<td>Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing)&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD&#160;</td>
			<td dir="LTR">367288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Syringe Filters (0.22 &#956;m Blue Rim)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Minisart&#160;</td>
			<td dir="LTR">16534-K&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD Biosciences, Falcon&#160;</td>
			<td dir="LTR">35 2070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Petri dish (90 x 15 mm)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Thermo Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BSN 101VR20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">100 &#956;m cell strainer&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Peristaltic pump&#160;</td>
			<td dir="LTR">Watson Marlow&#160;</td>
			<td dir="LTR">SciQ 300&#160;&#160;</td>
			<td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">24-well plates</td>
			<td dir="LTR">Corning&#160;&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">96-well plates&#160;</td>
			<td dir="LTR">Corning&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Serrefine forceps</td>
			<td>Hammacher GmbH&#160;</td>
			<td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td>
			<td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon&#160;</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Elkay</td>
			<td>&#160; 000-MICR-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Cell scraper</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>353086</td>
			<td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Name of the Reagent</td>
			<td dir="LTR">Company&#160;</td>
			<td dir="LTR">Catalog number&#160;</td>
			<td dir="LTR">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">&#160;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution) Solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Collagenase Solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Kupffer Cell Isolation Medium&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&#174; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Kupffer Cell Culture Medium&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&#174; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&#160; with 15.3 ml of Percoll&#174; to obtain 17mL of SIP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">25% SIP solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">50% SIP solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Lysis Buffer</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">DMEM media with 0.9% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">PBS/BSA Solution</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

インビトロ nanotoxicological研究の大多数は、その実用性のための不死化細胞株を使用しています。しかし、不死化細胞株または初代細胞中でのナノ粒子の毒性試験からの結果は、in vitroアッセイのための一次細胞の使用を拡張する必要性を強調し、不一致を示しています。このプロトコルは、マウス肝臓マクロファージの単離、というクッパー細胞、およびナノ粒子の毒性を研究するためのそれらの使用が記載されています。クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、循環するナノ粒子の取り込みを担う細網内皮系（RES）の一部を構成します。ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。コラゲナーゼ消化および密度遠心分離に基づく方法は、Smedsrød らによって開発されたオリジナルのプロトコルから適合されています。ラット肝細胞のために設計さisolationおよび高い収率を提供し、クッパー細胞の高純度（&gt; 95％）（14×10 6マウス当たりの細胞まで）。この分離方法は、洗練された、または高価な装置を必要とし、したがって、複雑さと細胞収量の間の理想的な妥協点を表していません。重いマウス（35〜45グラム）の使用は、単離方法の収率を向上させるだけでなく、非常に門脈カニュレーションの手順を容易にします。 -CNTs F官能基化カーボンナノチューブの毒性は、変性されたLDHアッセイにより、このモデルで測定しました。この方法は、F -CNTsとのインキュベーション後のクッパー細胞膜の構造的完全性の欠如を測定することによって、細胞の生存率を評価します。 F -CNTsにより誘発される毒性は、単離されたクッパー細胞は、ナノ粒子の毒性試験のために有用であることを強調し、このアッセイを使用して、一貫して測定することができます。 nanotoxicologyの全体的な理解は、臨床の翻訳よりEFFIためのナノ粒子の選択を行うこと、そのようなモデルから利益を得ることができますcient。

非精製実質細胞の数が一致したと（17単離を行った）は、マウスあたり10 6 8〜14×細胞の範囲でした。各マウスの単離は、16から28をプレートウェルに十分でした。トリパンブルー染色によって細胞生存率は、細胞生存率〜95％を示しました。クッパー細胞は、その不完全な接着形態（ 図4A）に関連し、37℃でのインキュベーションの30分以内に丸い形状を示しました。 4時間...

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Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.5K ビュー.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

機能心臓の免疫細胞の単離

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

免疫・感染学

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em&gt; ex vivoで</em&gt;細胞培養

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections may be one possible cause. The typical animal model used for studying BA is established by inoculating a neonatal mouse with a rhesus rotavirus. Silver nanoparticles have been shown to exert antibacterial and antiviral effects; their function in the BA mouse model is evaluated in this study. Currently, in BA animal experiments, the methods used to improve the symptoms of BA mice are generally symptomatic treatments given via food or other drugs. The aim of this study is to demonstrate a new method for ameliorating BA syndrome in mice by the intraperitoneal injection of silver nanoparticles and to provide detailed methods for preparing the silver nanoparticle gel formulation. This method is simple and widely applicable and can be used to research the mechanism of BA, as well as in clinical treatments. Based on the BA mouse model, when the mice exhibit jaundice, the prepared silver nanoparticle gel is injected intraperitoneally to the surface of the lower liver. The survival status is observed, and biochemical indicators and liver histopathology are examined. This method allows a more intuitive understanding of both the establishment of the BA model and novel BA treatments.

This article describes in detail a method based on silver nanoparticles for ameliorating biliary atresia syndrome in an experimental biliary atresia mouse model. A solid understanding of the reagent preparation process and the neonatal mouse injection technique will help familiarize researchers with the method used in neonatal mouse model studies.

マウスにおける胆道閉鎖症症候群を改善するための銀ナノ粒子法

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...