El objetivo general de este procedimiento de infusión del conducto pancreático es permitir el rastreo del linaje, la introducción de genes y la orientación específica de la línea celular en el páncreas. Este método podría ayudar a responder preguntas clave sobre las enfermedades que afectan el páncreas, incluida la pancreatitis crónica, la diabetes y el cáncer de páncreas. Para comenzar, coloque un ratón anestesiado bajo un microscopio de disección para que su abdomen se coloque en el centro del campo de visión.
Inmovilizar al animal con una cinta quirúrgica y luego aplicar una pomada oftálmica en sus ojos para evitar que se sequen. A continuación, cubra el abdomen del ratón con una capa gruesa de crema depilatoria. Y después de aproximadamente tres minutos, limpie suavemente la crema con una gasa empapada en etanol al 70% para eliminar todo el vello.
Finalmente, limpie la piel con etanol al 70%, seguido de una solución de yoduro de povidona al 10% para eliminar cualquier contaminante y desinfectar la piel. Para comenzar la cirugía, cree con un bisturí una incisión en la línea media de la piel que se extienda desde el proceso xifoide hasta el ombligo. Luego, usando las pórceps Adson, levanta el peritoneo y haz con tijeras un pequeño orificio en la línea media.
Expanda el corte a lo largo de la línea media del peritoneo para que su longitud sea igual a la longitud de la incisión en la piel. A continuación, use retractores contundentes para levantar el hígado y después de exponer el conducto biliar común, pinzarlo con una pinza vascular de bulldog curva. Identifique el duodeno y con arrugas, extraiga caudalmente para mostrar la papila visible como una mancha blanca en la superficie anterior de la segunda porción del duodeno.
Para identificar el conducto pancreático, retire el duodeno caudalmente, luego coloque una aguja de calibre 30-1/5 tangencialmente al duodeno y haga una punción en su pared que se enfrente directamente a la papila. Para infundir la solución, introduzca el catéter conectado a una bomba de infusión a través de la duodenotomía creada y deslícelo a lo largo del conducto hasta que sea visible dentro del vaso, pero no alcance más de un centímetro para evitar evitar los afluentes ductales menores. Inmovilizar el catéter pinzándolo con una segunda pinza vascular de bulldog curvada.
Luego encienda la bomba para iniciar la infusión de 150 microlitros de la solución en el conducto. A continuación, inyecte en el peritoneo del ratón aproximadamente 1,5 mililitros de solución salina para evitar cualquier pérdida de volumen infundido y luego cubra el intestino expuesto con una gasa humedecida para evitar la desecación. Una vez completada la infusión, suelte el catéter inmovilizado y, con la pinza bulldog, retírelo suavemente del conducto pancreático.
Luego suelte la abrazadera del conducto biliar común. Cierre el peritoneo y la piel suturándolos continuamente en una sola capa y administre la primera de las dos dosis de analgésico, la segunda de las cuales se administrará al día siguiente. Luego devuelva el ratón a una jaula colocada debajo de una lámpara de calor y proporcione al animal comida y agua ad libitum.
Observe al ratón hasta que haya recuperado la conciencia suficiente manifestada en la recosta esternal. Siete días después de la cirugía, el extirpación del páncreas animal sacrificado, así como el bazo, el hígado y el duodeno sirven como controles. Sumerja todos los tejidos aislados en una solución de paraformaldehído al 4% y fijarlos a cuatro grados centígrados durante la noche.
Una vez que los tejidos están fijos, crio proteja las muestras empapándolas en una solución de sacarosa al 30% a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de una crioprotección durante la noche, congele las muestras en nitrógeno líquido y, con un microtomo, corte las secciones de tejido a seis micrómetros. Finalmente, imagine las secciones bajo un microscopio fluorescente.
Aquí se presentan imágenes microscópicas de secciones de páncreas extirpadas de ratones siete días después de una cirugía simulada y la infusión del conducto pancreático de AAV8 que porta el gen GFP. El hígado, el bazo y el duodeno aislados del ratón infundidos con AAV8 no mostraron ninguna señal de GFP, mientras que el páncreas reveló una expresión prominente de GFP, lo que confirma la administración específica del virus por el páncreas después de la infusión del conducto pancreático. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en 10 minutos cuando se realiza correctamente.
Al realizar este procedimiento, es muy importante realizar una disección cuidadosa y hacer la duodenotomía más pequeña posible para la introducción del catéter. Después de su desarrollo, la técnica allanó el camino para que los investigadores que estudian el páncreas investiguen una serie de patologías que afectan al órgano, incluida la pancreatitis crónica, la diabetes y el cáncer de páncreas tanto en roedores como en modelos animales más grandes. Después de ver este video, debe tener una muy buena comprensión de cómo infundir de manera efectiva y selectiva el conducto pancreático.
