이 작품은 건강의 국가 학회 (R01 AR061164-01A1)에 의해 지원 되었다.

모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 메인 의료 센터 연구소에 의해 승인 되었다.
1. 컬렉션 튜브 준비
<ol><li>10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스의 최소 필수 매체 α (MEM α)을 보완 하 여 BMSC 문화 미디어를 확인 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에 BMSC 문화 미디어의 100 µ L를 배치 합니다. 3 뼈 보통 단일 튜브 그래서 그에 따라 준비 하나에 적합할 것 이다.</li>
	<li>그들은 원심 분리기 튜브에 들어가도록 충분히 200 µ L 피 펫 팁의 끝을 잘라. 튜브 내부 팁 넣고 뚜껑 얼음에 튜브를 배치 하기 전에 닫을 수 있도록 합니다. 참고: 또는, 0.75 mL microcentrifuge 튜브 끝 잘라 삽입할 수 있습니다 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에.</li>
</ol>2입니다. 쥐에서 뼈의 수확
<ol><li>CO2 뒤에 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 동물을 안락사 하 고 70% 에탄올으로 그들을 살포. 주: 동물 같은 섹스 그리고 가급적 이면 같은 나이에서 사용 하는 확인 하십시오. 우리는 정기적으로 동물 세 7 ~ 8 주를 사용 합니다. 더 나은 대표 및 재현성 세포 인구를 실험 그룹 당 적어도 3 동물에서 세포를 풀링 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>
해 보드에 그것의 뒤에 안락사 마우스를 놓습니다. 집게를 사용 하 여 복 부에 피부의 텐트를 만들. 살 균 해가 위를 사용 하 여 작은 절 개 (약 1cm)을 확인 합니다. 더 낮은 복 부와 다리를 노출 하려면 다시 사지와 컷에서 발 피부 껍질.
	<ol>
<li>잘라 발목 아래 발 제거 공동. hipbone에서 대 퇴 골 머리를 분리 하는 엉덩이에 장 골의 크레스트 따라 자릅니다. 그것의 뒤에 아직도 마우스를 실행 하는 동안 2 개의 장 골 뼈 분리 hipbone 중간 절 개를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>보풀이 물티슈를 사용 하 여 조심 스럽게 화관, tibias, 장 골 뼈에서 근육을 제거. 참고: 절단 힘 줄과 뼈에서 근육의 가능한 게로 보풀 잎사귀 (예, kimwipes)와 함께 쉽고 빠르게 청소. 그들은 쉽게 휴식 하는 경향이 하 고 그들의 취약성 특정 genotypes 증가 될 수 있습니다 뼈를 조작 하는 때 주의 사용 합니다.</li>
	<li>일단 모든 샘플 해 부 되는, 얼음에 PBS에 넣어 고 절연의 나머지 단계에 대 한 살 균 문화 후드로 이동. 참고: aseptically 가능한 작업 문화에 오염에 대 한 가능성을 줄일 것입니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 내에서 sectioned 팁에 그들을 배치 하기 전에 뼈의 인접 하 고 원심 끝에 작은 상처 (약 1 ~ 2 m m)를 확인 합니다. 주: 골 수; centrifuged 수 있도록 충분 한 금액을 확인 그러나, 주의가 피하기 위해 골 수 공간에 근접에 따라 너무 많은 절단 세포 인구 변화 하는 경향이.</li>
	<li>15에 대 한 10000 x g에서 원심 분리기 실 온에서 s. 확인 한 모든 골 수는 플러시 1.5 mL 튜브의 하단에 삽입 (중 200 µ L 피펫으로 팁 또는 0.75 mL microcentrifuge 튜브) 안에 뼈는 일지도. 일단 모든 골 수 수집 컬렉션 튜브에서 뼈와 함께 삽입을 제거 합니다. 참고: 모든 골 수 플러시 뼈 나타납니다 흰색. 그러나, 골 수는 특정 뼈에 남아, 경우 절단 끝을 다시 시도 하 고 원심.</li>
</ol>3. 세포 현 탁 액
<ol><li>25g 바늘, 풀을 사용 하 여 셀 쥐 똥를 위아래로 천천히 대단히 짧은 시간을 휴식과 단일 15 mL 원뿔 튜브로 모든 샘플을 결합. 샘플의 500 µ L 당 BMSC 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>70 µ m 필터 50 mL 원뿔 튜브 위에 놓고 가능한 뼈 조각을 제거 세포 현 탁 액이이 필터를 통해 전달 합니다.</li>
</ol>4. 도금의 골 수 세포 (전체 Bmc)의 혼합된 인구와 문화
참고: 셀은 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된
<ol><li>셀의 수를 계산 하 고 x 106 셀/cm2 문화 미디어에서 1.0에서 접시. 연결할 셀에 대 한 혼합 문화의 72 h를 허용 합니다. 참고: 문화 미디어에 세포 현 탁 액 20 배 고 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하기 전에에서 다시 diluting diluting 것이 좋습니다. 7 주 된 남성 C57Bl6/J 쥐에 대 한 우리 정기적으로6 셀 약 50 x 10의 셀 번호를 생성 하지만 나이, 성별, 및 스트레인 수 영향을 셀 수 크게. 참고: 셀의 혼합 인구 연결 해야 문화의 하단에 잘 합니다.</li>
	<li>72 h 후 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어와 함께 그것을 대체 합니다. 계속 변화 하는 미디어 모든 다른 하루 confluency 확인 합니다. 셀 confluency 80-100%에 도달, 그들은 차별화에 대 한 준비가 되었습니다. 참고:이 문화 BMSCs와 HSCs, 혼합 때문에 그것은 사용할 수 있습니다 직접 osteoblastogenesis, 지질으로 osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. 도금의 BMSCs (부착 BMSCs)의 분할 인구와 문화
참고: 셀은 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된
<ol><li>10 cm 문화 요리 (55 c m2 의 문화 영역)으로 화관, tibias, 그리고 한 마우스의 장 골 뼈에서 수집 하는 모든 셀 접시 참고: 2-3 C57BL/6J 마우스를 풀링할 때 우리가 일반적으로 접시 150 c m2 플라스 크에서이 '총' 골 인구.</li>
	<li>혼합 문화 48 h 후 (비-부착 HSCs 포함) 문화 미디어를 제거 합니다. Osteoclastogenesis 실험을 수행할 수 있다면, 비 부착 한 세포 제쳐두고 (섹션 7 참조), 하지 않을 경우, aspirate이이 인구를 설정 하 고 이러한 셀을 삭제.</li>
	<li>연결 된 셀을 방해 하지로 신중 하 게 PBS 가진 접시/플라스 크를 씻으십시오.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 추가 0.25 %trypsin 및 세포 현 탁 액을 셀 미디어를 추가 하 여 1-3 분 끄다는 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 리프트. 이 시점에서, BMSCs, 지금 해제, 될 수 있는 (로 이전에 완료 단계 4.1) 미래 실험을 위한 도금.</li>
	<li>도금에 필요한 셀의 수를 계산 합니다. 필요한 양의 세포 현 탁 액 상 온에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 참고: 셀은 일반적으로 도금 끝점 실험에 따라. 예를 들어 단백질/RNA 격리 되어야 하는 경우 우리가 일반적으로 격판덮개 높은 밀도 (~1.0-2.0 x 106 셀/잘 6 잘 플레이트).</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 도금에 필요한 문화 미디어의 볼륨에서 셀 펠 릿 resuspend. 실험에 따르면 문화 미디어에 셀 접시 하 고 몇 일 동안 연결할 수 있도록. BMSCs confluency에 도달, 수행 차별화를 진행 합니다.</li>
</ol>6입니다. BMSCs의 차별화
<ol><li>
Osteoblasts
	<ol>
<li>게 osteoblast 차별화 미디어 1 M β-글리세롤의 800 µ L을 추가 하 여 인산 염 PBS에 PBS에 의약품 0.5 M의 200 µ L BMSC 문화 미디어의 99 mL (BMSC 문화 미디어의 구성에 대 한 단계 1.1 참조).<ol>
<li>BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 osteoblast 차별화 미디어 문화 미디어를 전환 하 여 그들을 osteoblasts로 차별화.</li>
		</ol>
</li>
		<li>매일 차별화 미디어를 교체 합니다. 셀 강화 작용의 백색 혹 생산 시작. 우물의 바닥에 맨 눈으로 그들을 시각화합니다 이 과정은 3 주 몇 일 이내에 발생할 수 있습니다.<ol>
<li>Osteoblastogenesis 평가, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 또는 폰 Kossa 섹션 8에에서 설명 된 대로 우물에 얼룩을 수행 합니다. 참고: 셀 단층의 파괴를 피하기 위해 약간의 각도에 접시를 기울이기에 의해 신중 하 게 미디어를 변경 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 높은 포도 당, 소 태아 혈 청, 페니실린/스의 1 mL, 100 µ L 20 mM Rosiglitazone 2mm 인슐린의 100 µ L의 10ml의 90 mL을 함께 혼합 하 여 체형 기본 미디어를 확인 합니다. 필요한 경우 차별화 실험 기간 동안 주 4 ° C에이 미디어를 저장 합니다.</li>
		<li>62.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 200 µ L을 추가 하 여 체형 유도 미디어 만들기와 체형 베이스 미디어의 25 ml 1 m m Dexamethasone의 25 µ L.</li>
		<li>BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 체형 유도 미디어를 미디어를 변경 합니다. 차별화의이 오늘을 0를 고려 하십시오.</li>
		<li>48 h 후 미디어를 제거 하 고 체형 유도 미디어 문화를 새로 고칩니다.</li>
		<li>4 일에 체형 기본 미디어로 전환. 참고: 지질 방울 주 2 또는 4 일 일찍 나타나는 것을 시작할 수 있습니다.</li>
		<li>7 일 셀 최대 지질 방울 축적 및 성숙한 체형과 유사한 표현 형을 표시를 준수 합니다. 그것은 세포 죽음/분리를 발생할 수 있습니다이 시점 과거 문화 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7입니다. Osteoclasts에 HSCs의 차별화
<ol><li>Osteoclast 차별화 미디어 25 ml BMSC 문화 미디어의 25 µ g/mL의 수용 체 활성의 NFKB Ligand (RANKL)와 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (mCSF)의 25 µ g/mL의 15 µ L의 50 µ L을 추가 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>일단 총 Bmc (4.3 단계)에서 나는 비 부착 한 세포 (5.2 단계)에서 우물에 연결 된, 문화 미디어 Osteoclast 차별화 미디어를 전환할 수 있습니다. 차별화 미디어 매일 보충.</li>
	<li>Osteoclast 문화에서 10 배 확대 현미경 매일 관찰 합니다. Osteoclasts 퓨즈와 차별화의 5-7 일의 주위에 일반적으로 multinucleated 세포 형성을 관찰 합니다.</li>
</ol>8. 얼룩
<ol><li>
Osteoblasts 참고: 사용 하는 우리는 종종 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 얼룩 얼룩 하는 AP 키트 ( 재료의 표참조) 지침에 따라.<ol>
<li>AP 얼룩 키트 제조 업체의 지침에 따라 수행 합니다.<ol>
<li>미디어를 발음 하 고 PBS로 세포를 씻어. 4% 셀 수정 Paraformaldehyde (PFA) 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에.</li>
			<li>한편, AP 500 µ L을 추가 하 여 키트를 얼룩이 지기에서 시 약을 사용 하 여 AP 솔루션을 만들어 500 µ L FRV 알카라인 솔루션을 부드럽게; 혼합 나트륨 아 질산염 하자 2 분 추가 22.5 mL dH2O와 500 µ L Naphthol AS BI 알칼리 성. 부드럽게 혼합. 주의: PFA 독성 이며 관리와 처리 해야 합니다.</li>
			<li>일단 셀 고정, PBS로 씻어 고 각 잘 (우물 당 1 ~ 2 mL)을 AP 솔루션을 추가 합니다. 커버 알루미늄 호 일 및 빛에서 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 하자 얼룩. 솔루션을 발음 하 고, 증류수로 씻어 접시 건조를 허용.</li>
		</ol>
</li>
		<li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 긍정적인 세포를 관찰 하기 위해 카메라를 사용 하 여 스테인드 식민지의 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 대신 폰 Kossa 수행 합니다. 이 위해, 모든 나머지 PBS로 증류수로 깨끗이 세척 웰 스 실버 질산염. 와 침전 것입니다.
		<ol>
<li>4% 셀 수정 PFA 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에. 그런 다음 충분 한 5% 실버 질산염 솔루션 잘 커버 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 강한 빛에 노출에 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실버 질산염 솔루션을 제거 하 고 증류수로 각 잘 린스. 셀에 5% 나트륨 thiosulfate 솔루션을 추가 하 고 3 분 서 보자.</li>
		<li>나트륨 thiosulfate 발음 하 고 증류수로 씻어. 접시 건조 미네랄 예금에서 맨 눈으로 어두운 갈색/검은색 얼룩이 관찰 하자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>기름 빨간 O (오로) 얼룩이 지기에 대 한 10%를 사용 하 여 셀 수정 중립 버퍼링 말린 실 온에서 1 h.</li>
		<li>한편, 0.035 g 소 프로 파 놀의 10 mL에 용 해 하 여 오로 재고 솔루션을 확인 합니다. 이것은 6 잘 플레이트에 대 한 충분 한입니다. 혼합 하 고 하나의 필터 종이 (기 공 크기 11 µ m)를 사용 하 여 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>6 mL 증류수의과 오로 재고 솔루션의 9 mL를 diluting 하 여 오로 작업 솔루션을 확인 합니다. 사용할 준비까지 로커에 솔루션을 둡니다.</li>
		<li>증류수에 60% 소 프로 파 놀 준비 (각을 커버 하기에 충분 하 게 잘).</li>
		<li>셀 고정, 증류수와 통 및 세척 한 번 제거. 1 분 60% 소 프로 파 놀 솔루션에 물을 바꿉니다. 참고: 추가 팁 접시; 하는 동안 액체도 천천히 adipocytes 매우 쉽게 분리 하십시오.</li>
		<li>소 프로 파 놀을 제거 하 고 모든 세포를 충당 하기 위해 충분 한 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 실 온에서 저속 로커에 15 분 동안 품 어. 오로 제거 하 고 증류수로 두 번 세척. 참고:이 시점에서 오로 얼룩진 지질 방울 수 구상 될 현미경.</li>
		<li>오로 계량, 각 음을 100% 소 프로 파 놀의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 천천히 흔들어는 오로 destain.</li>
		<li>한편, 오로 작업 솔루션을 사용 하 여 다음 8 표준에 따라 표준 곡선을 만드는 희석 시리즈를 준비 (2100 µ g/mL)와 소 프로 파 놀은 희석제로: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75, 및 0 µ g/mL.</li>
		<li>표준과 접시에 triplicates에서 destained 샘플의 200 µ L을 로드 하 고 490에서 흡 광도 읽고 nm.<ol>
<li>표준 곡선에 따라 각 샘플에 대 한 오로의 농도 결정 합니다. 참고: 셀 수 오로 농도 정상화 것이 좋습니다. 휴대폰 번호 크리스탈 바이올렛 얼룩 또는 DNA 양을 측정할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclasts 참고: 경우 준비, 좋습니다 osteoclasts 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 트랩 얼룩을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩.<ol>
<li>트랩 얼룩, PBS에 2.5%도 함께 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 수정. 한편, 함께 빠른 가닛 기반 솔루션의 50 µ L, 나트륨 아 질산염, 증류수의 4.55 mL, Napthol AS Biphosphate 아세테이트 솔루션의 200 µ L, 100 µ L 주석산 솔루션의 50 µ L의 50 µ L를 혼합 하 여 트랩 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>정착 액에서 aspirate 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 트랩 솔루션을 추가 하기 전에 두 번 PBS 가진 세포를 씻어</li>
		<li>Osteoclasts 현미경 (10 배 확대) 아래를 계산 하기 전에 증류수로 세척. 트랩+ 셀 3 개 이상의 핵을 보라색 나타납니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

저자 들은 관심사의 재정적인 충돌 공개.

이 문서에서는, BMSCs의 문화의 두 가지 방법은 자신의 장점과 한계 표시 됩니다. 세포는 골 수에서 오는 격리 상대적으로 어려움 없이 과정 이다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포 또는 osteoclastic 창시자의 대표적인 세포 인구를 얻기 때문에 골 수 구멍의 다양 한 세포 환경 전하실 수 있습니다.
골 수 내용의 전체를 경작 vivo에서 microenvironment의 가까운 표현을 제공 합니다. 그러...

기본 murine BMSCs1초기 1980 년대 있는 그들의 발견부터 중간 엽 줄기 세포의 생체 외에서 모델으로 일반적으로 사용 됩니다. 긴 뼈의 골 수 구멍에서 플러시 플라스틱 부착 한 세포의 문화 osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, 또는 많은 연구2,3, adipocytes에 분화 될 수 있는 능력을 유지 하는 사실, 4 , 그러나 5., 골 수는 독특한 조직 HSCs, 내 피, 그리고 면역 세포 포함 하 되이 국한 되지 않음, BMSCs, 하지만 많은 다른 세포 인구의 구성. 따라서, 고립과 문화 기술을 다른 동질성과 세포 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 기술을 사용 하 여 셀에서 잠재적인 차별화 테스트 전하실 수 있습니다. 예를 들어 다른 genotypes와 쥐에서 셀을 비교할 때 데이터의 해석을 제한 혼합된 세포 인구로 시작 합니다. 반대로, BMSCs 및 HSCs의 균질 성 인구 기술적으로 어려울 수 있습니다 고로 대표 되지 않을 수 있습니다 ex vivo 모델의.
우리의 실험실에서 우리는 주로 BMSCs osteoblasts, osteoclasts, adipocytes에 분화 될 그들의 잠재력 활용에 관심이. 여기, 우리가 osteoclasts에 차별화를 HSCs의 문화 뿐만 아니라 BMSCs와 HSCs 격리와 문화 osteoblastogenesis 또는 지질에서 생체 외에서평가 하는 데 사용의 기법 제시. 한 가지 방법은 BMSCs 및 HSCs 지질, osteoblastogenesis, 및 osteoclastogenesis (총 Bmc 라고 함)에 대 한 직접 적합 한 골 수 세포 (Bmc)의 혼합된 인구를 사용 합니다. 이 방법은 골 microenvironment의 세포 사이 발견이 성분의 가까이 비보 전 표현입니다. 또 다른 방법은 BMSCs (점착 BMSCs 라는) HSCs의 문화 "순수한" 인구 하려고 비 부착 한 세포에서 점착을 구분 합니다. 이후 방법은 세포 배양 실험의 BMSCs 또는 HSCs의 더 정확한 숫자와 함께 시작 하 고 문화에 남아 있는 다른 세포 인구의 복잡 한 간접 효과의 가능성을 줄일 수 있습니다. 두 방법 모두는 이전 출판 되었고 다른 연구 질문6,7,,89를 해결 하는 데 사용.

<table><tbody><tr><td>200&amp;mu;L pipet tips&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Silver Nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&amp;alpha;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerol phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer inverter microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

중간 엽 줄기 세포의 표현으로 일상적으로 사용 되는 세포 인구를 구성 하는 골 수 기질 세포 (BMSCs) 생체 외에서. 그들은 캐비티 내에 골 수 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 적혈구, 면역 창시자, 및 osteoclasts 증가 줄 수 있는 함께 상주 합니다. 따라서, 다양 한 세포 인구, 실험 설계 과제를 제시 하 고 데이터 해석을 혼동 수 있는 매우 다른 유형의 혼합에 골 결과에서 세포 인구의 기사. 여러 격리 및 문화 기술 BMSCs 및 HSCs invitro의 더 많거나 적은 균질 인구를 얻기 위하여 실험실에서 개발 되었습니다. 여기, 우리가 마우스 긴 뼈에서 BMSCs 및 HSCs의 격리에 대 한 두 가지 방법을 제시: 부착을 기반으로 BMSCs 및 HSCs의 혼합된 인구를 생성 한 방법 및 두 세포 인구를 분리 하는 한 방법. 두 방법 모두 제공 세포 적합 osteogenic 및 adipogenic 분화 실험 뿐만 아니라 기능적 분석 실험.

세포 배양의 개요 두 문화 기술 BMSCs 및 HSCs (총 Bmc, 그림 1A)로 구성 된 Bmc의 혼합된 인구 또는 BMSCs의 인구에 차별화의 평가 HSCs (부착 BMSCs, 그림 1B)에서 분리 수 있습니다. 48 시간 후에 골 수에서 세포 격리 및 도금 (그림 1C), 그들은 신속 하 게 플라스틱 문화 접시의 바닥에 연결 고는 단층을 ?...

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K 조회수.  Maine Medical Center Research Institute. 이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

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Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

연구

발생학

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

면역학 및 감염병학

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

생물학

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

흉선과 골수에서 기질 세포 분리 최적화

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

저자 스포트라이트: 단일 세포 염기서열 분석을 위한 기질 세포 분리를 사용한 조혈 연구 발전

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

요약

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마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

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마우스 골수에서 파골 세포의 유도

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화