이 방법은 배아학, 유전자 치료 및 줄기 세포 이식에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 장점은 뮤린 태아에 대한 다른 실험 요법의 효과를 분석 할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 보여주는 것은 우리의 실험실에 있는 닥터 니콜라스 안, 바바라 쿤스, 의사 및 연구 동료가 될 것입니다.
시술을 시작하기 전에, 수술 바늘 팁안팎으로 멸균 PBS의 5~10마이크로리터를 2~3회 떨어뜨려 가능한 잔해를 치웁힙시다. 다음으로 적절한 실험용 부피 및 농도에 대한 관심의 시약으로 바늘을 채웁니다. 그리고 마이크로 인젝터에서 모드 버튼을 세 번 눌러 주사 교정 화면으로 진행합니다.
10밀리초 또는 100밀리초의 간격을 추가하여 주입 시간을 조정하고 모드 버튼을 두 번 더 누릅니다. 밸런스 버튼을 누르고 발 페달을 한 번 누릅니다. 그런 다음 페달을 다시 누르고 푸시당 바늘에서 비워지는 용액의 양을 평가합니다.
마이크로 인젝터가 적절한 실험 용 부피에 보정되면 주사를 위한 올바른 수준으로 바늘을 채웁니다. 모든 바늘이 청소되었을 때, 임신 2 ~ 6 개월 된 여성 마우스의 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 복부를 면도하고 젖꼭지를 손상시키지 않도록 주의하고 동물을 척추 위치에있는 가열 패드로 옮기.
동물의 눈에 연고를 바르고 테이프로 가열 패드에 팔다리를 고정하십시오. 그리고 노출된 피부를 소독합니다. 그런 다음 0.25%의 부피바카인 100마이크로리터와 같은 국소 마취제를 피하한다.
다음으로, 하부 테두리가 내성에 1센티미터 이상 이될 정도로 1~2센티미터의 피부 절개를 하고, 근막의 중간선을 식별하여 주변 상복부 혈관을 손상시키지 않도록 주의한다. Adson 집게를 사용하여 기본 장기 나 태아를 잡지 않고 근막을 꼬집어 가위로 조직을 엽니다. 일단 안전하게 복강 내에서, 피부 절개의 길이에 매실 절개를 확장하고, 목팁 어플리케이터를 사용하여 내장을 복부의 상부로 이동하여 중력 자궁을 노출시합니다.
절개를 통해 자궁을 추출하여 모든 태아가 계산되도록 오른쪽 과 왼쪽 난소를 주의 깊게 식별합니다. 왼쪽 자궁을 복부에 다시 넣고 오른쪽 자궁만 노출되도록 하여 주입되지 않은 태아를 따뜻하게 유지합니다. 그리고 엄지손가락과 엄지손가락 사이의 가장 측면 양수 낭을 부드럽게 잡습니다.
해부 현미경을 동물 위에 배치하고 필요에 따라 태아의 더 나은 시각화를 위해 초점과 조명을 조정합니다. 정맥 주사의 경우 자궁을 회전하여 비텔린이 헛되도록 주입할 바늘 팁과 평행하게 주입됩니다. 그리고 자궁 벽을 관통하기 위해 5도 각도로 자궁에 바늘을 놓습니다.
자궁 벽과 양수 낭 사이의 끝을 가진 끝은 팁을 비텔린 헛된 꼭대기에 직접 놓고 거의 접선 각도로 바늘을 헛된 각도로 놓고 베벨이 혈관으로 들어갈 때까지 헛된 위로 바늘을 미끄러뜨립니다. 바늘이 용기의 뒷벽을 관통하지 않도록 각도가 낮게 유지되는 것이 필수적입니다. 바늘 끝에서 혈액 의 반점이 관찰되면, 용기에 관심물질의 전체 볼륨을 주입하는 발 페달을 누릅니다.
내 양수 주사의 경우 혈관이없는 위치가 발견 될 때까지 양수 주머니를 회전하십시오. 자궁 벽에 수직으로 바늘을 가리키고 자궁 노른자 낭을 통해 바늘을 관통하고 양수 낭을 복용하는 것은 태아 조직을 관통하지 않습니다. 그런 다음 원하는 물질의 적절한 볼륨을 주입합니다.
주사의 두 종류 후, 원하는 볼륨이 전달되면 주사 사이트에서 바늘을 철회. 그리고 오른쪽 자궁 뿔의 모든 태아가 주입 될 때까지 다음 태아로 진행합니다. 그런 다음 오른쪽 자궁 경적을 복부에 반환합니다.
그리고 복부에서 왼쪽 자궁 경적을 제거합니다. 왼쪽 뿔의 모든 태아가 자궁 또는 장 volvulus를 피하기 위해 주의하여 자궁 전체를 복부에 돌려 보내게 됩니다. 일회용 이송 파이펫을 사용하여 멸균 PBS의 약 2 밀리리터를 복부에 분배하여 무분별한 손실을 대체하십시오.
그리고 4-0 폴리글락틴 910 봉합사를 사용하여 한 연속 층에서 근막과 복부를 닫습니다. 그런 다음 마우스를 열램프 아래의 깨끗한 케이지로 옮기고, 완전한 재조정이 있을 때까지 모니터링합니다. 본 훈련 실험에서 연수생에 의해 자궁 이식을 받은 태아의 간은 주입 후 24시간 낮은 형광 수준을 보였으며, 이는 이식된 GFP 세포의 더 낮은 이식으로 인해 숙련된 강사가 주입한 간보다 더 낮은 형광 수준을 보였다.
GFP 양성 기증자 세포에 대한 유동 세포 측정 분석은 또한 형광 현미경 검사의 밑에 관찰된 형광의 더 낮은 수준과 상관관계. 양수와 접촉하여 세포를 트랜스듀스하기 위해 양수 내 경로를 통해 전달되는 바이러스 벡터의 능력. 임신일 12.5 태아에서 GFP 트랜스진을 운반하는 아데노 바이러스의 자궁 주입 후 48시간 후 상피 세포의 전이에 의해 예시된다.
일단 이 기술은 임신 한 마우스 당 15-25 분 안에 완료 할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 태아에게 다른 치료법을 안전하고 효과적으로 전달하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야 합니다.
