Name: isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01 AR061164-01A1).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso en el Instituto de investigación de centro médico de Maine.
1. colección tubos preparación
<ol><li>Hacer los medios de cultivo CMMo complementando α medio esencial mínimo (MEM α) con 10% suero bovino Fetal y 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Coloque 100 μl CMMo de medios de cultivo en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. 3 huesos generalmente caben en un solo tubo así que prepararse por consiguiente.</li>
	<li>Corte los extremos de puntas de pipeta de 200 μL lo suficiente como para que encajen en los tubos de la centrífuga. Inserte las puntas dentro de los tubos y asegurarse de que puede cerrar la tapa antes de colocar los tubos en hielo. Nota: Alternativamente, tubos de microcentrífuga de 0,75 mL con el corte de puntas pueden insertarse en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
</ol>2. cosecha de huesos de ratones
<ol><li>Eutanasia a los animales con CO2 seguido por dislocación cervical y rociarlas con etanol al 70%. Nota: Asegúrese de que se utilicen animales del mismo sexo y preferentemente de la misma edad. Rutinariamente utilizamos animales de 7 a 8 semanas de edad. Se recomienda la agrupación de células de al menos 3 animales por grupos experimentales para obtener una mejor población representativos y reproducibles de la célula.</li>
	<li>
Coloque el ratón sacrificio sobre su espalda en una mesa de disección. Utilice pinzas para crear una tienda de piel en el abdomen. Haga una incisión pequeña (alrededor de 1 cm) con unas tijeras de disección estériles. Retire la piel hacia las extremidades y los pies del corte para exponer la parte inferior del abdomen y las piernas.
	<ol>
<li>Corte debajo del tobillo para sacar el prensatelas. Corte a lo largo de la cresta ilíaca en la cadera para separar la cabeza del fémur de la cadera. Cuando el ratón está todavía en su parte posterior, hacer una incisión en el centro de la cadera para separar los dos huesos ilíacos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar trapos libres de pelusa, retire con cuidado el músculo del fémur, tibia y huesos iliacos. Nota: Corte tanto de los tendones y el músculo del hueso como hace posible la limpieza más rápida y fácil con los trapos sin pelusa (por ejemplo, kimwipes). Tenga cuidado al manipular los huesos tienden a romperse fácilmente y su fragilidad puede aumentarse con ciertos genotipos.</li>
	<li>Una vez que todas las muestras han sido disectadas, colocarlos en PBS en el hielo y mover a una campana de cultivo estériles para los pasos restantes de aislamiento. Nota: Trabajar asépticamente posible reduce la posibilidad de contaminación en los cultivos.</li>
	<li>Hacer cortes pequeños (aproximadamente 1 a 2 mm) en los extremos proximales y distales de los huesos antes de colocarlos en las puntas seccionadas dentro de los tubos de la centrífuga. Nota: Asegúrese de que para cortar una cantidad suficiente para que la médula ósea puede ser centrifugada sin embargo, debe tenerse cuidado para evitar cortar demasiado como poblaciones celulares tienden a variar basado en proximidad dentro del espacio de la médula ósea.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 x g durante 15 s a temperatura ambiente. Asegúrese de que la médula es limpiada y peleteada en la parte inferior del tubo de 1.5 mL, mientras que los huesos están dentro de los partes movibles (o 200 μL pipeta tip o 0,75 mL tubo de microcentrífuga). Una vez que se recoge la médula, remueva la con los huesos de los tubos de la colección. Nota: Si se lava la médula, los huesos aparecerán blancos. Sin embargo, si la médula ósea permanece en ciertos huesos, puntas de corte a intentarlo y centrifugue.</li>
</ol>3. suspensión
<ol><li>Utilizando una aguja de 25 G, tire el celular bolitas de arriba y abajo lentamente para romper terrones y combinar todas las muestras en un tubo cónico de 15 mL solo. Añadir 10 mL de medio de cultivo CMMo por 500 μl de las muestras.</li>
	<li>Coloque un filtro de 70 μm en la parte superior un tubo cónico de 50 mL y pasar la suspensión celular a través de este filtro para eliminar fragmentos de huesos posible.</li>
</ol>4. galjanoplastia y la cultura de poblaciones mixtas de células de médula ósea (Total BMC)
Nota: Las células se cultivan a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2.
<ol><li>Calcular el número de células y placa a 1.0 x 106 células/cm2 en medios de cultivo. Permite 72 h de cultivo mixto de células a conectar. Nota: Se recomienda diluir la suspensión celular 20 x en medios de cultivo y diluir otra vez en trypan azul antes de contar las células usando un hemocitómetro. De ratones C57Bl6/J machos de 7 semanas de edad, rutinariamente cedemos a un numero de celular de alrededor de 50 x 106 células pero edad, sexo y tensión pueden afectar mucho numero de celular. Nota: Una población mezcla de células debe adjuntar en la parte inferior de la cultura bien.</li>
	<li>Después de 72 h, eliminar los medios de comunicación y reemplazarlo con medio fresco. Continuar cambiando los medios de comunicación todos los otros días y Compruebe la confluencia. Cuando las células alcanzan confluencia de 80-100%, están listos para la diferenciación. Nota: Ya que esta cultura se mezcla con BMSCs y HSCs, se puede utilizar directamente para osteoblastogenesis, adipogénesis y la osteoclastogénesis.</li>
</ol>5. galjanoplastia y la cultura de la población de Split de BMSCs (BMSCs adherentes)
Nota: Las células se cultivan a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2.
<ol><li>Todas las células recogidas del fémur, tibia y huesos iliacos de un ratón en una placa de cultivo de 10 cm (55 cm2 de área de la cultura) de la placa. Nota: Cuando agrupación de ratones C57BL/6J de 2-3, nosotros normalmente la placa esta población 'total' de la médula en un matraz de 150 cm2 .</li>
	<li>Después de 48 h de cultivo mixto, eliminar los medios de cultivo (que contiene la HSCs no adherente). Si osteoclastogénesis experimentos a realizar, establecer esta población de células no adherentes a un lado (véase sección 7), si no, aspirado y desechar estas células.</li>
	<li>Lave el matraz y la placa con PBS con cuidado para no molestar las células adjuntas.</li>
	<li>Quitar PBS y levantar las células añadiendo 0.25% tripsina y mediante la adición de los medios de comunicación de la célula a la suspensión de células de incubación a 37 ° C durante 1-3 minutos apaga la tripsina. En este punto, BMSCs, que ahora se levantan, pueden ser considerados (previamente hecho en paso 4.1) y plateados de experimentos futuros.</li>
	<li>Calcular el número de células necesarias para la galjanoplastia. Centrifugue el volumen requerido de la suspensión celular a 1.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Nota: Las células se platean típicamente basado en experimentos de punto final. Por ejemplo, si la proteína/RNA debe ser aislado típicamente plateamos en una densidad más alta (~1.0-2.0 x 106 células/pozo en placa de 6 pozos).</li>
	<li>Retire los medios de comunicación y resuspender el precipitado de células en el volumen de medios de cultivo necesarios para placas. Las células en medios de cultivo según los experimentos de la placa y permitirles conectar durante unos días. Cuando las BMSCs llegar a confluencia, proceder a realizar la diferenciación.</li>
</ol>6. diferenciación de BMSCs
<ol><li>
Osteoblastos
	<ol>
<li>Hacer medios de diferenciación de osteoblastos añadiendo 800 μl de 1 M β-glicerol fosfato en PBS y 200 μL de ácido ascórbico de 0,5 M en PBS a 99 mL CMMo de medios de cultivo (véase el paso 1.1 para la composición de los medios de cultivo CMMo).<ol>
<li>Una vez que las culturas BMSCs (BMC total del paso 4.3) o adherente BMSCs paso 5.6 son confluentes, diferenciarlos en osteoblastos cambiando los medios de cultivo para los medios de diferenciación osteoblástica.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sustituir los medios de diferenciación cada otro día. Las células comienzan a producir nódulos blancos de mineralización. Visualizar con el ojo desnudo en el fondo del pozo; Este proceso puede ocurrir en unos pocos días a 3 semanas.<ol>
<li>Para evaluar osteoblastogenesis, realizar tinción de fosfatasa alcalina o Von Kossa tinción en los pozos como se describe en la sección 8. Nota: Cambiar los medios de comunicación cuidadosamente inclinando las placas formando un ligero ángulo con el fin de evitar la interrupción de la monocapa celular.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocitos
	<ol>
<li>Hacer los medios base adipocito mezclando 90 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) glucosa alta, 10 mL de suero bovino Fetal, 1 mL de penicilina/estreptomicina, 20 mM rosiglitazona de 100 μl y 100 μl de 2 mM de insulina. Si es necesario, guarde este medio a 4 ° C para la semana durante el experimento de diferenciación.</li>
		<li>Hacer los medios de inducción del adipocito mediante la adición de 200 μL de 62,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y 25 μl de dexametasona de 1 m m a 25 mL de medio de Base del adipocito.</li>
		<li>Una vez que las culturas BMSCs (BMC total del paso 4.3) o adherente BMSCs paso 5.6 son confluentes, cambiar los medios de comunicación a medios de inducción del adipocito. Considere este día 0 de la diferenciación.</li>
		<li>Después de 48 h, eliminar los medios de comunicación y actualizar la cultura con los medios de inducción de adipocitos.</li>
		<li>En el día 4, cambie a media base del adipocito. Nota: Las gotitas de lípidos pueden comienzan a aparecer tan pronto como el día 2 o día 4.</li>
		<li>El día 7, se observa que las células acumulan gotas lipídicas máximo y mostrar un fenotipo similar a un adipocito maduro. No de la cultura más allá de este punto, ya que puede causar muerte celular/separación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. diferenciación de HSCs en osteoclastos
<ol><li>Hacer los medios de diferenciación de osteoclastos mediante la adición de 50 μl de 25 μg/mL del Receptor activador de NFKB ligando (RANKL) y 15 μl de 25 μg/mL de macrófago Factor estimulante de Colonia (mCSF) a 25 mL de medio de cultivo CMMo.</li>
	<li>Una vez que el BMC total (desde el paso 4.3) o las células no adherentes (desde el paso 5.2) se unen al pozo, medios de cultivo se puede cambiar a los medios de diferenciación de osteoclastos. Reponer los medios de diferenciación cada otro día.</li>
	<li>Observar los cultivos de osteoclastos diariamente al microscopio con 10 aumentos. Observe que los osteoclastos fusión y forman células multinucleadas, generalmente alrededor del día 5-7 de diferenciación.</li>
</ol>8. coloración
<ol><li>
Osteoblastos Nota: Para tinción de fosfatasa alcalina (AP), a menudo uso un AP tinción kit (véase Tabla de materiales) según las directrices.<ol>
<li>Realizar tinción de AP, siguiendo las instrucciones del fabricante del kit.<ol>
<li>Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células con PBS. Fijar las células con 4% paraformaldehido (PFA) en PBS durante 12 minutos a temperatura ambiente.</li>
			<li>Mientras tanto, que la solución de AP utilizando los reactivos del kit de tinción por agregar 500 μl de AP nitrito de sodio en solución alcalina FRV 500 μl y mezclar suavemente; dejar reposar 2 minutos añadir 22,5 mL dH2O y 500 μl naftol AS-BI alcalina. Mezclar suavemente. PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.</li>
			<li>Una vez que las células están fijadas, lavar con PBS y agregar solución de AP en cada pocillo (1 a 2 mL por pozo). Cubrir con papel aluminio y dejar manchas durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz. Aspirar la solución, lavar con agua destilada y deje que la plancha secar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquisición de imágenes de colonias teñidas utilizando una cámara para observar las células positivas de la fosfatasa alcalina.</li>
		<li>También puede realizar Von Kossa en vez de tinción de fosfatasa alcalina. Para ello, lavar los pocillos con agua destilada como cualquier PBS restante precipita con nitrato de plata.
		<ol>
<li>Fijar las células con 4% PFA en PBS durante 12 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue suficiente solución nitrato de plata al 5% para cubrir el pozo y exponer a la luz fuerte por 1 h a temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Retirar la solución de nitrato de plata y lavar cada pocillo con agua destilada. Añadir solución de tiosulfato de sodio 5% a las células y dejar reposar 3 minutos.</li>
		<li>Aspire el tiosulfato de sodio y lave con agua destilada. Deje la placa de secar y observar el yacimiento teñido en marrón oscuro/negro con ojo desnudo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocitos
	<ol>
<li>Para la tinción de aceite rojo O (ORO), fijar las células con 10% neutro tamponado con formol por 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Mientras tanto, hacen de la solución de Stock de ORO disolviendo 0,035 g en 10 mL de isopropanol. Esto es suficiente para una placa de 6 pozos. Mezclar y pasar la solución utilizando un papel de filtro (tamaño 11 μm de poro).</li>
		<li>Hacer la solución de ORO por diluir en 9 mL de solución stock de ORO con 6 mL de agua destilada. Dejar la solución en un rockero hasta que esté listo para su uso.</li>
		<li>Preparar isopropanol al 60% en agua destilada (hacer lo necesario para cubrir cada una bien).</li>
		<li>Una vez que se fijan las células, eliminar el fijador y lavadora una vez con agua destilada. Reemplace el agua con la solución de isopropanol 60% durante 1 minuto. Nota: Añadir líquido lentamente mientras que la placa; adipocitos expulse muy fácilmente.</li>
		<li>Retire el isopropanol y agregar suficiente solución de ORO para cubrir todas las celdas. Incubar por 15 min en un eje de balancín de baja velocidad a temperatura ambiente. ORO de quitar y lavar dos veces con agua destilada. Nota: en este punto, gotitas de lípidos teñidos de ORO pueden visualizarse bajo el microscopio.</li>
		<li>Para cuantificar el ORO, desmanchar el ORO mediante la adición de 1 mL de isopropanol al 100% a cada pocillo y meciendo lentamente durante 10 minutos.</li>
		<li>Mientras tanto, preparar una serie de diluciones para crear una curva estándar basada en las siguientes 8 normas con solución de ORO (2.100 μg/mL) y isopropanol como diluyente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 y 0 μg/mL.</li>
		<li>200 μL de los estándares y las muestras destained en triplicado en una placa de carga y leer la absorbancia a 490 nm.<ol>
<li>Determinar la concentración de ORO para cada muestra partiendo de la curva estándar. Nota: Se recomienda normalizar la concentración de ORO al número de celular. Número de células puede cuantificarse por la tinción de cristal violeta o la cantidad de ADN.</li>
		</ol>
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	<li>
Osteoclastos Nota: Cuando esté listo, le sugerimos osteoclastos de la tinción para fosfatasa de ácido tartrato resistente (TRAP) mediante la tinción de la trampa del kit (véase Tabla de materiales).<ol>
<li>En la trampa de tinción, fijar células durante 30 min a temperatura ambiente con glutaraldehído al 2.5% en PBS. Mientras tanto, hacer la solución trampa mezclando 50 μl de solución de Base de granates Fast, 50 μl de nitrito de sodio, 4,55 mL de agua destilada, 50 μl de solución de tartrato de 100 μl, 200 μL de solución de acetato de y de Napthol AS-bifosfato.</li>
		<li>Aspire de fijador y lavar las células con PBS dos veces antes de añadir la solución trampa durante 1 h a 37 ° C.</li>
		<li>Lavar con agua destilada antes de contar los osteoclastos bajo el microscopio (10 X de magnificación). Las células de la trampa+ aparecen púrpuras con 3 o más núcleos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

Los autores revelan que no tienen ningún conflicto financiero de intereses.

En este artículo, se presentan dos métodos de cultura de BMSCs con sus ventajas y limitaciones. Aislar las células de la médula ósea es un proceso relativamente fácil. Sin embargo, obtener una población celular representativa de las células madre mesenquimales o progenitores osteoclástica puede ser difícil debido al diverso ambiente celular de la cavidad de la médula.
Cultivo de la totalidad de los contenidos de la médula ósea proporciona una representación cercana del microambie...

Primarias BMSCs murinos se utilizan como un modelo en vitro de las células madre mesenquimales desde su descubrimiento en el temprano de años 19801. De hecho, cultivos de células de plástico adherente lavadas de la cavidad de la médula ósea de los huesos largos mantienen la capacidad de diferenciarse en osteoblastos, osteoclastos, condrocitos o adipocitos en muchos estudios2,3, 4 , 5. sin embargo, la médula ósea es un tejido único compuesto de muchos diferentes poblaciones celulares incluyendo pero no limitado a, BMSCs, HSCs, células endoteliales e inmunes. Así, el aislamiento y técnicas de cultivo pueden producir poblaciones celulares con diferentes homogeneidad. Utilizando estas técnicas para probar el potencial de diferenciación de las células puede ser difícil. Por ejemplo, al comparar las células de los ratones con diferentes genotipos, a partir de una población celular mixta limita la interpretación de los datos. Por el contrario, obtención de poblaciones homogéneas de BMSCs y HSCs puede ser técnicamente difícil y no pueden estar como representante de un modelo ex vivo .
En nuestro laboratorio, estamos principalmente interesados en la utilización de BMSCs debido a su potencial para diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y osteoclastos. Aquí, presentamos las técnicas de aislamiento BMSCs y HSCs y cultura para evaluar osteoblastogenesis o adipogénesis en vitro, así como culturas de HSCs que se diferencian en osteoclastos. Un método utiliza una población mixta de células de médula ósea (BMC) que contiene BMSCs y HSCs directamente convenientes para la adipogénesis, osteoblastogenesis y osteoclastogénesis (llamado Total BMC). Este método es una representación ex vivo más cercana de la heterogeneidad entre las células del microambiente de la médula ósea. Otro método separa adherente de las células no adherentes en un intento de poblaciones "más puros" cultura de BMSCs y HSCs (llamadas BMSCs adherente). El método más adelante permite la cultura de célula experimentos para iniciar con un número más exacto de BMSCs o HSCs y reduce la posibilidad de efectos indirectos complejos de otras poblaciones de células que permanecen en la cultura. Ambos métodos han sido previamente publicados y utilizado para abordar la investigación preguntas6,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>200&amp;mu;L pipet tips&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Silver Nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&amp;alpha;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerol phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer inverter microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Células estromales de la médula ósea (BMSCs) constituyen una población celular que se utilizan habitualmente como una representación de las células madre mesenquimales in vitro. Residen dentro de la cavidad de la médula junto con las células madre hematopoyéticas (HSCs), que puede dar lugar a células de sangre rojas, progenitores inmunes y osteoclastos. Por lo tanto, extracciones de poblaciones celulares de los resultados de la médula ósea en una mezcla muy heterogénea de distintas poblaciones de la célula, que puede presentar desafíos en diseño experimental y confundir la interpretación de los datos. Varios aislamiento y técnicas de cultivo se han desarrollado en los laboratorios para obtener poblaciones más o menos homogéneas de BMSCs y HSCs invitro. Aquí, presentamos dos métodos para el aislamiento de BMSCs y HSCs de huesos largos de ratón: un método que produce una población mixta de BMSCs y HSCs y un método que intenta separar las poblaciones dos celulares basan en la adherencia. Ambos métodos proporcionan las células convenientes para osteogénico y diferenciación adipogenic experimentos ensayos así como funcionales.

Resumen de las culturas de célula Las técnicas de dos cultivo permiten la evaluación de la diferenciación en una población mixta de BMC de BMSCs y HSCs (BMC Total, figura 1A) o en una población de BMSCs separó de HSCs (BMSCs adherente, figura 1B). 48 horas después de que las células de la médula están aisladas y plateado (figura 1), que rápidamente en las partes inferi...

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K vistas.  Maine Medical Center Research Institute. En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Video: Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Inmunología e Infección

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Biología

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Optimización del aislamiento de células estromales del timo y la médula ósea

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autor destacado: Avance de la investigación hematopoyética mediante el aislamiento de células estromales para la secuenciación de células individuales

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

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La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata