Bu yöntem embriyoloji, gen terapisi ve kök hücre naklinde anahtar soruların cevaplatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin bir avantajı, farklı deneysel tedavilerin Mindik fetusları üzerindeki etkilerinin analizini sağlamasıdır. Bu prosedürü gösteren doktorlar Nicholas Ahn ve Barbara Coons, doktorlar ve araştırma araştırmacıları bizim laboratuvarda olacaktır.
İşleme başlamadan önce, olası enkazdan temizlemek için cerrahi iğne ucunun içine ve dışına 5 ila 10 mikrolitre steril PBS bırakın. Daha sonra uygun deneysel hacim ve konsantrasyon ilgi reaktif ile iğne doldurun. Enjeksiyon kalibrasyon ekranına ilerlemek için mikro enjektördeki mod düğmesine üç kez basın.
Enjeksiyon süresini ayarlamak için 10 veya 100 milisaniyearalık ekleyin ve mod düğmesine iki kez daha basın. Denge düğmesine basın ve ayak pedalına bir kez basın. Daha sonra tekrar pedala basın ve itme başına iğneden hangi çözelti hacminin boşaltılmış olduğunu değerlendirin.
Mikro enjektör uygun deneysel hacime kalibre edildiğinde, iğneyi enjeksiyon için doğru seviyeye doldurun. Tüm iğneler temizlendiğinde, 2-6 aylık dişi farenin parmak ucuna yanıt verilmediğinden onaylayın. Karın tıraş, meme zarar vermemeye özen, ve supine pozisyonda bir ısıtma yastığı için hayvan transfer.
Merhemi hayvanın gözlerine uygulayın ve bantla ısıtma yastığına uzuvları sabitleyin. Ve maruz kalan deriyi dezenfekte edin. Sonra 0.25% Bupivacaine deri altı 100 mikrolitre gibi lokal anestezikler enjekte.
Daha sonra, alt sınır introitus bir santimetre daha yakın olduğu gibi bir ila iki santimetre lik deri kesi yapmak, ve fasya orta hat belirlemek, çevreleyen epigastrik damarları zarar vermemeye özen. Adson forseps kullanarak, altta yatan organ veya fetusherhangi kapma olmadan fasya çimdik ve makas ile doku açın. Bir kez güvenli bir şekilde karın boşluğu içinde, deri kesi uzunluğuna fasyal kesi uzatmak, ve gravid rahim ortaya çıkarmak için karın üst kısmına bağırsak taşımak için pamuk ucu aplikatörleri kullanın.
Tüm fetusların sayıldığından emin olmak için sağ ve sol yumurtalıkları dikkatlice belirleyerek kesiden rahimi ayıklayın. Enjekte edilmeyen fetusları sıcak tutmak için sol rahmi karın içine yerleştirin, böylece sadece sağ rahim maruz kalır. Ve yavaşça olmayan baskın el başparmak ve işaret parmakları arasında en lateral amniyotik kese kavramak.
Diseksiyon mikroskobu hayvanın üzerine yerleştirin ve gerektiğinde fetüsün daha iyi bir görüntülenmesi için odağı ve Aydınlatmayı ayarlayın. Bir intravenöz enjeksiyon için vitelline boşuna, enjekte edilecek iğne ucu naparalel olacak şekilde rahim döndürmek için. Ve rahim duvarını delmek için iğneyi beş derecelik açıyla rahime koy.
Rahim duvarı ve amniyotik kese arasındaki ucu ile, doğrudan vitelline boşuna üstüne ve neredeyse teğet bir açıyla ucu yerleştirin, eğim damar içine ilerler kadar boşuna üzerinde iğne kayma. İğnenin geminin arka duvarına girmemesi için açının düşük kalması zorunludur. İğne ucunda bir kan lekesi gözlendiğinde, ayak pedalına basarak ilgi çekici maddenin tam hacmini damara enjekte edin.
Bir intra amniyotik enjeksiyon için, damarlardan yoksun bir yer bulunana kadar amniyotik keseyi döndürün. İğneyi rahim duvarına dik olarak işaretle ve iğneyi rahim sarısı kesesine batırın ve amniyotik kese herhangi bir fetal dokuya nüfuz etmemeye özen gösterebilir. Daha sonra istenilen malzemenin uygun hacmini enjekte edin.
Her iki enjeksiyon türünden sonra, istenilen hacim teslim edildikten sonra iğneyi enjeksiyon alanından çekin. Ve sağ rahim boynuzunun tüm fetüsleri enjekte edilene kadar bir sonraki fetüse geç. Sonra karın içine sağ rahim boynuzu dönün.
Ve sol rahim boynuzu karın dışına çıkarın. Sol boynuz tüm fetuslar enjekte edildiğinde karın tüm rahim dönmek, bir rahim veya bağırsak volvulus önlemek için özen. Herhangi bir duyarsız kayıpları değiştirmek için, karın içine steril PBS yaklaşık iki mililitre dağıtmak için tek kullanımlık bir transfer pipet kullanın.
Ve tek bir sürekli tabaka halinde fasya ve karın kapatmak için 4-0 poliglactin 910 sütür kullanın. Daha sonra fareyi tam yedek alana kadar izleyerek bir ısı lambası altında temiz bir kafese aktarın. Bu eğitim deneyinde, bir kursiyer tarafından rahim içi transplantasyon yapılan fetusların karaciğerleri enjeksiyondan 24 saat sonra, nakledilen GFP hücrelerinin daha düşük bir engraftment nedeniyle, deneyimli bir eğitmen tarafından enjekte edilen karaciğerler daha düşük floresan düzeyleri gösterdi.
GFP pozitif donör hücreleri için akış sitometrik analizi de floresan mikroskopi altında gözlenen floresan alt düzeyi ile ilişkili. Amniyotik sıvı ile temas eden hücrelere intra-amniyotik yol üzerinden teslim viral vektöryeteneği. GFP transgeni gestasyonel gün 12.5 fetustaşıyan Adeno virüsünün rahim enjeksiyonundan 48 saat sonra epitel hücrelerinin transdüksiyonu ile örneklenir.
Bu teknik hakim bir kez hamile fare başına 15-25 dakika içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra fare fetuslarına nasıl güvenli ve etkili bir şekilde farklı tedaviler sunabileceğinizi iyi anlamalısınız.
