Nuestro protocolo proporciona una canalización tanto para la integración precisa como para la detección visual simple de ediciones CRISPR, así como un ejemplo de fenotipado posterior a la edición. La principal ventaja de este enfoque es la facilidad de detección de ediciones CRISPR, lo que permite una identificación eficiente y simplificada de las ediciones exitosas. Este enfoque permite la generación y caracterización simples de variantes asociadas a enfermedades en el pez cebra.
Aquí, estamos examinando el síndrome de QT largo. Los estudios de seguimiento sobre terapias farmacéuticas son entonces factibles de explorar. Comience diseñando dos guías de sgRNA para extirpar la secuencia del sitio objetivo mediante la identificación del ortólogo del pez cebra para el gen de interés.
Utilice Ensembl para localizar el sitio objetivo dentro de la secuencia de genes de interés, incluida la secuencia flanqueante de dos kilobases utilizada para hacer la plantilla. Utilice una herramienta de software de diseño como CRISPOR y seleccione especies de Danio rerio y enzima Cas. Para el enfoque de dos sgRNA, elija un sgRNA antes del exón objetivo y un segundo sgRNA dentro del intrón inmediatamente posterior.
Asegúrese de que los sgRNAs seleccionados tengan una alta especificidad y una baja unión prevista fuera del objetivo. Utilice las clasificaciones de CRISPOR para identificar guías con un enlace mínimo fuera del objetivo. Ahora identifique los sitios potenciales fuera del objetivo más probables para el genotipado de secuenciación de Sanger basado en PCR.
Después de seleccionar los dos sgRNAs, obtenga el complemento inverso para cada uno, dos oligos complementarios que preceden a la mutación y dos oligos complementarios aguas abajo de la mutación. Agregue sitios de restricción compatibles en cada oligo para incorporar la guía en el plásmido de su elección. Para la integración de las secuencias guía seleccionadas en el plásmido DR274, cree un voladizo utilizando un sitio de restricción BSA1 de cinco primos y diseñe los sitios de reconocimiento BSA1 en los cinco extremos principales de las guías.
A continuación, diseñe la plantilla exógena para HDR en pez cebra eligiendo dos fragmentos de secuencia que flanquearán el gen reportero YFP venoso M alojado en el plásmido PKHR5. Divida la plantilla en dos segmentos para insertarla a cada lado del gen reportero de YFP venoso M. Asegúrese de que el sitio dividido esté en un intrón para evitar cortar la secuencia de codificación.
Incorporar todas las modificaciones necesarias mencionadas en el manuscrito para facilitar la clonación en el plásmido PKHR5. Inyecte los embriones en la etapa de una célula aproximadamente 40 minutos después de la fertilización. Después de tres días de fertilización, anestesiar la larva de pez cebra transfiriéndola a una placa de Petri de 25 milímetros que contiene 0.3% MS222 hasta que pierdan su reflejo de autoenderezamiento.
Una vez anestesiada, transfiera la larva al pozo de una placa de 24 pocillos. Usando un microscopio capaz de detectar GFP o YFP, detectar la fluorescencia del gen reportero en los ojos de la larva. Después de capturar las imágenes de la larva, documente la presencia o ausencia de la expresión génica del reportero.
Para confirmar la edición precisa y precisa del gen HDR, realice el genotipado anestesiando primero a la larva tres días después de la fertilización como se demostró anteriormente y aislando el ADN genómico del clip de cola utilizando el método hotshot. Agregue el clip de cola extirpado a 15 microlitros de hidróxido de sodio milimolar de 25 milimolar e incube 95 grados centígrados durante 20 minutos, luego neutralice con 1.5 microlitros de ácido clorhídrico tris. Centrifugar a 13, 800 veces G durante 30 segundos, y retener el sobrenadante que contiene el ADN genómico extraído.
Recuperar la larva en medios E3 y devolverla al sistema de alojamiento si se pretende realizar más estudios. Usando el ADN genómico extraído como plantilla, realice la secuenciación de Sanger basada en PCR de sitios en el objetivo y potencialmente fuera del objetivo. Asegúrese de que el diseño del cebador en el objetivo capture el sitio de mutación y el sitio de unión de sgRNA más cercano.
Diseñar un cebador de secuenciación separado para detectar la transición del brazo de homología insertado y el gen objetivo para confirmar la integración en el gen de interés. Diseñe cebadores para secuenciar los tres principales sitios potenciales fuera del objetivo. Compile genotipado dentro y fuera del objetivo, frecuencia cardíaca, dimensiones pericárdicas, fenotipado de ECG y datos de genes reporteros identificables para cada pez cebra.
La expresión génica del reportero venoso YFP M se observó en las islas, actuando como un reportero positivo de integración exitosa de plantillas. Se encontró que los peces reporteros con gen positivo tenían la edición precisa G2A que introduce la variante R56Q en ZKCNH6A. La medición de las dimensiones pericárdicas como una proporción del área de los ojos se muestra aquí.
Se observó una tendencia de bradicardia con aumento del edema pericárdico asociado a los trastornos de la repolarización cardíaca en peces cebra en larvas editadas en el gen R56Q. Aquí se muestra el registro de ECG del corazón de una larva de pez cebra tres días después de la fertilización. El aspecto más importante de este enfoque es el diseño de guías, como suele ser el caso en los procedimientos CRISPR.
Las guías eficaces son esenciales para el éxito de las ediciones CRISPR. Se pueden seguir métodos CRISPR alternativos que permiten una mayor precisión u otras funcionalidades. Además, se pueden insertar genes grandes, como un complejo de edición principal que proporciona un sistema de edición inducible in vivo.
