Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in embriologia, terapia genica e trapianto di cellule staminali. Un vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi degli effetti delle diverse terapie sperimentali sui feti murini. A dimostrare questa procedura saranno i medici Nicholas Ahn e Barbara Coons, medici e ricercatori del nostro laboratorio.
Prima di iniziare la procedura, far cadere da cinque a 10 microlitri di PBS sterile in e fuori dalla punta dell'ago chirurgico, da due a tre volte per liberarlo da eventuali detriti. Quindi riempire l'ago con il reagente di interesse al volume sperimentale e alla concentrazione appropriati. E premere il pulsante di modalità tre volte sul micro iniettore per passare alla schermata di calibrazione dell'iniezione.
Aggiungere intervalli di 10 o 100 millisecondi per regolare il tempo di iniezione e premere il pulsante modalità altre due volte. Premere il pulsante di bilanciamento e premere il pedale una volta. Quindi premere di nuovo il pedale e valutare quale volume di soluzione viene svuotato dall'ago per spinta.
Quando il micro iniettore è calibrato al volume sperimentale appropriato, riempire l'ago al livello corretto per l'iniezione. Quando tutti gli aghi sono stati puliti, confermare la mancanza di risposta al pizzico del topo femmina incinta di due o sei mesi. Radere l'addome, facendo attenzione a non danneggiare i capezzoli e trasferire l'animale in una pastiglia riscaldante in posizione supina.
Applicare un unguento agli occhi dell'animale e fissare gli arti alla pastiglia riscaldante con del nastro adesivo. E disinfettare la pelle esposta. Quindi iniettare anestetici locali come 100 microlitri dello 0,25% di Bupivacaina per via sottocutanea.
Successivamente, fare un'incisione cutanea da uno a due centimetri in modo che il bordo inferiore non sia più vicino di un centimetro all'introito e identificare la linea mediana della fascia, facendo attenzione a non ferire i vasi epigastrici circostanti. Usando le pinza Adson, pizzicare la fascia senza afferrare nessuno degli organi o dei feti sottostanti e aprire il tessuto con le forbici. Una volta in sicurezza all'interno della cavità addominale, estendere l'incisione fasciale alla lunghezza dell'incisione cutanea e utilizzare applicatori a punta di cotone per spostare l'intestino nella parte superiore dell'addome per esporre l'utero gravid.
Estrarre l'utero attraverso l'incisione identificando attentamente le ovaie destra e sinistra per assicurarsi che tutti i feti siano contati. Riposizionare l'utero sinistro nell'addome in modo che sia esposto solo l'utero destro, per mantenere caldi i feti non iniettati. E afferrare delicatamente il sacco amniotico più laterale tra il pollice e le dita indice della mano non dominante.
Posizionare il microscopio a dissezione sull'animale e regolare la messa a fuoco e l'illuminazione per una migliore visualizzazione del feto, se necessario. Per un'iniezione endovenosa ruotare l'utero in modo che la vitellina vana, da iniettare sia parallela alla punta dell'ago. E posare l'ago sull'utero con un angolo di cinque gradi per perforare il muro uterino.
Con la punta tra la parete uterina e il sacco amniotico, posizionare la punta direttamente in cima alla vitellina invano e con un angolo quasi tangenziale, scivolare l'ago sul vano fino a quando la smussatura avanza nel vaso. È imperativo che l'angolo rimanga basso in modo che l'ago non penetri nella parete posteriore del vaso. Quando si osserva una macchia di sangue sulla punta dell'ago, premere il pedale per iniettare l'intero volume del materiale di interesse nel vaso.
Per un'iniezione intra amniotica, ruotare il sacco amniotico fino a trovare una posizione priva di vasi. Puntare l'ago perpendicolarmente alla parete uterina e perforare l'ago attraverso il sacco di tuorlo dell'utero e il sacco amniotico facendo attenzione a non penetrare alcun tessuto fetale. Quindi iniettare il volume appropriato di materiale desiderato.
Dopo entrambi i tipi di iniezione, ritirare l'ago dal sito di iniezione una volta consegnato il volume desiderato. E procedere al feto successivo fino a quando tutti i feti del corno uterino destro non sono stati iniettati. Quindi riportare il corno uterino destro nell'addome.
E rimuovere il corno uterino sinistro dall'addome. Quando tutti i feti nel corno sinistro sono stati iniettati restituire l'intero utero all'addome, facendo attenzione a evitare un volvulo uterino o intestinale. Utilizzare una pipetta di trasferimento usa e getta per erogare circa due millilitri di PBS sterile nell'addome, per sostituire eventuali perdite insensibili.
E usa 4-0 suture di poliglatina 910 per chiudere la fascia e l'addome in uno strato continuo. Quindi trasferire il mouse in una gabbia pulita sotto una lampada termica con monitoraggio fino alla piena reclinabilità. In questo esperimento di allenamento i fegati dei feti che hanno ricevuto il trapianto in utero da un tirocinante hanno mostrato livelli fluorescenti più bassi 24 ore dopo l'iniezione, a causa di un maggiore innesto delle cellule GFP trapiantate, rispetto ai fegati iniettati da un istruttore esperto.
L'analisi citometrica del flusso per le cellule donatrici positive della GFP è anche correlata con il livello inferiore di fluorescenti osservato sotto microscopia fluorescente. La capacità dei vettori virali consegnati attraverso la via intra-amniotica di trasdurre le cellule a contatto con il fluido amniotico. È esemplificato dalla trasduzione di cellule epiteliali 48 ore dopo l'iniezione in utero del virus Adeno che trasporta il transgene GFP nei feti gestazionali del giorno 12.5.
Una volta padroneggiata questa tecnica può essere completata in 15-25 minuti per topo incinta. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come fornire in modo sicuro ed efficace diverse terapie ai feti del topo.
