Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (R01 AR061164-01A1) destek verdi.

Tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Maine Tıp Merkezi Araştırma Enstitüsü tarafından kabul edildi.
1. toplama hazırlık tüpler
<ol><li>BMSC kültür ortamı en az gerekli orta α (MEM α) ilave %10 Fetal sığır Serum ve penisilin/streptomisin % 1'i aç.</li>
	<li>BMSC kültür ortamının 100 µL 1.5 mL microcentrifuge tüplerde yerleştirin. 3 kemik genellikle bir tek tüp hazır olun buna göre uygun olacaktır.</li>
	<li>Santrifüj tüplerde tam 200 µL pipet ipuçları yeterince uçlarını kesmek. Tüpler içinde ipuçları eklemek ve kapakları tüpler buza yerleştirmeden önce kapatabilirsiniz emin olun. Not: Alternatif olarak, 0.75 mL microcentrifuge tüpler biter kesim ile 1.5 mL microcentrifuge tüp içine eklenir.</li>
</ol>2. hasat farelerin kemiklerinden
<ol><li>Servikal çıkığı tarafından takip CO2 kullanarak hayvanlar ötenazi ve onları % 70 etanol ile sprey. Not: aynı cinsiyetten ve tercihen aynı yaşta hayvanlardan kullanıldığından emin olun. 7-8 hafta yaşlı hayvanlar düzenli olarak kullanın. Biz daha iyi bir temsilcisi ve tekrarlanabilir hücre nüfus verim için deneysel grupları başına en az 3 hayvanlar hücrelerden havuzu oluşturma öneririz.</li>
	<li>
Parçalanmış bir tahta üzerinde sırtında euthanized fareyi getirin. Forseps karnına bir çadır cilt oluşturmak için kullanın. Steril diseksiyon makası kullanarak küçük bir insizyon attım (yaklaşık 1 cm) olun. Geri alt karın ve bacak göstermek bacaklarda ve kesme metreden doğru cilt soyma.
	<ol>
<li>Ayak bileği ayak kaldırmak için ortak kesti. Femur başı kalça ayırmak için kalça, iliyak tepe kesin. Fare hala sırtında olmakla birlikte, iki İliak kemik ayırmak için kalça ortasında bir kesi yapmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hav bırakmayan mendil kullanarak, dikkatli bir şekilde kas uyluk, yırtılmalarıteşhis ve İliak kemik çıkarın. Not: daha fazla tendon ve kas kemik üzerinden daha hızlı ve daha kolay hav bırakmayan mendil (örneğin, kimwipes) ile temizlik mümkün kılan kesme. Kemikler gibi onlar çabuk pes eğilimindedir ve onların kırılganlık belirli genotip ile artırılabilir işlenirken dikkatli olun.</li>
	<li>Bir kez tüm örnekleri disseke, PBS buz üzerinde yer onları ve steril kültür kukuIeta yalıtım kalan adımları için hareket. Not: mümkün olduğunca aseptik çalışma kültürlerde bulaşma olasılığını azaltacaktır.</li>
	<li>Küçük kesim (yaklaşık 1-2 mm) her iki proksimal ve distal ucunda kemikleri kesitli ipuçları santrifüj tüpler içinde bunları yerleştirmeden önce yapmak. Not: kemik iliği dışarı centrifuged yeterli miktarda kesmek için emin olun; Ancak, bakım önlemek için alınması gereken hücre popülasyonlarının değişir eğilimi olarak çok fazla kesme iliği alanı içinde yakınlık dayalı.</li>
	<li>10.000 x g, santrifüj 15 s, oda sıcaklığında. Tüm iliği temizlendi ve kemikleri ekler (ya da 200 µL damlalıklı ipucu veya 0.75 mL microcentrifuge tüp) içinde iken 1,5 mL tüp alt kısmında pelleted sağlamak. Bir kez tüm iliği toplanır, kemikleri ile ekler koleksiyon tüpler kaldırın. Not: tüm iliği aktarılmadan, kemikleri beyaz görünür. Ancak, bazı kemik iliği devam ederse, kesme biter yeniden deneyin ve santrifüj kapasitesi.</li>
</ol>3. hücre süspansiyon
<ol><li>25 G iğne, çekme kullanarak hücreyi yukarı ve aşağı yavaş yavaş kümeleri kadar kırmak ve tüm örneklerini tek 15 mL konik tüp içine birleştirmek için unsurlardandır. 10 mL BMSC kültür medya örnekleri 500 µL başına ekleyin.</li>
	<li>70 µm filtre 50 mL konik tüp üzerine yerleştirin ve hücre süspansiyon olası kemik parçaları kaldırmak için bu filtreden geçmek.</li>
</ol>4. kaplama ve karışık nüfus (Toplam BMCs) kemik iliği hücrelerinin kültürü
Not: Bir kuluçka %5 CO237 ° C'de hücreler kültürlü.
<ol><li>Hücre sayısını hesaplamak ve onları 1.0 x kültür medya 106 hücreler/cm2 ' de plakası. 72 h karma kültür hücreler eklemek için izin verir. Not: Hücre süspansiyon 20 x kültür medya ve tekrar trypan bir hemasitometre kullanarak hücre sayım daha önce mavi sulandrarak sulandrarak önerilir. İçin 7-hafta-yaşlı erkek C57Bl6/J fareler, biz düzenli olarak6 hücre hücre sayısı 50 x 10 civarında verim ama yaş, cinsiyet ve zorlanma cep numarası büyük ölçüde etkileyebilir. Not: Mix nüfus hücre kültürü dibinde de eklemek gerekir.</li>
	<li>Sonra 72 h, medyayı çıkarın ve taze medya ile değiştirin. Da medyayı değiştirerek her gün ve onay için confluency devam edin. Hücrelerin % 80-100 confluency ulaştığınızda, farklılaşma için hazırlar. Not: Bu kültür BMSCs ve HSCs ile karışık çünkü, bu doğrudan osteoblastogenesis, adipogenesis gibi osteoclastogenesis için kullanılabilir.</li>
</ol>5. kaplama ve kültür BMSCs (yapisan BMSCs) Split nüfusun
Not: Bir kuluçka %5 CO237 ° C'de hücreler kültürlü.
<ol><li>Kalça, yırtılmalarıteşhis ve bir fare İliak kemik 10 cm kültür amacına (55 cm2 kültür alanının) toplanan tüm hücreleri plaka. Not: 2-3 C57BL/6J fareler havuzu oluşturma zaman, genellikle bu 'Toplam' kemik iliği nüfus 150 cm2 şişe içinde plaka.</li>
	<li>Karma kültür 48 saat sonra (sigara yapışık HSCs içeren) kültür medyayı çıkarın. Eğer osteoclastogenesis deneyler yapılması için bu nüfus yapışık olmayan hücreleri bir kenara (bkz. Bölüm 7), belki de, aspiratı ayarla ve bu hücreleri atın.</li>
	<li>Dikkatle ekli hücreleri bozmamaya olarak PBS ile plaka/şişeye yıka.</li>
	<li>PBS kaldırmak ve % 0.25 tripsin ekleyerek ve hücre süspansiyon hücre medya ekleyerek 1-3 dk. sertleştirme tripsin 37 ° C'de kuluçka hücreleri kaldırın. Bu noktada, BMSCs, şimdi kalkar, (daha önce bitmiş içinde adım 4.1 olarak) sayılır ve gelecekteki deneyler için kaplama.</li>
	<li>Kaplama için gerekli hücrelerin sayısını hesaplayın. Hücre süspansiyon 1000 x g oda sıcaklığında 5 min için de gerekli hacmi santrifüj kapasitesi. Not: Hücreleri genellikle üzerinde son nokta deney dayalı kaplama. Protein/RNA izole olmak istiyorsa, biz genellikle plaka-yüksek yoğunluklu (~1.0-2.0 x 106 hücreler/iyi ' 6-şey plaka).</li>
	<li>Medyayı çıkarın ve hücre Pelet kültür kaplama için gerekli ortam hacmine resuspend. Kültür medya deneyler göre hücrelerde plaka ve onları bir kaç günlüğüne takmak izin verir. BMSCs confluency ulaştığınızda, farklılaşma gerçekleştirmek için devam edin.</li>
</ol>6. BMSCs farklılaşma
<ol><li>
Dokusunu
	<ol>
<li>Osteoblast farklılaşma medya 1 M β-gliserol 800 µL ekleyerek fosfat PBS ve 0,5 M askorbik asit PBS 200 µL 99 mL BMSC kültür ortamının yapın (bkz. Adım 1.1 BMSC kültür ortamı bileşimi için).<ol>
<li>BMSCs kültürler (Adım 4.3 Toplam BMCs) veya yapışık BMSCs adım 5.6 Konfluent olduğunda, bunları dokusunu kültür medya osteoblast farklılaşma medyaya geçiş yaparak ayırt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Farklılaşma ortamı her gün değiştirin. Hücreleri Qafqaz beyaz nodüller oluşturmaya başlamak. Onları çıplak gözle kuyunun dibindeki görselleştirmek; Bu işlem için 3 hafta birkaç gün içinde ortaya çıkabilir.<ol>
<li>Osteoblastogenesis değerlendirmek için alkalen fosfataz boyama ve/veya Von Kossa 8 bölümünde açıklandığı gibi kuyu üzerinde boyama gerçekleştirmek. Not: medya dikkatle hücre monolayer bozulma önlemek için hafif bir açıyla plakaları eğerek değiştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adiposit
	<ol>
<li>Adipocyte temel medya birlikte 90 mL Dulbecco modifiye kartal orta (DMEM) yüksek glikoz, 10 mL Fetal sığır Serum, 1 mL penisilin/streptomisin, 100 µL 20 mM Rosiglitazone ve 2 mm insülin 100 µL karıştırılarak olun. Gerekirse, farklılaşma deney sırasında hafta için bu medya 4 ° C'de depolayın.</li>
		<li>62,5 mM 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) 200 µL ekleyerek adipocyte indüksiyon medya yapmak ve 1 mm deksametazon Adipocyte Bankası medya 25 ml 25 µL.</li>
		<li>BMSCs kültürler (Adım 4.3 Toplam BMCs) veya yapışık BMSCs adım 5.6 Konfluent olduğunda, medya adipocyte indüksiyon medyaya değiştirin. Bu gün 0 farklılaşma düşünün.</li>
		<li>Sonra 48 h, medyayı çıkarın ve kültür adipocyte indüksiyon medya ile yenileyin.</li>
		<li>Gün 4, adipocyte temel medyaya geçiş. Not: 2 gün veya gün 4 olarak erken görünen Lipid damlacıkları başlayabilirsiniz.</li>
		<li>Günlük 7, hücreleri maksimum lipid damlacıkları birikmiş ve olgun bir adipocyte benzer bir fenotip görüntülemek gözlemlemek. Hücre ölüm/dekolmanı neden olabileceğinden bu noktaya geçmiş kültür değil.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. farklılaşma HSCs Osteoklastlar içine
<ol><li>Osteoklast farklılaşma medya 25 mL BMSC kültür medya 25 µg/mL, reseptör aktivatör ve NFKB Ligand (RANKL) ve 15 µL makrofaj koloni uyarıcı faktör (mCSF) 25 µg/mL 50 µL ekleyerek getirin.</li>
	<li>Toplam BMCs (Kimden adım 4.3) veya yapışık olmayan hücrelerden (Adım 5.2) kuyuya İliştirildikten sonra kültür medya Osteoklast farklılaşma medya için değiştirilebilir. Farklılaşma medya her geçen gün doldurmak.</li>
	<li>Osteoklast kültürler her gün 10 X büyütme, mikroskop altında gözlemlemek. Osteoklastlar sigorta ve genellikle çevresinde gün 5-7 farklılaşma multinucleated hücreleri oluşturur görmekteyiz.</li>
</ol>8. boyama
<ol><li>
Dokusunu Not: alkalin fosfataz (AP), sık sık boyama kullanmak için bir AP boyama kit ( Tablo malzemelerigörmek) yönergelere göre.<ol>
<li>AP boyama seti üreticisinin yönergeleri izleyerek gerçekleştirin.<ol>
<li>Medya Aspire edin ve PBS hücrelerle durulayın. %4 ile hücreleri tamir Paraformaldehyde (PFA) PBS oda sıcaklığında 12 dk için.</li>
			<li>Bu arada, 500 µL ekleyerek kiti boyama AP üzerinden reaktifler kullanarak AP çözüm olun sodyum nitrit 500 µL FRV alkali çözüm ve yavaşça; karıştırma için 2 dk. eklemek 22,5 mL dH2O ve 500 için bekletin µL naftol AS-BI alkalin. Hafifçe karıştırın. Dikkat: PFA toksik ve bakımı ile ele alınması gerekir.</li>
			<li>Hücreleri sabit sonra PBS ile durulayın ve her şey (iyi başına 1-2 mL) AP çözüm ekleyin. Alüminyum folyo ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika izin leke kapak. Çözüm Aspire edin, distile su ile yıkayın ve kurumaya plaka izin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lekeli kolonileri alkalen fosfataz pozitif hücrelerinin incelemek için bir kamera ile görüntü elde etmek.</li>
		<li>Alternatif olarak Von Kossa alkalen fosfataz boyama yerine gerçekleştirin. Kalan herhangi bir PBS. gümüş nitrat ile çökelti olarak bunun için kuyu distile su ile iyice yıkayın
		<ol>
<li>%4 ile hücreleri tamir PFA PBS için oda sıcaklığında 12 dk içinde. O zaman, iyi kapak ve oda sıcaklığında 1 h için güçlü ışığa maruz yeterli %5 gümüş nitrat çözüm ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gümüş nitrat çözümü kaldırmak ve her şey distile su ile durulayın. % 5 sodyum thiosulfate çözüm hücrelere ekleme ve 3 dk. bekletin.</li>
		<li>Sodyum thiosulfate Aspire edin ve distile su ile yıkayın. Kuru ve çıplak gözle koyu kahverengi/siyah lekeli mineral mevduat gözlemlemek tabağı ver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adiposit
	<ol>
<li>Yağ kırmızı O (ORO) boyama için % 10 kullanarak hücreleri tamir tarafsız Formalin oda sıcaklığında 1 h için arabelleğe alınmış.</li>
		<li>Bu arada, ORO hisse senedi çözüm isopropanol 10 ml 0.035 g çözülerek olun. Bu 6-şey plaka için yeterlidir. Karıştırın ve bir filtre kağıdı (gözenek boyutu 11 µm) kullanarak solüsyonu geçirin.</li>
		<li>ORO çalışma çözüm ORO hisse senedi çözüm 9 mL 6 mL distile su ile sulandrarak olun. Çözüm bir rocker üzerinde kullanım için hazır kadar bırakın.</li>
		<li>% 60 isopropanol distile su içinde hazırlamak (her örtecek kadar yapmak iyi).</li>
		<li>Hücreleri sabit kez sabitleştirici ve yıkama bir kez distile su ile çıkarın. Suyun % 60 isopropanol çözüm 1 dk. için değiştirin. Not: sıvı yavaş plaka devrilme ekleyin; adiposit çıkarmak çok kolay.</li>
		<li>İsopropanol kaldırın ve yeterli ORO çalışan hücrelerin tümünü kapsayacak şekilde bir çözüm ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında bir düşük hızlı rocker üzerinde kuluçkaya. ORO kaldırmak ve iki kez distile su ile yıkayın. Not: Bu noktada, ORO lekeli lipid damlacıkları mikroskop altında görüntülenmeyecektir.</li>
		<li>ORO ölçmek için ORO için her şey % 100 isopropanol 1 mL ekleyerek ve yavaş yavaş 10 dakikadır sallanan tarafından destain.</li>
		<li>Bu arada, ORO çalışma çözüm kullanarak aşağıdaki 8 standartlarını temel standart bir eğri oluşturmak için bir seyreltme serisi hazırlayın (2100 µg/mL) ve isopropanol bir eritici olarak: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 ve 0 µg/mL.</li>
		<li>Standartları ve triplicates bir plaka üzerinde destained örneklerinde 200 µL yük ve 490 Absorbans okumak nm.<ol>
<li>ORO konsantrasyonu standart eğri dayalı her örnek için belirlemek. Not: Cep numarası için konsantrasyon ORO normalize önerilir. Cep numarasını kristal violet boyama veya DNA miktar sayısal.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoklastlar Not: hazır olduğunuzda, Osteoklastlar tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) tuzak boyama kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek) kiti için boyama öneririz.<ol>
<li>Boyama tuzak için hücreler, oda sıcaklığında 30 dk için PBS % 2.5 oxazolidin ile düzeltmek. Bu arada, tuzak çözüm birlikte karıştırılarak 50 µL hızlı Garnet Bankası çözüm, sodyum nitrit, 4.55 mL distile su, Napthol AS-Biphosphate, asetat çözüm 200 µL ve 100 µL tartarat çözüm 50 µL 50 µL olun.</li>
		<li>Sabitleştirici Aspire edin ve iki kez 37 ° C'de 1 h için tuzak çözüm eklemeden önce PBS hücrelerle durulama</li>
		<li>Osteoklastlar (10 X büyütme) mikroskopla sayma önce distile su ile yıkayın. TUZAK+ hücreler 3 veya daha fazla hücre çekirdeği ile mor görünür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

Yazarlar onlar hiçbir mali çatışması var ifşa.

Bu makalede, iki yöntem BMSCs kültürünün avantaj ve sınırlamaları ile sunulmaktadır. Kemik iliği geliyor hücreleri izole nispeten kolay bir işlemdir. Ancak, bir hücre nüfus Mezenkimal Kök hücre veya mediatörlerin ataları temsilci alma iliği kavite çeşitli hücresel ortamı nedeniyle zor olabilir.
Kemik iliği içeriğinin tamamını kültür içinde vivo microenvironment yakın bir gösterimini sağlar. Henüz hücreleri farelerin (genotip, tedaviler, yaş, vb...

Birincil fare BMSCs onların keşif erken 1980'lerde1beri Mezenkimal Kök hücre vitro modeli olarak yaygın olarak kullanılır. Nitekim, dokusunu, Osteoklastlar, kondrosit veya adiposit birçok çalışmalar2,3, içine ayrıştırılan kapasitesi uzun kemiklerde kemik iliği boşluğundan temizlenen plastik-yapışık hücreleri kültürleri korumak 4 , 5. ancak, kemik iliği benzersiz bir doku, ancak bunlarla sınırlı olmamak, BMSCs, HSCs, endotel ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere birçok farklı hücre popülasyonlarının modülüdür. Bu nedenle, yalıtım ve kültürü teknikleri farklı homojenliği ile hücre popülasyonlarının yol açabilir. Hücrelerden ayırt etme potansiyel test etmek için bu tür teknikler kullanarak zor olabilir. Örneğin, farklı genotip ile fareler hücrelerden karşılaştırırken, karma hücre nüfusuyla başlayan verilerin yorumlanması sınırlar. Tersine, BMSCs ve HSCs homojen nüfus alma ve teknik olarak zor olabilir gibi temsilcisi olmayabilir bir ex vivo modelinin.
Bizim laboratuvar biz öncelikle BMSCs kullanımı nedeniyle dokusunu, Osteoklastlar ve adiposit ayrıştırılan potansiyellerini ilgilendi. Burada, BMSCs ve HSCs yalıtım ve osteoblastogenesis veya adipogenesis vitrodeğerlendirmek için kullanılan kültür teknikleri, hem de HSCs Osteoklastlar ayırt etmek için kültürleri mevcut. Bir yöntem BMSCs ve HSCs adipogenesis, osteoblastogenesis ve osteoclastogenesis (Toplam BMCs denir) için doğrudan uygun içeren nüfus kemik iliği hücre (BMCs) kullanır. Bu yöntem bir kemik iliği microenvironment hücreleri arasında bulunan heterojenite daha yakın ex vivo gösterimidir. Başka bir yöntem bir girişim kültürü "saf" nüfus BMSCs ve HSCs (yapışık BMSCs denir) yapışık yapışık olmayan hücrelerden ayırır. Yöntemi daha sonra hücre kültürü BMSCs veya HSCs daha doğru bir sayı ile başlamak için deneyler ve kültüründe kalır diğer hücre popülasyonlarının karmaşık dolaylı etkilerinden olasılığını azaltır sağlar. Her iki yöntem daha önce yayınlanan ve farklı araştırma soruları6,7,8,9gidermek için kullanılan.

<table><tbody><tr><td>200&amp;mu;L pipet tips&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Silver Nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&amp;alpha;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerol phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer inverter microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Kemik iliği stromal hücreler (BMSCs) teşkil Mezenkimal Kök hücre bir temsili rutin olarak kullanılan bir hücre nüfus tüp bebek. Hematopoetik kök kırmızı kan hücreleri, bağışıklık ataları ve Osteoklastlar çıkmasına neden olabilir hücre (HSCs), yanında kemik iliği kavite içinde bulundukları. Böylece, çekimi hücre popülasyonlarının sorunlar deneysel tasarım mevcut ve veri yorumu yıkmak çeşitli hücre popülasyonlarının çok heterojen karışımı içinde kemik iliği sonuçlarından biri. Birkaç yalıtım ve kültür yöntemleri laboratuvarlarda BMSCs ve HSCs invitroaz ya da homojen nüfus elde etmek için geliştirilmiştir. Burada, BMSCs ve HSCs izolasyonu fare uzun kemikler için iki yöntem mevcut: BMSCs ve HSCs karışık bir nüfusa verimleri bir yönteme ve iki hücre popülasyonlarının ayırmak için çalışır bir yöntem göre bağlılık üzerinde. Her iki yöntem hücreler için uygun sağlamak Osteojenik ve Adipojenik farklılaşma denemeleri de fonksiyonel deneyleri.

Hücre kültürleri genel bakış İki kültürü teknikleri değerlendirme farklılaşma BMCs BMSCs ve HSCs (Toplam BMCs, şekil 1A) oluşan karışık bir nüfus veya BMSCs nüfusu HSCs (yapışık BMSCs, şekil 1B) bölünmüş izin. 48 saatlik etap iliği hücrelerinden izole edilmiştir ve kaplama (şekil 1 c) sonra onlar hızla plastik kültür plaka altına ekleyin ve bir m...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice at JoVE.com

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K Görüntüleme.  Maine Medical Center Research Institute. Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Video: Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Gelişim Biyolojisi

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Biyoloji

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Timus ve Kemik İliğinden Stromal Hücre İzolasyonunun Optimize Edilmesi

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Dizilimi için Stromal Hücre İzolasyonu Kullanarak Hematopoietik Araştırmaları İlerletmek

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma