Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (AR061164-01A1 R01).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso para o Maine Medical Center Research Institute e institucional Cuidado Animal.
1. coleção tubos de preparação
<ol><li>Fazer os meios de cultura BMSC, completando meio essencial mínimo α (α MEM) com 10% de soro Fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Coloque 100 µ l de BMSC de meios de cultura em tubos de 1,5 mL microcentrifuge. 3 ossos geralmente vão caber em um único tubo então preparar conformemente.</li>
	<li>Corte as extremidades das pontas de pipetas da 200 µ l de suficiente para que eles se encaixam em tubos de centrífuga. Insira as pontas dentro dos tubos e certifique-se de que as tampas podem fechar antes de colocar os tubos no gelo. Nota: Como alternativa, tubos de microcentrifuga 0,75 mL com o corte de pontas podem ser inseridos no tubo microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
</ol>2. colheita de ossos de ratos
<ol><li>Eutanásia em animais usando CO2 , seguido por deslocamento cervical e pulverizá-los com etanol a 70%. Nota: Certifique-se que são utilizados animais de mesmo sexo e, de preferência, da mesma idade. Rotineiramente usamos animais com idades entre 7 a 8 semanas. Recomendamos que o pool de células pelo menos 3 animais por grupos experimentais para produzir uma população de células representativas e reprodutíveis a melhor.</li>
	<li>
Coloque o mouse euthanized em suas costas num tabuleiro de dissecação. Use fórceps para criar uma tenda de pele no abdômen. Faça uma pequena incisão (cerca de 1 cm) com uma tesoura estéril de dissecação. Descasca a pele para os membros e os pés do corte para expor a parte inferior do abdome e as pernas.
	<ol>
<li>Corte abaixo do tornozelo conjunta para remover o pé. Corte ao longo da crista ilíaca no quadril para separar a cabeça do fêmur do osso ilíaco. Enquanto o mouse está ainda em suas costas, fazer uma incisão no meio do osso ilíaco para separar os dois ossos ilíacos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando lenços fiapos, cuidadosamente remova o músculo os fêmures, tíbias e ossos ilíacos. Nota: Corte o máximo dos tendões e músculos do osso como torna possível a limpeza mais rápida e mais fácil com as toalhitas de fiapos (por exemplo, kimwipes). Tenha cuidado ao manipular os ossos como eles tendem a quebrar facilmente e sua fragilidade pode ser aumentada com determinados genótipos.</li>
	<li>Uma vez que todas as amostras têm sido dissecadas, colocá-los em PBS no gelo e mover-se para uma capa de cultura estéril para as etapas restantes de isolamento. Nota: Trabalhar assepticamente possível reduzirá o potencial de contaminação nas culturas.</li>
	<li>Faça pequenos cortes (cerca de 1 a 2 mm) em ambas as extremidades proximais e distais dos ossos antes de colocá-los em dicas seccionadas dentro dos tubos de centrífuga. Nota: Certifique-se para cortar uma quantidade suficiente para que a medula pode ser centrifugada para fora; no entanto, deve ter cuidado para evitar cortar demais como populações de células tendem a variar com base na proximidade dentro do espaço de medula.</li>
	<li>Centrifugação a 10.000 x g por 15 s à temperatura ambiente. Certifique-se que todo o tutano é liberado e peletizado na parte inferior do tubo de 1,5 mL, enquanto que os ossos estão dentro as inserções (ou 200 µ l pipeta ponta ou 0,75 mL microcentrifuga tubo). Depois de toda a medula é recolhida, remova as inserções com os ossos dos tubos de coleta. Nota: Se é liberada toda a medula, os ossos aparecerá brancos. No entanto, se a medula permanece em certos ossos, tente extremidades de corte novamente e centrifugar.</li>
</ol>3. suspensão
<ol><li>Usando uma agulha 25g, puxe a célula pelotas acima e para baixo lentamente para separar grupos e combinar todas as amostras em um tubo cônico único 15 mL. Adicione 10 mL de meio de cultura BMSC por 500 µ l de amostras.</li>
	<li>Coloque um filtro de 70 µm em cima de um tubo cónico de 50 mL e a suspensão de células atravessam este filtro para retirar fragmentos de osso possível.</li>
</ol>4. chapeamento e cultura das populações mistas de células da medula óssea (BMCs Total)
Nota: As células são cultivadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.
<ol><li>Calcular o número de células e placa-los em 1.0 x 106 células/cm2 em meios de cultura. Permita a 72 h de cultura mista de células anexar. Nota: Recomendamos diluir a suspensão de célula 20 x em meios de cultura e diluir novamente em trypan azul antes de contar as células usando um hemocytometer. Para camundongos C57Bl6/J machos de 7 semanas de idade, nós rotineiramente ceder um número de celular de cerca de 50 x 106 células mas idade, sexo e tensão podem afetar o número de celular grandemente. Nota: Uma população de mistura das pilhas deve anexar na parte inferior da cultura bem.</li>
	<li>Depois de 72 h, remova a mídia e substituí-lo com a nova mídia. Continue mudando os meios de comunicação cada outro dia e verificar se há confluência. Quando as células atingem 80-100% confluência, eles estão prontos para a diferenciação. Nota: Porque esta cultura é misturada com BMSCs e linfócitos, isso pode ser usado diretamente para osteoblastogenesis, adipogenesis, bem como osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. chapeamento e cultura da população de Split de BMSCs (BMSCs aderentes)
Nota: As células são cultivadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.
<ol><li>Placa de todas as células coletadas dos fêmures, tíbias e ilíacos ossos de um rato em um prato de cultura de 10 cm (55 cm2 de área de cultura). Nota: Quando o pool de camundongos C57BL/6J de 2-3, nós tipicamente placa esta população 'total' da medula óssea em um balão de2 a 150 cm.</li>
	<li>Após 48 h de cultura mista, remova a mídia de cultura (que contém o linfócitos não-aderente). Se osteoclastogenesis experiências devem ser executadas, definir esta população de células não-aderente à parte (veja seção 7), se não, aspirado e descartar essas células.</li>
	<li>Lave o placa/frasco com PBS como cuidadosamente para não perturbar as células anexadas.</li>
	<li>Remover o PBS e levantar as células adicionando tripsina 0,25% e incubar a 37 ° C, durante 1-3 min Quench a tripsina adicionando mídia celular à suspensão de células. Neste ponto, o BMSCs, que agora é levantado, que podem ser contado (como feito anteriormente no passo 4.1) e chapeado para experiências futuras.</li>
	<li>Calcule o número de células necessárias para o chapeamento. Centrifugue o volume necessário de suspensão de células a 1.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Nota: As células normalmente são banhadas com base em experiências de ponto de extremidade. Por exemplo, se deve ser isolado da proteína/RNA nós tipicamente chapear em uma densidade mais elevada (~1.0-2.0 x 106 células/poço em placa de 6).</li>
	<li>Remova a mídia e ressuspender as células no volume de meios de cultura necessário para o chapeamento. As células em meios de cultura, de acordo com as experiências da placa e lhes permitem anexar por alguns dias. Quando os BMSCs chegarem a confluência, dirijam-se para realizar a diferenciação.</li>
</ol>6. diferenciação de BMSCs
<ol><li>
Osteoblastos
	<ol>
<li>Faça mídia de diferenciação osteoblástica adicionando 800 µ l de 1m β-glicerol fosfato em PBS e 200 µ l de ácido ascórbico de 0,5 M em PBS a 99 mL de meios de cultura BMSC (consulte a etapa 1.1 para a composição dos meios de cultura a BMSC).<ol>
<li>Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3) ou aderente BMSCs da etapa 5.6 são confluentes, diferenciá-los em osteoblastos alternando-se os meios de cultura para mídia de diferenciação osteoblástica.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Substitua a mídia diferenciação todos os dias. Células começam a produzir nódulos brancos de mineralização. Visualizá-las a olho nu no fundo do poço; Este processo pode ocorrer dentro de alguns dias a 3 semanas.<ol>
<li>Para avaliar osteoblastogenesis, realize a coloração da fosfatase alcalina e/ou Von Kossa coloração sobre os poços, conforme descrito na seção 8. Nota: Altere a mídia cuidadosamente pela inclinação das placas em um ângulo ligeiro para evitar perturbações da monocamada a célula.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipócitos
	<ol>
<li>Faça mídia base adipócito pela mistura de 90 mL de meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) glicose alta, 10ml de soro Fetal bovino, 1 mL de penicilina/estreptomicina, 100 µ l 20mm Rosiglitazona e 100 µ l de 2 mM de insulina. Se necessário, armazene essa mídia a 4 ° C para a semana durante o experimento de diferenciação.</li>
		<li>Faça mídia de indução dos adipócitos adicionando-se 200 µ l de 62,5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) e 25 µ l de 1mm dexametasona a 25 mL de mídia de Base dos adipócitos.</li>
		<li>Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3) ou aderente BMSCs da etapa 5.6 são confluentes, altere os meios de comunicação para mídia de indução dos adipócitos. Considere este dia 0 de diferenciação.</li>
		<li>Após 48 h, remova a mídia e atualizar a cultura com mídia de indução dos adipócitos.</li>
		<li>No dia 4, alterne para a mídia de base dos adipócitos. Nota: Gotículas lipídicas podem começam a aparecer tão cedo quanto dia 2 ou 4 dias.</li>
		<li>No dia 7, observe que as células acumularam gotículas lipídicas máxima e exibir um fenótipo semelhante a dos adipócitos maduros. Não cultura por esse ponto, como pode resultar morte/destacamento de célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. diferenciação dos linfócitos em osteoclastos
<ol><li>Faça Osteoclast diferenciação mídias pela adição de 50 µ l de 25 µ g/mL de Receptor ativador de VHC ligante (RANKL) e 15 µ l de 25 µ g/mL de macrófagos (mCSF) fator estimulante da colônia para 25 mL de meio de cultura BMSC.</li>
	<li>Depois os BMCs totais (da etapa 4.3) ou as células não-aderente (da etapa 5.2) são anexadas ao poço, meios de cultura pode ser alternado para mídia de diferenciação do Osteoclast. Repor os meios de diferenciação todos os dias.</li>
	<li>Observe as culturas osteoclast cada dia sob um microscópio com ampliação de 10x. Observe que osteoclastos se fundem e formam células multinucleadas, tipicamente em torno de 5-7º dia de diferenciação.</li>
</ol>8. coloração
<ol><li>
Osteoblastos Nota: Para a coloração da fosfatase alcalina (AP), que muitas vezes usam uma coloração AP kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com as orientações.<ol>
<li>Execute AP coloração, seguindo as orientações do fabricante do kit.<ol>
<li>Aspirar a mídia e enxágue células com PBS. Consertar as células com 4% paraformaldeído (PFA) em PBS por 12 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Entretanto, fazer a solução de AP usando os reagentes do kit de coloração adicionando 500 µ l do AP nitrito de sódio, solução alcalina-FRV 500 µ l e misturando delicadamente; deixe descansar por 2 min. Adicione 22.5 mL dH2O e 500 µ l naftol AS-BI alcalina. Misture suavemente. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
			<li>Uma vez que as células são fixos, enxaguar com PBS e adicionar solução de AP a cada poço (1 a 2 mL por bem). Cubra com papel alumínio e deixe a mancha por 30 min em temperatura ambiente protegida da luz. Aspirar a solução, lavar com água destilada e deixar a placa secar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquira imagens de colônias manchadas usando uma câmera para observar células positivas de fosfatase alcalina.</li>
		<li>Como alternativa, execute Von Kossa em vez de coloração da fosfatase alcalina. Por isso, poços de lavagem com água destilada como qualquer restantes PBS precipitará com nitrato de prata.
		<ol>
<li>Consertar as células com 4% PFA em PBS por 12 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione o suficiente solução de nitrato de prata 5% para cobrir o poço e expor à luz forte por 1h à temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remova a solução de nitrato de prata e lave cada poço com água destilada. Adicionar a solução de tiossulfato de sódio a 5% para as células e deixar repousar durante 3 min.</li>
		<li>Aspirar o tiossulfato de sódio e lave com água destilada. Deixe a placa secar e observar o depósito mineral corado em marrom escuro/preto com olho nu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipócitos
	<ol>
<li>Para a mancha de óleo vermelho O (ORO), consertar as células usando a 10% neutro tamponado formol por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Entretanto, fazer a solução de estoque ORO pela dissolução de 0,035 g em 10 mL de isopropanol. Isto é suficiente para uma placa de 6. Misturar e transferir a solução usando um filtro de papel (poros tamanho 11 µm).</li>
		<li>Fazer a solução de trabalho de ORO diluindo 9 mL de solução-mãe de ORO com 6 mL de água destilada. Deixe a solução em um roqueiro até que esteja pronto para uso.</li>
		<li>Preparar o isopropanol 60% em água destilada (suficiente para cobrir cada um fazer bem).</li>
		<li>Uma vez que as células são fixos, remova o fixador e lave uma vez com água destilada. Substitua a água com a solução de isopropanol 60% por 1 min. Nota: Adicione o líquido lentamente enquanto derrubando a placa; adipócitos desalojar muito facilmente.</li>
		<li>Remover o isopropanol e adicionar solução de trabalhar bastante ORO para cobrir todas as células. Incube durante 15 min em um balancim de baixa velocidade à temperatura ambiente. Remover ORO e lavar duas vezes com água destilada. Nota: neste ponto, gotículas lipídicas ORO-manchadas podem ser visualizadas sob o microscópio.</li>
		<li>Para quantificar o ORO, destain o ORO, adicionando 1 mL de isopropanol 100% a cada poço e agite-o lentamente por 10 min.</li>
		<li>Entretanto, preparar uma série de diluição para criar uma curva padrão baseada nos seguintes 8 padrões usando solução de trabalho de ORO (2.100 µ g/mL) e isopropanol como diluente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 e 0 µ g/mL.</li>
		<li>Carregar a 200 µ l das normas e as amostras destained em triplica em um prato e ler a absorvância a 490 nm.<ol>
<li>Determine a concentração de ORO para cada amostra com base na curva padrão. Nota: Recomendamos que normalizar a concentração ORO para o celular. Número do celular pode ser quantificado pela coloração violeta cristal ou a quantidade de DNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclastos Nota: Quando estiver pronto, nós sugerimos coloração osteoclastos para kit de resistente ao tartarato ácido fosfatase (armadilha) usando a coloração de armadilha (ver Tabela de materiais).<ol>
<li>Armadilha de coloração, corrigi células por 30 min à temperatura ambiente com glutaraldeído 2,5% em PBS. Entretanto, fazer a solução de armadilha pela mistura de 50 µ l da solução de Base rápido granadas, 50 µ l de nitrito de sódio, 4,55 mL de água destilada, 50 µ l de Napthol AS-Biphosphate, 200 µ l de solução de acetato e solução de tartarato de 100 µ l.</li>
		<li>Aspire o fixador e lave as células com PBS duas vezes antes de adicionar a solução de armadilha para 1 h a 37 ° C.</li>
		<li>Lavar com água destilada antes da contagem de osteoclastos sob um microscópio (ampliação 10x). As células de armadilha+ aparecem roxas com 3 ou mais núcleos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

Os autores divulgar que eles têm não financeiro conflito de interesses.

Neste artigo, apresentam-se dois métodos de cultura de BMSCs com suas vantagens e limitações. Isolar as células provenientes da medula óssea é um processo relativamente fácil. No entanto, a obtenção de uma população de células representativa dos progenitores osteoclástica ou células-tronco mesenquimais pode ser um desafio devido ao ambiente celular diverso da cavidade da medula.
Cultivo a totalidade do conteúdo da medula óssea fornece uma representação perto do microambiente ...

BMSCs murino primárias são comumente usados como um modelo in vitro de células-tronco mesenquimais, desde a sua descoberta no início dos anos 19801. Na verdade, culturas de células de plástico aderente liberadas da cavidade da medula óssea dos ossos longos mantêm a capacidade de ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos, condrócitos ou adipócitos em muitos estudos2,3, 4 , 5. no entanto, a medula óssea é um tecido exclusivo composto de muitas populações de células diferentes, incluindo, mas não limitado a, BMSCs, linfócitos, células endoteliais e imunes. Assim, o isolamento e as técnicas de cultura podem render populações de células com diferente homogeneidade. Usando essas técnicas para testar a potencial de diferenciação de células pode ser um desafio. Por exemplo, ao comparar células de ratos com diferentes genótipos, começando com uma população de célula mista limita a interpretação dos dados. Inversamente, a obtenção de populações homogêneas de BMSCs e linfócitos pode ser tecnicamente difícil e pode não ser tão representativa de um modelo ex vivo .
Em nosso laboratório, nós estamos principalmente interessados na utilização de BMSCs devido ao seu potencial a ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos. Aqui, apresentamos técnicas de isolamento BMSCs e linfócitos e cultura usada para avaliar osteoblastogenesis ou adipogenesis em vitro, assim como culturas de linfócitos de se diferenciarem em osteoclastos. Um método utiliza uma população mista de células da medula óssea (BMCs) contendo BMSCs e linfócitos diretamente apropriados para adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chamado BMCs Total). Este método é uma representação de ex vivo perto da heterogeneidade encontrada entre as células do microambiente da medula óssea. Outro método separa aderente de células não-aderentes na tentativa de populações "puras" de cultura de BMSCs e linfócitos (chamados BMSCs aderente). O método posterior permite a cultura de pilha experimentos para iniciar com um número mais exato de BMSCs ou linfócitos e reduz o potencial de complexos efeitos indiretos de outras populações de células que permanecem na cultura. Ambos os métodos foram previamente publicados e usados para tratar diferentes pesquisas perguntas6,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>200&amp;mu;L pipet tips&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Silver Nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&amp;alpha;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerol phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer inverter microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Células do estroma da medula óssea (BMSCs) constituem uma população de células rotineiramente utilizada como uma representação de células-tronco mesenquimais in vitro. Eles residem dentro da cavidade da medula óssea, ao lado de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), que pode dar origem a células vermelhas do sangue, progenitores imunes e osteoclastos. Assim, extrações de populações de células resultados da medula óssea em uma mistura muito heterogénea de diferentes populações de células, que pode apresentar desafios em delineamento experimental e confundir a interpretação dos dados. Várias técnicas de cultura e isolamento foram desenvolvidas em laboratórios a fim de obter mais ou menos homogêneas populações de BMSCs e linfócitos in vitro. Aqui, apresentamos dois métodos para isolamento de BMSCs e linfócitos de ossos longos de rato: um método que produz uma população mista de BMSCs e linfócitos e um método que tenta separar as populações de duas células com base em aderência. Ambos os métodos fornecem células apropriadas para osteogênico e adipogenic diferenciação dos experimentos de ensaios, bem como funcionais.

Visão geral das culturas de células As técnicas de duas cultura permitem a avaliação da diferenciação em uma população mista de BMCs composto de BMSCs e linfócitos (BMCs Total, figura 1A) ou de uma população de BMSCs separou-se linfócitos (BMSCs aderente, figura 1B). 48 horas depois que as células da medula são isoladas e chapeado (Figura 1), eles rapidamente anexar...

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K visualizações.  Maine Medical Center Research Institute. Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

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Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Biologia do Desenvolvimento

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Imunologia e Infecção

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Biologia

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Otimizando o isolamento de células estromais do timo e da medula óssea

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa hematopoiética usando isolamento de células estromais para sequenciamento de células únicas

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

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Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos