Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di utilizzo presso il Maine Medical Center Research Institute e istituzionali Animal Care.
1. la raccolta di tubi preparazione
<ol><li>Rendere i terreni di coltura BMSC completando α Medium essenziale minimo (MEM α) con 10% siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Posto 100 µ l di terreno di coltura BMSC in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. 3 ossa solitamente si adattano in una singola provetta così prepararsi di conseguenza.</li>
	<li>Tagliare le estremità di 200 µ l puntali per abbastanza così che si inseriscono le provette da centrifuga. Inserire le punte all'interno dei tubi e accertarsi che i coperchi possono chiudere prima di posizionare i tubi sul ghiaccio. Nota: In alternativa, microcentrifuga 0,75 mL con il taglio di estremità può essere inserito nel tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
</ol>2. raccolta delle ossa da topi
<ol><li>Eutanasia degli animali usando CO2 seguita da dislocazione cervicale e spruzzateli con etanolo al 70%. Nota: Assicurarsi che gli animali da stesso sesso e, preferibilmente, della stessa età sono usati. Utilizziamo abitualmente animali di età 7-8 settimane. Si consiglia di pool di cellule da almeno 3 animali per gruppi sperimentali per produrre una popolazione di cellule rappresentative e riproducibile migliore.</li>
	<li>
Posizionare il mouse eutanasizzato sulla sua schiena su una tavola di dissezione. Utilizzare pinze per creare una tenda di pelle sull'addome. Praticare una piccola incisione (1 cm circa) utilizzando forbici per dissezione sterili. Stacchi la pelle verso gli arti e i piedi dal taglio al fine di esporre la parte inferiore dell'addome e le gambe.
	<ol>
<li>Tagliare sotto la caviglia giunto a rimuovere il piede. Tagliare lungo la cresta iliaca dell'anca per separare la testa del femore dalla pelvi. Mentre il mouse è ancora sulla sua schiena, fare un'incisione al centro la pelvi per separare le due ossa iliache.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando salviette privo di lanugine, rimuovere con cautela il muscolo da femori, delle tibie e ossa iliache. Nota: Il taglio tanto di tendini e muscolo dall'osso come possibile rende la pulizia più veloce e più facile con le salviettine pelucchi (ad es., kimwipes). Prestare attenzione quando si manipolano le ossa come essi tendono a rompersi facilmente e la loro fragilità può essere aumentato con determinati genotipi.</li>
	<li>Una volta che tutti i campioni sono stati sezionati, metterli in PBS su ghiaccio e spostare in una cappa di coltura sterile per i passaggi rimanenti di isolamento. Nota: Lavorando in modo asettico per quanto possibile ridurrà il potenziale di contaminazione nelle culture.</li>
	<li>Fare piccoli tagli (circa 1-2 mm) a entrambe le estremità prossimale e distale delle ossa prima della loro immissione nelle punte sezionate all'interno dei tubi di centrifuga. Nota: Assicurarsi di tagliare una quantità sufficiente in modo che midollo possa essere centrifugato fuori; Tuttavia, si deve prestare attenzione per evitare di tagliare troppo, come le popolazioni delle cellule tendono a variare basata sulla vicinanza all'interno dello spazio del midollo.</li>
	<li>Centrifuga a 10.000 x g per 15 s a temperatura ambiente. Assicurarsi che il midollo è svuotato e pellettato nella parte inferiore del tubo da 1,5 mL, mentre le ossa sono all'interno degli inserti (entrambi 200 µ l dispensare suggerimento o 0,75 mL tubo del microcentrifuge). Una volta raccolti tutti il midollo, rimuovere gli inserti con le ossa dai tubi di raccolta. Nota: Se il midollo viene svuotato, le ossa apparirà bianche. Tuttavia, se midollo rimane in determinate ossa, riprovare le estremità di taglio e centrifugare.</li>
</ol>3. sospensione cellulare
<ol><li>Utilizzando un ago 25 G, tirare la cella pellet su e giù lentamente per spezzare ciuffi e combinare tutti i campioni in un tubo conico di soli 15ml. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura di BMSC su 500 µ l di campioni.</li>
	<li>Inserire un filtro di 70 µm sulla cima di una provetta conica da 50 mL e passare la sospensione cellulare attraverso questo filtro per rimuovere i frammenti di osso possibile.</li>
</ol>4. placcatura e la cultura di popolazioni miste di cellule del midollo osseo (Totale BMCs)
Nota: Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2.
<ol><li>Calcolare il numero di cellule e impiattatelo a 1,0 x 106 cellule/cm2 in terreni di coltura. Consentire 72h di coltura mista per le celle da collegare. Nota: Si consiglia di diluire il 20x di sospensione cellulare in terreni di coltura e diluire nuovamente in trypan blu prima di contare le celle utilizzando un emocitometro. Per topi C57Bl6/J maschi 7-settimana-vecchio, cediamo ordinariamente un numero di cellulare di circa 50 x 106 cellule ma età, sesso e ceppo può influire cella numero notevolmente. Nota: Una popolazione di miscela delle cellule dovrebbe allegare bene nella parte inferiore della cultura.</li>
	<li>Dopo 72 h, rimuovere il supporto e sostituirlo con mezzi freschi. Proseguire cambiando i media ogni altro giorno e cerca confluency. Quando le cellule raggiungono confluency di 80-100%, sono pronti per la differenziazione. Nota: Perché questa cultura si mescola con BMSCs sia HSCs, può essere direttamente utilizzato per osteoblastogenesis, adipogenesis come pure osteoclastogenesi.</li>
</ol>5. placcatura e la cultura della popolazione Split di BMSCs (aderente BMSCs)
Nota: Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2.
<ol><li>Piastra di tutte le celle raccolte dai femori, delle tibie e ossa iliache di un topo in una piastra di coltura di 10 cm (55 cm2 di zona della coltura). Nota: Quando il pool 2-3 i topi C57BL/6J, abbiamo in genere piastra questa popolazione 'totale' del midollo osseo in un pallone da2 di 150 cm.</li>
	<li>Dopo 48 h di coltura mista, rimuovere il supporto di cultura (contenente le HSCs non aderente). Se osteoclastogenesi esperimenti devono essere eseguiti, impostare questa popolazione di cellule non aderenti a parte (Vedi sezione 7), in caso contrario, aspirare e scartare queste cellule.</li>
	<li>Lavare la piastra/boccetta con PBS con attenzione per non disturbare le cellule allegate.</li>
	<li>Rimuovere PBS e sollevare le cellule aggiungendo 0.25% tripsina e incubare a 37 ° C per un minimo di 1-3 estigue la tripsina aggiungendo cell supporti per la sospensione delle cellule. A questo punto, BMSC, che ora vengono sollevati, che può essere contato (come precedentemente fatto nel punto 4.1) e placcato per futuri esperimenti.</li>
	<li>Calcolare il numero di cellule necessarie per la placcatura. Centrifugare il volume richiesto di sospensione cellulare a 1.000 x g per 5 min a temperatura ambiente. Nota: Le cellule sono placcate tipicamente basato su esperimenti di end-point. Ad esempio, se proteina/RNA deve essere isolato abbiamo piastra in genere a una maggiore densità (~1.0-2.0 x 106 cellule/pozzetto in piastre da 6).</li>
	<li>Rimuovere il supporto e risospendere il pellet cellulare del volume di media cultura necessaria per la placcatura. Le cellule in coltura secondo gli esperimenti del piatto e consentire loro di fissare per un paio di giorni. Quando le BMSC raggiunge la confluenza, procedere per eseguire la differenziazione.</li>
</ol>6. differenziazione delle BMSCs
<ol><li>
Osteoblasti
	<ol>
<li>Fai media differenziazione degli osteoblasti aggiungendo 800 µ l di 1 M β-glicerolo fosfato in PBS e 200 µ l di acido ascorbico 0,5 M in PBS a 99 mL di terreno di coltura BMSC (Vedi punto 1.1 per la composizione dei terreni di coltura BMSC).<ol>
<li>Una volta confluenti BMSCs culture (Totale BMCs dal punto 4.3) o aderente BMSCs dal punto 5.6, li differenziano in osteoblasti commutando i terreni di coltura ai media di differenziazione degli osteoblasti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sostituire il supporto di differenziazione ogni altro giorno. Le cellule iniziano a produrre noduli bianchi di mineralizzazione. Visualizzarli con l'occhio nudo sul fondo del pozzo; Questo processo può verificarsi entro pochi giorni a 3 settimane.<ol>
<li>Al fine di valutare osteoblastogenesis, eseguire colorazione della fosfatasi alcalina e/o Von Kossa colorazione sui pozzi come descritto nella sezione 8. Nota: Cambiare il supporto attentamente inclinando le piastre con una leggera angolazione per evitare turbative di strato monomolecolare della cellula.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipociti
	<ol>
<li>Fai del adipocyte base media mescolando insieme 90 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) alto glucosio, 10 mL di siero fetale bovino, 1 mL di penicillina/streptomicina, 100 µ l 20 mM Rosiglitazone e 100 µ l di 2 mM dell'insulina. Se necessario, è possibile memorizzare questo media a 4 ° C per tutta la settimana durante l'esperimento di differenziazione.</li>
		<li>Fanno del adipocyte induzione media con l'aggiunta di 200 µ l di 62,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) e 25 µ l di 1 mM desametasone a 25 mL di Adipocyte Base Media.</li>
		<li>Una volta confluenti BMSCs culture (Totale BMCs dal punto 4.3) o aderente BMSCs dal punto 5.6, cambiare il supporto ai media di induzione del adipocyte. Considera questo giorno 0 di differenziazione.</li>
		<li>Dopo 48 h, è necessario rimuovere il supporto e aggiornare la cultura con i media di induzione del adipocyte.</li>
		<li>Il giorno 4, passare alla media base degli adipociti. Nota: Le goccioline del lipido possono iniziano ad apparire più presto giorno 2 o 4 giorni.</li>
		<li>Il giorno 7, osservare che le cellule hanno accumulato le goccioline del lipido massimo e visualizzano un fenotipo simile a un adipocita maturo. Cultura non oltre questo punto, che possono causare morte cellulare/distacco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. differenziazione di HSCs in osteoclasti
<ol><li>Rendere Media differenziazione degli osteoclasti aggiungendo 50 µ l di 25 µ g/mL di recettore attivatore di NFKB Ligand (RANKL) e 15 µ l di 25 µ g/mL di macrophage Colony Stimulating Factor (mCSF) a 25 mL di terreno di coltura di BMSC.</li>
	<li>Una volta che il BMC totale (dal punto 4.3) o le cellule non-aderenti (dal punto 5.2) sono attaccate al pozzo, terreni di coltura può essere commutato a Media differenziazione degli osteoclasti. Ricostituire la media di differenziazione ogni altro giorno.</li>
	<li>Osservare le culture degli osteoclasti ogni giorno con un microscopio a ingrandimento 10x. Osservare che gli osteoclasti fondono e formano cellule multinucleate, tipicamente intorno a 5-7 ° giorno di differenziazione.</li>
</ol>8. colorazione
<ol><li>
Osteoblasti Nota: Per la colorazione della fosfatasi alcalina (AP), abbiamo spesso utilizzare una macchiatura AP kit (Vedi Tabella materiali) secondo le linee guida.<ol>
<li>Eseguire AP macchiatura seguendo le linee guida del produttore di kit.<ol>
<li>Media di aspirare e lavare le cellule con PBS. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 12 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Nel frattempo, rendono la soluzione AP utilizzando i reagenti da AP kit di colorazione aggiungendo 500 µ l nitrito di sodio in 500 µ l di soluzione alcalina FRV e mescolando delicatamente; Lasciate riposare per 2 min. aggiungere 22,5 mL dH2O e 500 µ l naftolo AS-BI alcalina. Mescolare delicatamente. Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.</li>
			<li>Una volta che le cellule sono fissi, risciacquare con PBS e aggiungere soluzione AP ad ogni pozzetto (1-2 mL per pozzetto). Coprire con foglio di alluminio e lasciate che la macchia per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Aspirare la soluzione, lavare con acqua distillata e fate asciugare la piastra.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisire immagini delle colonie macchiati usando una macchina fotografica al fine di osservare le cellule positive della fosfatasi alcalina.</li>
		<li>In alternativa è possibile eseguire Von Kossa invece di macchiatura della fosfatasi alcalina. Per questo, pozzi di lavare accuratamente con acqua distillata come qualsiasi restante PBS precipiterà con nitrato d'argento.
		<ol>
<li>Fissare le cellule con 4% PFA in PBS per 12 min a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere la soluzione di nitrato d'argento abbastanza 5% per coprire il pozzo ed esporre alla luce forte per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di nitrato d'argento e sciacquare ogni pozzetto con acqua distillata. Aggiungere la soluzione di tiosolfato di sodio 5% alle cellule e lasciate riposare per 3 minuti.</li>
		<li>Il tiosolfato di sodio di aspirare e lavare con acqua distillata. Lasciate la piastra asciugare e osservare il deposito minerale colorato in marrone scuro/nero con occhio nudo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipociti
	<ol>
<li>Per la colorazione di olio rosso O (ORO), fissare le cellule con 10% neutra tamponata formalina per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Nel frattempo, rendono la soluzione di Stock di ORO sciogliendo 0,035 g in 10 mL di isopropanolo. Questo è sufficiente per una piastra a 6 pozzetti. Mescolare e filtrare la soluzione utilizzando un filtro di carta (poro taglia 11 µm).</li>
		<li>Rendere la soluzione di lavoro di ORO diluendo 9 mL di soluzione di riserva di ORO con 6 mL di acqua distillata. Lasciare la soluzione su un agitatore meccanico fino a che pronto per l'uso.</li>
		<li>Preparare 60% isopropanolo in acqua distillata (fare abbastanza per coprire ogni bene).</li>
		<li>Una volta che le cellule sono fissi, rimuovere una volta fissativa e lavare con acqua distillata. Sostituire l'acqua con la soluzione di isopropanolo 60% per 1 min. Nota: Aggiungere il liquido lentamente mentre le mance la piastra; adipociti sloggiare molto facilmente.</li>
		<li>Rimuovere l'isopropanolo e aggiungere la soluzione di lavoro abbastanza ORO per coprire tutte le celle. Incubare per 15 minuti su un rocker di bassa velocità a temperatura ambiente. ORO di rimuovere e lavare due volte con acqua distillata. Nota: A questo punto, le goccioline del lipido tinto ORO possono essere visualizzate sotto il microscopio.</li>
		<li>Per quantificare i ORO, decolorare l'ORO aggiungendo 1 mL di isopropanolo 100% ad ogni pozzetto e da dondolo lentamente per 10 min.</li>
		<li>Nel frattempo, preparare una serie di diluizioni per creare una curva standard basata sui seguenti 8 standard utilizzando la soluzione di lavoro di ORO (2.100 µ g/mL) e isopropanolo come diluente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 e 0 µ g/mL.</li>
		<li>Caricare 200 µ l di standard e i campioni destained in triplici copie su un piatto e leggere l'assorbanza a 490 nm.<ol>
<li>Determinare la concentrazione di ORO per ogni campione basato sulla curva standard. Nota: Si consiglia di normalizzare la concentrazione di ORO al numero di cellulare. Numero di cellulare può essere quantificato di cristalvioletto macchiatura o quantità del DNA.</li>
		</ol>
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	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclasti Nota: Quando si è pronti, si consiglia di macchiatura osteoclasti per tartrato-resistente acido fosfatasi (trappola) usando la macchiatura trappola kit (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Per trappola macchiatura, Difficoltà cellule per 30 min a temperatura ambiente con 2,5% glutaraldeide in PBS. Nel frattempo, fare la soluzione di trappola mescolando insieme 50 µ l di soluzione di Base Fast granati, 50 µ l di nitrito di sodio, 4,55 mL di acqua distillata, 50 µ l di Napthol AS-Biphosphate, 200 µ l di soluzione di acetato e 100 µ l di soluzione di tartrato.</li>
		<li>Aspirate fuori fissativo e sciacquare le cellule con PBS due volte prima di aggiungere la soluzione di trappola per 1h a 37 ° C.</li>
		<li>Lavare con acqua distillata prima di contare gli osteoclasti al microscopio (ingrandimento 10x). Le cellule di trappola+ compaiono viola con 3 o più nuclei.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

Gli autori divulgare che non hanno nessuna finanziaria conflitto di interessi.

In questo articolo, sono disponibili due metodi di coltura di BMSC con i loro vantaggi e limitazioni. Isolamento di cellule provenienti dal midollo osseo è un processo relativamente semplice. Tuttavia, ottenere una popolazione di cellule rappresentativa della cellule staminali mesenchimali o progenitori osteoclastic può essere difficile a causa di vario ambiente cellulare della cavità del midollo.
La totalità del contenuto del midollo osseo la coltura fornisce una rappresentazione stretta ...

BMSCs murino primario sono comunemente usati come modello in vitro di cellule staminali mesenchimali fin dalla loro scoperta nel primi anni 19801. Infatti, colture di cellule di plastica-aderente svuotate dalla cavità del midollo osseo delle ossa lunghe mantengono la capacità di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti, condrociti o adipociti in molti studi2,3, 4 , 5. Tuttavia, il midollo osseo è un tessuto unico composto di molte popolazioni differenti delle cellule, tra cui, ma non limitato a, BMSC, HSCs, cellule endoteliali ed immuni. Così, isolamento e tecniche di coltura possono portare a popolazioni di cellule con diverse omogeneità. Utilizzando tali tecniche per testare il potenziale di differenziazione dalle cellule può essere impegnativo. Ad esempio, quando si confrontano le cellule dai topi con genotipi differenti, a partire con una popolazione di cellule miste limita l'interpretazione dei dati. Al contrario, ottenere popolazioni omogenee di BMSC e HSCs può essere tecnicamente difficile e potrebbe non essere più rappresentativo di un modello ex vivo .
Nel nostro laboratorio, siamo principalmente interessati nell'utilizzazione di BMSCs a causa del loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti e adipociti. Qui, presentiamo tecniche di isolamento BMSCs e HSCs e impostazioni cultura utilizzate per valutare osteoblastogenesis o adipogenesis in vitro, così come le culture di HSCs per differenziarsi in osteoclasti. Un metodo utilizza una popolazione mista di cellule del midollo osseo (BMC) contenente BMSCs e HSCs direttamente adatto per adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chiamato BMCs totale). Questo metodo è una rappresentazione più vicina ex vivo dell'eterogeneità tra le cellule del microambiente midollare. Un altro metodo separa aderente da cellule non aderenti nel tentativo di popolazioni "pure" coltura di BMSC e HSC (chiamato aderente BMSCs). Il metodo successivo consente la coltura delle cellule esperimenti per iniziare con un numero più preciso di BMSCs o HSCs e riduce il potenziale di effetti complessi indiretti di altre popolazioni di cellule che rimangono nella cultura. Entrambi i metodi sono stati precedentemente pubblicati e utilizzati per indirizzo ricerca diverse domande6,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>200&amp;mu;L pipet tips&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Silver Nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&amp;alpha;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerol phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer inverter microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Cellule stromali del midollo osseo (BMSC) costituiscono una popolazione di cellule ordinariamente utilizzata come rappresentazione delle cellule staminali mesenchimali in vitro. Essi risiedono all'interno della cavità del midollo osseo al fianco di cellule staminali ematopoietiche (HSCs), che possono dare origine a globuli rossi, dei progenitori immuni e gli osteoclasti. Così, le estrazioni delle popolazioni delle cellule dai risultati del midollo osseo in un mix eterogeneo di varie popolazioni di cellule, che possono presentare sfide nel disegno sperimentale e confondere l'interpretazione dei dati. Diversi di isolamento e tecniche di coltura sono state sviluppate nei laboratori al fine di ottenere popolazioni più o meno omogenee di BMSC e HSCs invitro. Qui, presentiamo due metodi per l'isolamento di BMSC e HSCs da ossa lunghe del mouse: un metodo che produce una popolazione mista di BMSC e HSCs e un metodo che tenta di separare le due popolazioni di cellule basato su aderenza. Entrambi i metodi forniscono adatto per le cellule osteogeniche e adipogenico differenziazione esperimenti saggi anche come funzionali.

Panoramica delle colture cellulari Le tecniche di due cultura permettono la valutazione di differenziazione su una popolazione mista di BMCs composto da BMSC e HSC (BMCs totale, Figura 1A) o di una popolazione di BMSCs diviso da HSC (BMSCs aderente, Figura 1B). 48 ore dopo che le cellule dal midollo sono isolate e placcato (Figura 1), essi rapidamente fissare alla parte inferiore ...

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K Views.  Maine Medical Center Research Institute. In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

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Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Immunologia e infezioni

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Biologia

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Ottimizzazione dell'isolamento delle cellule stromali dal timo e dal midollo osseo

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca ematopoietica utilizzando l'isolamento delle cellule stromali per il sequenziamento di singole cellule

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Riepilogo

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La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

L'analisi fenotipica e l'isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto