Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em embriologia, terapia genética e transplante de células-tronco. Uma vantagem para esta técnica é que permite a análise dos efeitos de diferentes terapias experimentais em fetos murinos. Demonstrando este procedimento estarão os médicos Nicholas Ahn, e Barbara Coons, médicos e pesquisadores em nosso laboratório.
Antes de iniciar o procedimento, solte de cinco a dez microlitadores de PBS estéreis dentro e fora da ponta da agulha cirúrgica, duas a três vezes para limpá-lo de quaisquer possíveis detritos. Em seguida, encha a agulha com o reagente de interesse no volume e concentração experimentais apropriados. E pressione o botão de modo três vezes no micro injetor para avançar para a tela de calibração de injeção.
Adicione intervalos de 10 ou 100 milissegundos para ajustar o tempo de injeção e pressione o botão de modo mais duas vezes. Pressione o botão de equilíbrio e aperte o pedal do pé uma vez. Em seguida, pressione o pedal novamente e avalie qual volume de solução é esvaziado da agulha por empurrão.
Quando o micro injetor estiver calibrado para o volume experimental apropriado, encha a agulha ao nível correto para a injeção. Quando todas as agulhas tiverem sido limpas, confirme a falta de resposta ao toe pinch do rato fêmea grávida de dois a seis meses de idade. Raspe o abdômen, tomando cuidado para não danificar os mamilos, e transfira o animal para uma almofada de aquecimento na posição supina.
Aplique pomada nos olhos do animal e fixe os membros na almofada de aquecimento com fita adesiva. E desinfetar a pele exposta. Em seguida, injete anestésicos locais, como 100 microlitres de 0,25% bupivacaína subcutânea.
Em seguida, faça uma incisão de pele de um a dois centímetros de tal forma que a borda inferior não esteja mais perto de um centímetro do introito, e identifique a linha média da fáscia, tomando cuidado para não ferir os vasos epigástricos circundantes. Usando fórceps de Adson, belisque a fáscia sem agarrar nenhum dos órgãos ou fetos subjacentes, e abra o tecido com uma tesoura. Uma vez segura dentro da cavidade abdominal, estenda a incisão fascial até o comprimento da incisão da pele, e use aplicadores de ponta de algodão para mover os intestinos para a parte superior do abdômen para expor o útero gravid.
Extrair o útero através da incisão identificando cuidadosamente os ovários direito e esquerdo para garantir que todos os fetos sejam contados. Coloque o útero esquerdo de volta no abdômen para que apenas o útero direito seja exposto, para manter os fetos não injetados aquecidos. E segure suavemente o saco amniótico mais lateral entre o polegar e os dedos indicadores da mão não dominante.
Posicione o microscópio de dissecção sobre o animal e ajuste o foco e a iluminação para uma melhor visualização do feto conforme necessário. Para uma injeção intravenosa gire o útero de modo que a vitelina vaidosa, a ser injetada é paralela à ponta da agulha. E coloque a agulha no útero em um ângulo de cinco graus para perfurar a parede uterina.
Com a ponta entre a parede uterina e o saco amniótico, coloque a ponta diretamente em cima da vitelina em vão e em um ângulo quase tangencial, deslize a agulha sobre o vão até que o chanfra suba no vaso. É imperativo que o ângulo permaneça baixo para que a agulha não penetre na parede traseira do vaso. Quando uma mancha de sangue é observada na ponta da agulha, pressione o pedal do pé para injetar o volume total do material de interesse no vaso.
Para uma injeção intra amniótica, gire o saco amniótico até que um local desprovido de vasos seja encontrado. Aponte a agulha perpendicularmente para a parede uterina e perfure a agulha através do saco de gema do útero, e saco amniótico tomando cuidado para não penetrar nenhum tecido fetal. Em seguida, injete o volume adequado do material desejado.
Após qualquer tipo de injeção, retire a agulha do local da injeção assim que o volume desejado for entregue. E prossiga para o próximo feto até que todos os fetos do chifre uterino direito tenham sido injetados. Em seguida, devolva o chifre uterino direito para o abdômen.
E remova o chifre uterino esquerdo do abdômen. Quando todos os fetos no chifre esquerdo tiverem sido injetados, devolva todo o útero ao abdômen, tomando cuidado para evitar um volvulo uterino ou intestinal. Use uma pipeta de transferência descartável para distribuir cerca de dois mililitros de PBS estéreis no abdômen, para substituir quaisquer perdas insensíveis.
E use suturas de poliglactina 4-0 910 para fechar a fáscia e o abdômen em uma camada contínua. Em seguida, transfira o mouse para uma gaiola limpa sob uma lâmpada de calor com monitoramento até a recumbência total. Neste experimento de treinamento, os fígados dos fetos que receberam transplante no útero por um estagiário apresentaram níveis fluorescentes mais baixos 24 horas após a injeção, devido a um menor enxerto das células GFP transplantadas, do que os fígados injetados por um instrutor experiente.
A análise citométrica de fluxo para células doadoras positivas de GFP também correlaciona-se com o menor nível de fluorescentes observados sob microscopia fluorescente. A capacidade dos vetores virais entregues através da rota intra-amniótica para transduzir células em contato com o fluido amniótico. É exemplificado pela transdução de células epiteliais 48 horas após a injeção no útero do vírus Adeno carregando o transgene GFP no dia gestacional 12,5 fetos.
Uma vez dominada esta técnica pode ser completada em 15-25 minutos por rato grávida. Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como entregar de forma segura e eficaz diferentes terapias para fetos de camundongos.
