Agradecemos a Paul O'Brien, Marizel Mina y Isabella Freedman para experimentos con animales, Jacquie Gonzalez y Danielle Weiner del NIH/NIAID para ayuda con la irradiación gamma de tejidos de conejo antes de microdisección de captura láser y Jansy Sarathy para manuscrito pensamientos y consejos. Este trabajo fue apoyado por fondos de la cuenta y Melinda Gates Foundation (OPP1174780) y la instrumentación de NIH compartido concesión de 1S10OD018072. Agradecemos a Eliseo A. Eugenin acceso al microscopio Leica LMD 6500 e intercambio de conocimientos y consejos. La compra y apoyo continuo, la 6500 de LMD fue financiado por la subvención del Instituto Nacional de Salud Mental, MH096625, Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular, NS105584, PHRI financiación (E.A.E) y GSK Aportesala (E.A.E).

Todos los estudios animales se llevaron a cabo con arreglo a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud con la aprobación de la atención institucional de Animal y el Comité uso de NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. animales de experimentación y colección de tejido
Esta sección del protocolo describe los procedimientos animales y recolección de muestras en condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL3). Protocolos detallados de la tuberculosis de la micobacteria aerosol infección procedimiento drogas administración y protocolos en conejos han sido describen previamente11,12.
<ol><li>Infectar conejos Nueva Zelanda blanco (machos y hembras a 4-5 meses de edad) con HN878 de M. tuberculosis mediante un sistema de aerosol de la nariz-sólo, como se describió anteriormente11.</li>
	<li>Administrar los medicamentos solicitados (etambutol en el ejemplo presentado aquí) por la vía preferente y eutanasia a los animales en 2, 6 y 24 h después de la administración. En primer lugar, anestesiar al conejo por la inyección intramuscular de ketamina de 35 mg/kg y xilacina en 5 mg/kg. Espere diez minutos y confirmar la correcta anestesia pellizcando la cola y tocar suavemente el ojo. Si no hay reacción, eutanasia por administración intravenosa de pentobarbital y fenitoína (véase Tabla de materiales) en 1 mL/4,5 kg en solución salina estéril de 2 mL. Nota: Estos horarios son óptimos para cubrir el perfil farmacocinético de etambutol y requieran ajuste/optimización de otros medicamentos de estudio.</li>
	<li>Utilizando pinzas, tijeras o bisturí, quitar los pulmones de la cavidad torácica, resecar biopsias del pulmón que contiene grandes granulomas necróticos encajados tejido de pulmón ajeno (como se describe anteriormente3). Aparecen granulomas necróticos amarillento en color y por lo general sobresalen ligeramente del pulmón circundante de color rojo/rosa. Para facilitar la cryosectioning fácil, asegúrese de que las biopsias son no mayores de 2 x 1.5 x 1.5 cm.</li>
	<li>Utilizando pinzas, coloque la biopsia sobre una bandeja de cryomold previamente etiquetado con la superficie de corte deseada en contacto directo con la base de la bandeja. Después de congelar, esto proporcionará una superficie plana de la cual se cortarán cryosections.</li>
	<li>Congelación de la biopsia en vapores de nitrógeno líquido. Llenar un recipiente de poliestireno a una profundidad de 2 pulgadas con nitrógeno líquido y colocar un bastidor de tubo de alambre de metal. La rejilla debe sobresalir por encima de la superficie del nitrógeno líquido, proporcionando una superficie plana en la cual se colocan las bandejas de tejido. Coloque la tapa en el envase de espuma de poliestireno y deja los tejidos durante 10 minutos se congelen completamente.</li>
	<li>Retire las bandejas de tejido, rápidamente envolver en film de aluminio y coloque en individualmente con la etiqueta de sello y bolsas de plástico resellables. Traslado al congelador de-80 ° C para el almacenamiento. Nota: Los pasos 1.1-1.6 son realizados en condiciones de BSL3 (incluyendo todos los trabajos de animales y manejo de la infección de órganos y tejidos). Gamma irradiar las biopsias de pulmón en 3 Megarads para permitir la manipulación fuera de contención BSL3. Microdissection de la captura del laser sobre el tejido no esterilizado puede realizarse dentro de la BLS3 instalación si aprueba protocolos de seguridad están en su lugar. Sin embargo, el resto de este protocolo describe procesamiento aguas abajo en una facilidad BSL-2.</li>
</ol>2. tejido seccionado
<ol><li>Ajuste el criostato a la temperatura deseada. Transferencia de la biopsia del pulmón irradiado gamma de-80 ° C almacenamiento al criostato y dejar por 30 minutos para equilibrar la temperatura del tejido. Nota: -20 a-22 ° C es óptimo para las biopsias de la lesión TB.</li>
	<li>Con unas pinzas, fije la biopsia a la tirada de criostato usando una pequeña cantidad de pegamento de temperatura corte óptimo (OCT) a la base del tejido a la tirada. Oriente el tejido para que la superficie plana (que estaba en contacto con la base de la cryomold) es la superficie expuesta para el corte. Asegúrese que el OCT no contamina la superficie del tejido, esto podría interferir con el análisis de espectrometría de masas posteriores.</li>
	<li>Tres secciones de tejido en 25 μm de grosor de corte y montaje en transparencias de membrana de PET. Suavemente toque la membrana a la sección del tejido y retirar. Si se aplica demasiada presión, puede romperse la membrana fina.<ol>
<li>Evite el manejo excesivo de las diapositivas antes de montar ya que ello en la membrana de PET ser cargado y pobre adhesión de las secciones de tejido. Asegúrese de que la diapositiva de membrana se mantiene a temperatura ambiente para permitir el deshielo-montaje y éxito la adherencia del tejido a la membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quitar la corredera de criostato y deje que se seque al aire durante 3 minutos. Si LCM-LC/MS/MS no se realizará inmediatamente, sello de la diapositiva en una pequeña bolsa plástica con cierre hermético y traslado al almacenamiento de-80 ° C hasta que se para la disección.</li>
	<li>Corte una sección adyacente de 10-12 μm y deshielo-montaje en un portaobjetos de vidrio estándar de hematoxilina y eosina (H & E) coloración y referencia. Pueden cortar secciones adicionales en este momento para otras manchas de histoquímica deseada (tales como Ziehl-Niellsen para la visualización de Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>3. microdisección
<ol><li>Retirar la bolsa sellada que contiene la diapositiva de-80 ° C almacenamiento y permiten para alcanzar la temperatura ambiente durante 5 minutos. Nota: Si la diapositiva frío inmediatamente se expone a la atmósfera del laboratorio, el tejido va ser cubierto con condensación y puede verse comprometida la integridad espacial de la droga.</li>
	<li>Encienda el microscopio y láser (láser requiere 5-10 minutos de calentamiento antes de corte puede iniciar). Cargar tubos PCR de 0,20 mL de tapa plana en el soporte.</li>
	<li>Quitar la corredera de la bolsa y toma una imagen óptica de la sección de tejido en la diapositiva de la PET utilizando un escáner plano.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos en el soporte de diapositivas (tejido hacia abajo) y asignar tubos independientes a las regiones de granuloma específico de interés utilizando el software del microscopio. Normalmente, estos serán 'pulmón ajeno,' 'granuloma de celular' y 'caseum' (centro necrótico), pero puede variar dependiendo de la patología específica de la biopsia del granuloma.</li>
	<li>Se centran en el tejido usando el 5 X objetivo de microscopio. Este aumento debe proporcionar una buena visión general de los tejidos que contienen ambas áreas granuloma necrótico y celular. En el software, seleccione el tubo señalado «caseum» moverse en posición bajo el tejido.</li>
	<li>Introduzca los parámetros deseados de la disección. Configuración típica para una sección de pulmón gruesa 25 μm es potencia de láser 30, velocidad 15 y apertura 35 (unidades arbitrarias). Sin embargo, éstos se diferencian dependiendo del microscopio y la potencial disminución de la energía debido a la antigüedad del láser.</li>
	<li>Seleccione la herramienta 'draw gratis' y, usando un ratón o pantalla táctil pluma, contornear la región deseada para la disección. La superficie de la región se mostrarán en el software. Regiones seleccionadas en 500.000 μm2 (0,5 mm2) para facilitar la disección más fácil de mantener. Repita la disección hasta 3 millones de μm2 (2de 3 mm) se han recogido en total en la tapa del tubo.<ol>
<li>En ocasiones, la región disecada puede permanecer pegada a la membrana circundante (por ejemplo debido a la atracción estática) y no caer en la tapa de la colección. Quitar estas regiones de la superficie acumulada total seleccionando y eliminando manualmente dentro del software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione la tapa de 'lesión celular' y recoger 3 millones μm2 de tejido usando el mismo proceso como se indica en el paso 3.7.</li>
	<li>Seleccione la tapa de 'pulmón ajeno' y recoger 3 millones μm2 de tejido usando el mismo proceso como se indica en el paso 3.7. Tenga en cuenta que el tejido pulmonar contiene muchos bronquiolos y espacios alveolares. Prestar especial atención al excluir a éstos de las regiones de tejido definido para la disección.</li>
	<li>Retire el soporte de la tapa cuidadosamente desenganche, sellar y etiquetar cada tubo. Proteger los tejidos disecados de los disturbios del aire (tales como interrupción del flujo de aire de una puerta). Analizar los tejidos disecados inmediatamente o almacenar a-80 ° C y descongelar a antes de su procesamiento y análisis LCMS.</li>
</ol>4. extracción y análisis LCMS
<ol><li>Preparar la solución de la extracción de acetonitrilo/metanol de 1:1 con estándar interno d-10 etambutol. Al seleccionar un patrón interno, uso una forma estable de la etiqueta de la droga de analito (como EMB marcado con deuterio utilizado en esta demostración) con desplazamiento de masa suficiente para evitar el isótopo Cruz hablar entre el analito drogas y estándar (generalmente un mínimo de 4 daltons) . Nota: Crear estándares en homogenado de cada tipo de tejido respectivo es difícil porque hay un control muy limitado tejido con el que crear normas de homogeneizado. Como una alternativa para hacer estándares de una muestra de homogeneizado con picos, un estándar puede crearse mediante la adición de tejido en blanco y compuesto de prueba junto y extracción. Un volumen de tejido de control en un homogeneizado que coincide con el volumen de destino de las secciones de tejido de muestra de estudio se combina directamente con la cantidad de la sustancia de ensayo que estaría presente en una concentración determinada.</li>
	<li>Calcular el volumen de tejido específicos basado en la superficie y el espesor de la sección de tejido y determinar el factor de dilución necesario para el homogeneizado mediante el volumen de homogeneizado que será añadida a las estándar y las muestras de control de calidad. Cálculos se ilustran a continuación para un área de blanco disecado μm 3 millones2 (3 m m2) con 25 μm de grosor y volumen 2 μl de homogenado. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>Asumiendo una densidad de tejido de 1 g/mL, preparar el material homogeneizado por 50 mg de tejido de control de pesaje y adición de tampón PBS para diluir (utilizando el factor de dilución de 26.67 homogenado calculado en el paso 4.2, el diluyente es 1,283 mL). Homogeneizar por grano a tejido pulmonar y tampón PBS durante 5 minutos a 1750 rpm en un homogenizador de grano. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Diluir la concentración de las existencias del fármaco de 1 mg/mL en acetonitrilo/agua de 1:1 para crear la curva estándar clavar soluciones. Determinar clavar las concentraciones estándar basadas en el volumen de pico y el volumen de tejido blanco. El ejemplo ilustrado es para un 100 ng/mL estándar usando un volumen de espiga 10 μl. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Retirar los tubos que contienen los tejidos microdissected de-80 ° C almacenamiento y permiten para alcanzar la temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Añadir 10 μl de solución de acetonitrilo/agua 1:1 y 2 μl de tampón PBS en los tubos que contienen tejido microdissected.</li>
	<li>Para la curva estándar y los tubos de control de calidad, añadir 10 μl de la solución a 2 μl de homogenado de pulmón control de clavar.</li>
	<li>Añadir 50 μl de solución de extracción para cada tubo.</li>
	<li>Vortex cada tubo por 5 minutos, someter a ultrasonidos durante 5 minutos y centrifugar a 5000 RPM durante 5 minutos para formar un pellet de tejido en cada tubo y película.</li>
	<li>Transferir 50 μl del sobrenadante a una placa de 96 pozos pozos profundos y diluir con un adicional 50 μl de agua desionizada en cada pozo.</li>
	<li>Realizar análisis de LC/MS/MS usando parámetros instrumento optimizado para etambutol y etambutol-d10 estándar interno (como se ha descrito en detalle12).</li>
	<li>Utilizar un factor de dilución para corregir la cantidad exacta de tejido disecado para cada muestra. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. método validación
<ol><li>Crear un homogeneizado de tejido pulmonar de control combinando 1 parte del pulmón, 2 piezas PBS y bolas de acero de 3-4. Bata tejido pulmonar y el tampón PBS durante 5 minutos a 1750 rpm utilizando un homogenizador de grano.</li>
	<li>Spike el homogeneizado mediante la adición de 10 μl de 1 mg/mL stock de DMSO de etambutol en 990 μl homogeneizado para crear una concentración final de 10.000 ng/mL (10 mg/mL) y agitar durante 1 minuto.</li>
	<li>Crear un bloque de homogeneizado congelado verter el homogeneizado en un cryomold y congelar rápidamente en hielo seco durante 5 minutos.</li>
	<li>Prepare secciones gruesas de 25 μm del bloque homogeneizado como se describe en los pasos 2.1-2.5.</li>
	<li>Disecar el área de tejido de destino especificada en pasos 3.2-3.10.</li>
	<li>Añadir 10 μl de 1:1 acetonitrilo/agua y 2 μl de tampón PBS en los tubos que contienen tejido microdissected.</li>
	<li>Añadir 50 μl de solución de extracción para cada tubo. Siga los pasos 4.9-4.12 para crear una curva estándar y determinar la concentración del fármaco en el bloque de homogeneizado de tejido.</li>
	<li>Calcular la eficiencia de la extracción utilizando la siguiente fórmula: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cuantificación espacialmente resueltos de drogas dentro de las lesiones pulmonares de TB es necesaria para determinar si exposición alcanza concentraciones esterilización de poblaciones bacterianas que reside dentro de los compartimientos diferentes de la lesión. El método de LCM-LC/MS que se describe aquí permite la cuantificación absoluta de drogas anti-TB en todos los compartimientos de la lesión, incluyendo el caseum ricos en bacterias, usando solamente secciones de tejido de 1-3 en total. Homogeneización de...

La capacidad de resolver espacial y cuantificar niveles de drogas es un requisito crucial para determinar si los medicamentos contra la tuberculosis llegar a subpoblaciones bacterianas dentro de las lesiones pulmonares en concentraciones1de esterilización. De especial importancia es determinar penetración de drogas en la base necrótica de la lesión (llamada caseum), que normalmente contiene el mayor número de bacilos y puede acceso a los medicamentos debido a la ausencia de vascularización.
Los métodos tradicionales para evaluar la penetración de la lesión, que implican la homogeneización de las lesiones pulmonares suprimidas seguido de extracción por solvente y análisis de cromatografía líquida espectrometría de masas (LC/MS), son altamente sensibles y selectivos para las drogas de interés. Sin embargo, estos métodos ofrecen poca información espacial, limitado al tamaño del tejido homogeneizado original. Métodos de imagen basados en espectrometría de masa, como desorción del láser asistida por matriz (MALDI) de ionización2,3, desorción electrospray ionización (DESI)4 o extracción superficial mejorada de líquido5, 6 ofrecen capacidades de proyección de imagen altamente espacialmente resuelto, pero cuantificación directa puede ser extremadamente difícil o imposible debido a los efectos de supresión de iones heterogéneos y diferentes eficiencias de extracción del analito de la célula diferentes o7tipos de tejido. Además, más directa tejido MS imagen enfoques son inherentemente menos sensibles que la LC/MS debido a la falta de separación cromatográfica de especies endógenas que compiten por la ionización y la baja eficiencia de extracción por solvente de la droga del tejido.
Microdissection de la captura del laser (LCM) combinado con el análisis por LC/MS ha sido aplicada sistemáticamente para aislar y caracterizar regiones de distintos tejidos para estudios de proteómica8,9 y recientemente utilizados para la cuantificación de la droga en dosis tejidos animales10. Aquí presentamos un protocolo optimizado aplicando LCM combinado con el análisis por LC/MS (LCM-LC/MS) para cuantificar drogas anti-TB en compartimentos distintos granuloma. En el proceso de microdisección de captura láser, un láser UV se centra a través del objetivo de microscopio en la sección de tejido, que corta y aísla la zona de tejido deseada siguiendo una ruta definida por el usuario. Para LCM asistida por gravedad (la técnica utilizada para esta investigación), la sección del tejido se monta en una diapositiva de membrana de polímero delgada (PET o pluma) y el tejido es capturado en un tubo de tapón de colección situado debajo de la diapositiva. Las drogas se extraen del tejido suprimido y cuantificaron usando métodos estándar de la LC/MS. La cantidad de tejido necesaria para recogerse en última instancia depende de la concentración esperada de la droga presente en el tejido y la sensibilidad del método LC/MS. Para la mayoría de los análisis de drogas dosis niveles terapéuticos y analizados usando un espectrómetro de masas cuadrupolo triple rutina, 3 millones de μm2 (2de 3 mm) de tejido superficie es suficiente.
Este protocolo describe la poderosa combinación de perfil espacial y cuantificación completa ofrecido por LCM-LC/MS, proporcionando concentraciones de la droga absoluta en todos los compartimientos de granulomas TB. La técnica también puede aplicarse para determinar las concentraciones de drogas en muchos diversos tejidos enfermos proporcionando información de descubrimiento y desarrollo de medicamentos vitales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">New Zealand White rabbits</td>
			<td style="width:159px;">Covance</td>
			<td style="width:155px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:159px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:155px;">NR-13647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Virbac</td>
			<td style="width:155px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A456-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Formic Acid (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Water (LC-MS grade)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">W6212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">0.2 mL flat-cap PCR tubes</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">07-200-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Steel frames, PET-membrane</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">11505151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#160;96 Deep well plate 2.0ML PP RB&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">NC0363259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Zorbax SB-C8&#160;column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">820631-001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#34;Zipper&#8221; Seal Sample Bags</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">01-816-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Equipment</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CM1850&#160;cryostat</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica CM1860 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Laser Microdissection System 6500</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica LMD 6 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Agilent 1260 Infinity II HPLC&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Sciex</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

La tuberculosis sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Mejoras en los regímenes de fármacos existentes y el desarrollo de nuevas terapias son urgentemente necesarios. La capacidad de los medicamentos dosificados para alcanzar y para esterilizar bacterias dentro de regiones necróticas poco vascularizado (caseum) de granulomas pulmonares es crucial para la intervención terapéutica exitosa. Regímenes terapéuticos eficaces deben contener fármacos con propiedades de penetración de caseum favorable. Los métodos actuales de LC/MS para cuantificar los niveles de fármaco en tejidos biológicos tienen una limitada capacidad de resolución espacial, lo que dificulta determinar con exactitud las concentraciones de la droga absoluta dentro de los compartimientos pequeños de tejido como las que se encuentran dentro de granulomas necróticos. Aquí presentamos un protocolo con microdissection de la captura del laser (LCM) de regiones de tejido patológico distinto de cuantificación LC/MS. Esta técnica proporciona la cuantificación absoluta de drogas dentro de granuloma caseum, que rodea la lesión celular y tejido pulmonar y, por lo tanto, determina con exactitud si se están alcanzando concentraciones bactericidas. Además de la investigación de la tuberculosis, la técnica tiene muchas aplicaciones potenciales para cuantificar espacialmente resueltos de fármacos en los tejidos enfermos.

Un resumen del enfoque LCM-LC/MS se muestra en la figura 1. Después de la esterilización del tejido por irradiación gamma, todos los pasos posteriores (de tejido a partir de seccionamiento) llevará a cabo fuera de las condiciones de BSL3. La figura 2 muestra la lesión secciones de biopsia antes y después del aislamiento de tejido por LCM. Áreas necróticas y celulares de las lesiones de TB fácilmente identificadas y aisla...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K vistas.  Rutgers, The State University of New Jersey. Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Video: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

La cuantificación de resonancia magnética de imagen de perfusión pulmonar con etiquetado calibrado arterial spin

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

Investigación

Medicina

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

Imagen de Espectrometría de Masas MALDI de neuropéptidos en la enfermedad de Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Misa cuantitativa espectrometría de perfiles de los proteomas de células del cáncer derivados de líquidos y tumores sólidos

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a specific anatomical region. Within the brain, metals have a highly compartmentalized distribution, depending on the primary function they play within the central nervous system. Imaging the spatial distribution of metals has provided unique insight into the biochemical architecture of the brain, allowing direct correlation between neuroanatomical regions and their known function with regard to metal-dependent processes. In addition, several age-related neurological disorders feature disrupted metal homeostasis, which is often confined to small regions of the brain that are otherwise difficult to analyze. Here, we describe a comprehensive method for quantitatively imaging metals in the mouse brain, using laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) and specially designed image processing software. Focusing on iron, copper and zinc, which are three of the most abundant and disease-relevant metals within the brain, we describe the essential steps in sample preparation, analysis, quantitative measurements and image processing to produce maps of metal distribution within the low micrometer resolution range. This technique, applicable to any cut tissue section, is capable of demonstrating the highly variable distribution of metals within an organ or system, and can be used to identify changes in metal homeostasis and absolute levels within fine anatomical structures.

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Quantitatively mapping metals in tissue by laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) is a sensitive analytical technique that can provide new insight into how metals participate in normal function and disease processes. Here, we describe a protocol for quantitatively imaging metals in thin sections of mouse neurological tissue.

Metales de imagen en el tejido cerebral por ablación con láser - plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Un método In Vivo para evaluar la barrera intestinal-sangre y hígado metabolismo de la Microbiota de productos

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease susceptibility, drug target discovery, and precision medicine. Alternative IgG N-glycans have been reported in several common chronic diseases and suggested to have great potential in clinical applications (i.e., biomarkers for diagnosis and prediction of diseases). IgG N-glycans are widely characterized using the method of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) ultra-performance liquid chromatography (UPLC). UPLC is a stable detection technology with good reproducibility and high relative quantitative accuracy. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated, and glycan composition and relative abundance in plasma are characterized.

Immunoglobulin G (IgG) N-glycan is characterized using hydrophilic interaction chromatography UPLC. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated. Presented here is an introduction to this experimental method so that it can be widely used in research settings.

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is enhanced after processing with vinegar, CR processed with vinegar (CRV) is generally used clinically. However, the mechanism by which the analgesic effect is enhanced by vinegar processing is unclear. In this study, the ultra-high pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) technique was used to examine changes in the blood levels of the exogenous constituents and metabolites between CR-treated and CRV-treated rats with dysmenorrhea. The results revealed differing levels of 15 constituents and two metabolites in the blood of these rats. Among them, the levels of (-)-myrtenol and [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid in the CRV group were considerably higher than in the CR group. CRV reduced the level of 2-series prostanoids and 4-series leukotrienes with proinflammatory, platelet aggregation, and vasoconstriction activities and provided analgesic effects by modulating arachidonic acid and linoleic acid metabolism and the biosynthesis of unsaturated fatty acids. This study revealed that vinegar processing enhances the analgesic effect of CR and contributes to our understanding of the mechanism of action of CRV.

Here, a comparative analysis of raw and processed Cyperi rhizoma (CR) samples is presented using ultra-high performance liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) in rats with primary dysmenorrhea. The changes in blood levels of the metabolites and the sample constituents were examined between rats treated with CR and CR processed with vinegar (CRV).

Análisis de muestras crudas y procesadas de rizoma de Cyperi utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem en ratas con dismenorrea primaria

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

Captura de muestras de tejido de fibrosis submucosa oral para análisis espacial-ómico

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Autor destacado: Desvelando los misterios de las posibles neoplasias malignas orales 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Aislamiento de Células con Información Morfológica y Espacial a partir de Muestras de Fibrosis Submucosa Oral mediante Microdisección por Captura Láser

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...