Este método puede ayudar a responder preguntas clave en embriología, terapia génica y trasplante de células madre. Una ventaja de esta técnica es que permite el análisis de los efectos de diferentes terapias experimentales en fetos murinos. Demostrando este procedimiento serán los doctores Nicholas Ahn, y Barbara Coons, médicos y compañeros de investigación en nuestro laboratorio.
Antes de comenzar el procedimiento, deje caer de cinco a 10 microlitros de PBS estéril dentro y fuera de la punta quirúrgica de la aguja, de dos a tres veces para eliminar cualquier posible escombro. A continuación, llene la aguja con el reactivo de interés en el volumen experimental y la concentración adecuados. Y pulse el botón de modo tres veces en el microinyector para avanzar a la pantalla de calibración de la inyección.
Agregue intervalos de 10 o 100 milisegundos para ajustar el tiempo de inyección y pulse el botón de modo dos veces más. Pulse el botón de equilibrio y presione el pedal una vez. A continuación, presione el pedal de nuevo y evalúe qué volumen de solución se vacía fuera de la aguja por empuje.
Cuando el microinyector esté calibrado al volumen experimental adecuado, llene la aguja al nivel correcto para la inyección. Cuando se hayan limpiado todas las agujas, confirme la falta de respuesta a la pellizca del ratón hembra embarazada de dos a seis meses de edad. Afeitar el abdomen, teniendo cuidado de no dañar los pezones, y transferir el animal a una almohadilla de calentamiento en la posición supina.
Aplique un ung ón en los ojos del animal y fije las extremidades a la almohadilla de calentamiento con cinta adhesiva. Y desinfectar la piel expuesta. A continuación, inyectar anestésicos locales como 100 microlitros de 0.25%Bupivacaína por vía subcutánea.
A continuación, haga una incisión cutánea de uno a dos centímetros de manera que el borde inferior no esté más cerca de un centímetro del introito, e identifique la línea media de la fascia, teniendo cuidado de no lesionar los vasos epigátricos circundantes. Usando fórceps Adson, pellizca la fascia sin agarrar ninguno de los órganos o fetos subyacentes, y abre el tejido con tijeras. Una vez que se encuentra de forma segura dentro de la cavidad abdominal, extienda la incisión fascial a lo largo de la incisión cutánea y utilice aplicadores de punta de algodón para mover los intestinos hacia la parte superior del abdomen para exponer el útero gravid.
Extraiga el útero a través de la incisión identificando cuidadosamente los ovarios derecho e izquierdo para asegurarse de que se cuentan todos los fetos. Coloque el útero izquierdo de nuevo en el abdomen para que sólo el útero derecho esté expuesto, para mantener calientes los fetos no inyectados. Y agarra suavemente el saco amniótico más lateral entre el pulgar y los dedos índice de la mano no dominante.
Coloque el microscopio de disección sobre el animal y ajuste el enfoque y la iluminación para una mejor visualización del feto según sea necesario. Para una inyección intravenosa gire el útero de modo que la vitellina vana, que se va a inyectar sea paralela a la punta de la aguja. Y poner la aguja en el útero en un ángulo de cinco grados para perforar la pared uterina.
Con la punta entre la pared uterina y el saco amniótico, coloque la punta directamente sobre la vitellina vano y en un ángulo casi tangencial, deslice la aguja sobre el vano hasta que el bisel avance en el recipiente. Es imperativo que el ángulo permanezca bajo para que la aguja no penetre en la pared posterior del recipiente. Cuando se observa una mancha de sangre en la punta de la aguja, para presionar el pedal para inyectar el volumen completo del material de interés en el vaso.
Para una inyección intra amniótica, gire el saco amniótico hasta que se encuentre un lugar desprovisto de vasos. Apunte la aguja perpendicular a la pared uterina y perfore la aguja a través del saco de yema del útero, y el saco amniótico teniendo cuidado de no penetrar ningún tejido fetal. A continuación, inyecte el volumen adecuado de material deseado.
Después de cualquier tipo de inyección, retire la aguja del lugar de inyección una vez que se entregue el volumen deseado. Y proceda al siguiente feto hasta que se hayan inyectado todos los fetos del cuerno uterino derecho. Luego devuelve el cuerno uterino derecho al abdomen.
Y retire el cuerno uterino izquierdo del abdomen. Cuando se han inyectado todos los fetos en el cuerno izquierdo, devolver todo el útero al abdomen, teniendo cuidado de evitar un vólvulo uterino o intestinal. Utilice una pipeta de transferencia desechable para dispensar alrededor de dos mililitros de PBS estéril en el abdomen, para reemplazar cualquier pérdida insensible.
Y usa 4-0 poliglactin 910 suturas para cerrar la fascia y el abdomen en una capa continua. A continuación, transfiera el ratón a una jaula limpia bajo una lámpara de calor con supervisión hasta la recumbencia completa. En este experimento de entrenamiento, los hígados de los fetos que recibieron trasplantes en el útero por un aprendiz mostraron niveles fluorescentes más bajos 24 horas después de la inyección, debido a un menor enjerto de las células GFP trasplantadas, que los hígados inyectados por un instructor experimentado.
El análisis citométrico de flujo para células de donantes positivos de GFP también se correlacionó con el nivel inferior de fluorescentes observado bajo microscopía fluorescente. La capacidad de los vectores virales entregados a través de la vía intra-amniótica a las células transducidas en contacto con el líquido amniótico. Se ejemplifica por la transducción de células epiteliales 48 horas después de la inyección en utero del virus Deno portador del transgén GFP en fetos gestacionales del día 12.5.
Una vez dominada esta técnica puede completarse en 15-25 minutos por ratón embarazada. Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo entregar de forma segura y eficaz diferentes terapias a los fetos de ratón.
