Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Embryologie, Gentherapie und Stammzelltransplantation zu beantworten. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass sie die Analyse der Auswirkungen verschiedener experimenteller Therapien auf Murinföten ermöglicht. Demonstriert wird dieses Verfahren von den Ärzten Nicholas Ahn und Barbara Coons, Ärzten und Forschungsstipendiaten in unserem Labor.
Vor Beginn des Eingriffs fünf bis zehn Mikroliter steriler PBS in und aus der chirurgischen Nadelspitze fallen lassen, zwei- bis dreimal, um sie von möglichen Ablagerungen zu befreien. Als nächstes füllen Sie die Nadel mit dem Reagenz von Interesse bei der entsprechenden experimentellen Volumen und Konzentration. Und drücken Sie die Modus-Taste dreimal auf dem Mikroinjektor, um zum Injektionskalibrierungsbildschirm zu wechseln.
Fügen Sie Intervalle von 10 oder 100 Millisekunden hinzu, um die Einspritzzeit anzupassen, und drücken Sie die Modustaste zwei weitere Male. Drücken Sie die Balance-Taste und drücken Sie einmal das Fußpedal. Drücken Sie dann erneut auf das Pedal und bewerten Sie, welches Lösungsvolumen pro Druck aus der Nadel entleert wird.
Wenn der Mikroinjektor auf das entsprechende Versuchsvolumen kalibriert ist, füllen Sie die Nadel auf das richtige Niveau für die Injektion. Wenn alle Nadeln gereinigt wurden, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenprise der schwangeren zwei bis sechs Monate alten weiblichen Maus. Rasieren Sie den Bauch, achten Sie darauf, die Brustwarzen nicht zu beschädigen, und übertragen Sie das Tier auf ein Heizkissen in der Supine-Position.
Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband am Heizkissen. Und desinfizieren Sie die exponierte Haut. Dann injizieren Sie lokal anästhetische wie 100 Mikroliter 0,25%Bupivacaine subkutan.
Als nächstes machen Sie einen ein bis zwei Zentimeter großen Hautschnitt so, dass die untere Grenze nicht näher als einen Zentimeter zum Introitus ist, und identifizieren Sie die Mittellinie der Faszie, wobei Sie darauf achten, die umgebenden epigastrischen Gefäße nicht zu verletzen. Mit Adson Zange, kneifen Sie die Faszie, ohne eines der zugrunde liegenden Organe oder Föten zu greifen, und öffnen Sie das Gewebe mit einer Schere. Einmal sicher in der Bauchhöhle, verlängern Sie den Faszienschnitt auf die Länge des Hautschnitts, und verwenden Sie Baumwollspitzenapplikatoren, um den Darm in den oberen Teil des Bauches zu bewegen, um die gravid Gebärmutter zu belichten.
Extrahieren Sie die Gebärmutter durch den Schnitt sorgfältig identifizierung der rechten und linken Eierstöcke, um sicherzustellen, dass alle Föten gezählt werden. Legen Sie die linke Gebärmutter wieder in den Bauch, so dass nur die rechte Gebärmutter ausgesetzt ist, um die nicht injizierten Föten warm zu halten. Und greifen Sie sanft an den seitlichen Fruchtwassersack zwischen Daumen und Zeigefinger der nicht dominanten Hand.
Positionieren Sie das Seziermikroskop über dem Tier und passen Sie den Fokus und die Beleuchtung an, um den Fötus bei Bedarf besser zu beleuchten. Für eine intravenöse Injektion drehen Sie die Gebärmutter so, dass die Vitelline eitel, injiziert wird, parallel zur Nadelspitze ist. Und legen Sie die Nadel auf die Gebärmutter in einem Fünf-Grad-Winkel, um die Gebärmutterwand zu durchbohren.
Mit der Spitze zwischen der Gebärmutterwand und dem Fruchtwassersack, legen Sie die Spitze direkt auf die Vitelline eitel und gleiten Sie in einem fast tangentialen Winkel die Nadel über die eitle, bis die Abschrägung in das Gefäß vorrückt. Es ist zwingend erforderlich, dass der Winkel niedrig bleibt, damit die Nadel nicht in die Rückwand des Gefäßes eindringt. Wenn ein Blutfleck an der Nadelspitze beobachtet wird, drücken Sie das Fußpedal, um das gesamte Volumen des von Interesse sindden Materials in das Gefäß zu injizieren.
Für eine intrafruchtiotische Injektion drehen Sie den Fruchtwassersack, bis ein Ort ohne Gefäße gefunden wird. Zeigen Sie die Nadel senkrecht zur Gebärmutterwand und durchbohren Sie die Nadel durch den Gebärmutterdgelbsack, und Fruchtwassersack, der darauf achtet, kein fetales Gewebe zu durchdringen. Dann injizieren Sie das gewünschte Materialvolumen.
Nach jeder Art der Injektion die Nadel von der Injektionsstelle nehmen, sobald das gewünschte Volumen geliefert wurde. Und fahren Sie zum nächsten Fötus, bis alle Föten des rechten Gebärmutterhorns injiziert wurden. Dann geben Sie das rechte Gebärmutterhorn in den Bauch zurück.
Und entfernen Sie das linke Gebärmutterhorn aus dem Bauch. Wenn alle Föten im linken Horn injiziert wurden, kehren Sie die gesamte Gebärmutter in den Bauch zurück, wobei Sie darauf achten, eine Gebärmutter oder einen Darmvolvulus zu vermeiden. Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette, um etwa zwei Milliliter sterilen PBS in den Bauch zu geben, um eventuelle Unempfindliche Verluste zu ersetzen.
Und verwenden Sie 4-0 Polyglactin 910 Nähte, um die Faszien und Denkbauch in einer kontinuierlichen Schicht zu schließen. Dann übertragen Sie die Maus in einen sauberen Käfig unter einer Wärmelampe mit Überwachung bis zur vollen Reemumbency. In diesem Trainingsexperiment zeigten die Lebern der Föten, die von einem Auszubildenden in der Gebärmutter transplantationiert wurden, 24 Stunden nach der Injektion aufgrund einer geringeren Engraftierung der transplantierten GFP-Zellen niedrigere Fluoreszenzenspiegel als Lebern, die von einem erfahrenen Instruktor injiziert wurden.
Die zytometrische Durchflussanalyse für GFP-positive Spenderzellen korrelierte auch mit dem niedrigeren Fluoreszenzgehalt, der unter der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wurde. Die Fähigkeit von viralen Vektoren, die über den intra-fruchtiotischen Weg geliefert werden, um Zellen in Kontakt mit der Fruchtwasserzufluss zu transduce. Wird durch die Transduktion von Epithelzellen 48 Stunden nach der In-Utero-Injektion des Adeno-Virus veranschaulicht, das das GFP-Transgen in Gestationstag 12,5 Föten trägt.
Einmal gemeistert kann diese Technik in 15-25 Minuten pro schwangere Maus abgeschlossen werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene Therapien sicher und effektiv an Mausföten liefern können.
