Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в эмбриологии, генной терапии и трансплантации стволовых клеток. Преимуществом этого метода является то, что он позволяет анализ воздействия различных экспериментальных методов лечения на плод Мурина. Демонстрацией этой процедуры будут врачи Николас Ан и Барбара Кунс, врачи и научные сотрудники нашей лаборатории.
Перед началом процедуры, падение от 5 до 10 микролитров стерильных PBS в и из хирургической иглы кончик, два-три раза, чтобы очистить его от любых возможных мусора. Затем заполните иглу реагентом интереса при соответствующем экспериментальном объеме и концентрации. И нажмите кнопку режима три раза на микро-инжектор, чтобы перейти к экрану калибровки впрыска.
Добавьте интервалы в 10 или 100 миллисекунд, чтобы отрегулировать время впрыска и нажмите кнопку режима еще два раза. Нажмите кнопку баланса и нажмите на педаль ноги один раз. Затем нажмите на педаль снова и оценить, какой объем раствора опорожняется из иглы за толчок.
Когда микро инжектор откалиброван до соответствующего экспериментального объема, заполните иглу до нужного уровня для инъекции. Когда все иглы были очищены, подтвердить отсутствие ответа на щипец щепотку беременной двух-шестимесячной самки мыши. Бритье живота, забота, чтобы не повредить соски, и передать животное на грелку в положении лежа.
Нанесите мазь на глаза животного и закрените конечности на грелке лентой. И дезинфицировать обитуемую кожу. Затем вводят местные анестетики, такие как 100 микролитров 0,25%Bupivacaine подкожно.
Затем сделайте разрез кожи на один-два сантиметра таким образом, чтобы нижняя граница была не на один сантиметр ближе к интроиту, и определите средней линии фасции, заботясь о том, чтобы не повредить окружающие эпигастрические сосуды. Используя щипцы Adson, ущипнуть фасции, не хватая любой из основных органов или плодов, и открыть ткани ножницами. После того, как безопасно в брюшной полости, продлить фасциальный разрез до длины разреза кожи, и использовать хлопок кончик аппликаторов для перемещения кишечника в верхней части живота подвергать gravid матки.
Извлекайте матку через разрез, тщательно идентифицяя правые и левые яичники, чтобы убедиться, что все плоды подсчитаны. Поместите левую матку обратно в брюшную полость так, чтобы только правая матка подвергалась воздействию, чтобы сохранить не введенных плодов теплой. И осторожно понять на самых боковой амниотический мешок между большим и указательным пальцами не доминирующей рукой.
Распоить микроскоп вскрытия над животным и настроить фокус и освещение для лучшей визуализации плода по мере необходимости. Для внутривенной инъекции поверните матку так, чтобы вителлин тщетно вводился параллельно кончику иглы. И положите иглу на матку под углом в пять градусов, чтобы пробить стенку матки.
С кончиком между стеной матки и амниотический мешок, поместите кончик непосредственно на вершине vitelline напрасно и под почти касательным углом, скользить иглы над напрасно, пока скошен не продвигается в сосуд. Крайне важно, чтобы угол оставался низким, чтобы игла не проникала в заднюю стенку сосуда. Когда пятно крови наблюдается на кончике иглы, чтобы нажать на педаль ноги, чтобы ввести полный объем материала, представляющий интерес в сосуд.
Для внутриамниотической инъекции поверните амниотический мешок до тех пор, пока не будет найдено место, лишенное сосудов. Навесните иглу перпендикулярно стенке матки и проткните иглу через мешочек желтка матки, и амниотический мешок, заботясь о том, чтобы не проникать в ткани плода. Затем введать соответствующий объем материала желаемого.
После любого типа инъекций, снять иглу из места инъекции, как только желаемый объем поставляется. И переходите к следующему плоду до тех пор, пока не будут введены все плоды правого рога матки. Затем верните правый рог матки в брюшную полость.
И удалить левый рог матки из живота. Когда все плоды в левом роге были введены вернуть всю матку в живот, заботясь, чтобы избежать матки или кишечного volvulus. Используйте одноразовые пипетки передачи обойтись около двух миллилитров стерильных PBS в живот, чтобы заменить любые бесчувственные потери.
И использовать 4-0 полиглактина 910 швов, чтобы закрыть фасции и живота в одном непрерывном слое. Затем перенесите мышь в чистую клетку под тепловой лампой с мониторингом до полного лежачих состояний. В этом учебном эксперименте печени плода, которые получили пересадку в утробе матери стажером отображается более низкий уровень флуоресцентных 24 часов после инъекции, из-за более низкой прививки пересаженных клеток GFP, чем печень вводили опытный инструктор.
Цитометрический анализ потока для положительных донорских клеток GFP также коррелирует с более низким уровнем флуоресцентных ламп, наблюдаемых при флуоресцентной микроскопии. Способность вирусных переносчиков, поставляемых внутриамниотическим путем, трансдуцировать клетки при контакте с амниотической жидкостью. Примером является трансдукция эпителиальных клеток через 48 часов после инъекции вируса Адено, несущего трансген GFP в гестационный день 12,5 плода.
После освоения этот метод может быть завершена в 15-25 минут на беременную мышь. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как безопасно и эффективно доставить различные методы лечения для мыши плода.
