Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico, como la comprensión del fenotipo de subpoblaciones biológicamente relevantes. La principal ventaja de esta técnica es que permite a un individuo sin experiencia en programación analizar sus datos de citometría con lo último en técnicas de alta dimensión. Para comenzar una canalización de análisis, seleccione primero el tipo de citometría y el número de eventos que se muestrean del archivo.
A continuación, haga clic en Población de puerta, seleccione las poblaciones de celdas de interés e introduzca el porcentaje de eventos para el análisis posterior. A continuación, seleccione el número de canales que se utilizarán para el análisis en el cuadro de lista. Para la incrustación de vecinos estocásticos distribuido en T o el análisis t-SNE, haga clic en t-SNE para comenzar a calcular el conjunto de datos de dimensionalidad reducida.
Cuando se haya calculado el conjunto, haga clic en Guardar imagen TSNE y, en el menú emergente T-SNE específico del marcador, seleccione un marcador específico de interés. Aparecerá una figura que muestra una representación del mapa de calor de la gráfica t-SNE que se puede guardar para la generación de figuras. Para comenzar el análisis de agrupación en clústeres, seleccione una opción en el cuadro de lista Método de agrupación en clústeres y haga clic en Clúster.
Para ordenar los clústeres por un marcador de interés, seleccione la opción correspondiente adecuada en el menú emergente Ordenar y haga clic en Ascendente, Descendente, para actualizar la lista de clústeres en el cuadro de lista Clústeres. Para establecer un valor de umbral mínimo para un clúster determinado a través de un canal determinado, seleccione una opción en el menú emergente Umbral y establezca un umbral adecuado. Una vez establecido el umbral, haga clic en Agregar umbral superior o Agregar por debajo del umbral para especificar la dirección del umbral e introduzca un límite numérico en el cuadro Umbral de frecuencia de clúster, en el panel Filtro de clúster, para establecer un umbral mínimo para la frecuencia de un clúster.
Para seleccionar clústeres para una mayor individualización de análisis, seleccione los clústeres de interés en el cuadro de lista Clústeres. Y use el botón Seleccionar para mover las opciones al cuadro de lista Analizar clúster. Para crear mapas de calor de los clústeres, seleccione los clústeres de interés en el cuadro de lista Analizar clúster y haga clic en el botón HeatMap of Clusters.
Para crear un trazado de cuadro de alta dimensión o un trazado de flujo de alta dimensión, seleccione los clústeres de interés en el cuadro de lista Analizar clúster y haga clic en Gráfica de cuadro de alta dimensión o Gráfica de flujo de alta dimensión para evaluar visualmente la distribución de determinados canales de varios clústeres en todas las dimensiones. Para mostrar clústeres en trazados de flujo 2D tradicionales, seleccione la transformación y el canal adecuados en el panel Gráfica de flujo convencional y haga clic en Gráfica de flujo convencional. Aquí, se muestra un análisis t-SNE representativo de mapas de calor para varios marcadores dentro de una tubería de análisis de paneles mieloides.
Usando la rápida implementación codiciosa dentro de ExCYT para agrupar los datos con 100.000 de los vecinos más cercanos, se revelaron 19 subpúmeros de células. La comparación de los mapas de calor originales con los clústeres creados por ExCYT permitió identificar clústeres similares de las celdas mieloides entre los dos grupos de datos. El análisis del panel linfoide con un enfoque de agrupación jerárquica más convencional y más rápido, produjo distribuciones de marcadores similares a través de mapas de calor t-SNE.
Además, la agrupación de los datos a través de agrupaciones jerárquicas demostró grupos similares de células linfoides. En particular, también se identificó una población de células T reguladoras única a través de una gráfica de flujo de alta dimensión. Para evaluar rápida y cuantitativamente las asociaciones entre marcadores, primero se utilizó un algoritmo de agrupación en clústeres de medios K duro para establecer 5000 clústeres en los datos t-SNE bidimensionales.
La expresión mediana de todos los marcadores de todos los clústeres se utilizó entonces, para crear un mapa de calor a partir de estos clústeres, permitiendo que las asociaciones conjuntas se identificaran fácilmente, como la asociación conjunta de Tim-3, PD-1, CD38 y 4-1BB. Al intentar este procedimiento, es importante recordar explorar los diferentes parámetros, como diferentes métodos de agrupación en clústeres, para explorar completamente los datos que está estudiando.
