Este método se puede utilizar para responder preguntas clave en la virología de la hepatitis B, como la búsqueda de factores celulares o virológicos que afectan la integración del ADN del VPH. Esta técnica tiene múltiples ventajas. Es relativamente barato, y fácil de llevar a cabo, el análisis de los resultados es simple, y es muy sensible, hasta copias individuales.
Aunque este método se puede utilizar para proporcionar información sobre la integración del VHB, también se puede utilizar para otros virus que se integran en el genoma de la célula huésped, como el VIH, HTLV-1 o el VPH. Para infectar las células, sembra 200.000 células por mililitro en una placa de doce pozos, con 1 mililitro de D-mem. Al día siguiente, utilice la columna de heparina purificada su-per-na-din de HEP-AD 38 como inoculante para infectar las células a 1.000 VGE por célula, en 500 microlitros del medio de cultivo.
Luego, cultiva las células a 37 grados centígrados. Luego, al día siguiente, lave las células dos veces con un mililitro de estéril una vez PBS. A continuación, reemplace el medio de cultivo cada 2 días, hasta la cosecha.
En el día 3 después de la infección, tratar las células con 5 micromolares tenofovir disoproxilo y 10 lamivudina micromolar para limitar la producción de intermedios replicativos del VHB que se amplifican capaces de PCR inversa. En el día 5, después de la infección, tripinizar algunas células con 200 microlitros de Trypsin EDTA y re suspenderlas en 2 mililitros de D-mem que contiene 5 micromolarEsto Tenofovir disoproxilo y 10 micromolar Lamivudina. Posteriormente, transfiera las suspensiones celulares a una placa de seis pozos, para inducir una ronda de mitosis.
En el día 7 post infección, tripinizar las células expandidas en 400 microlitros de Tripppsin EDTA y suspender la mezcla en 1 milleter de D-mem. A continuación, transfiera la suspensión en un tubo de 1,5 mililitros. Pele las células por centrifugación a 500 veces G, durante cinco minutos.
Y quita el Su-per-na-din por aspiración. Extraiga el ADN del pellet celular utilizando un kit de extracción de ADN, según las instrucciones del fabricante. Para la inversión de ADN, asigne de 1,5 a 2,5 microgramos del extracto total de ADN en un tubo de PCR de 200 microlitros.
A continuación, agregue la cantidad adecuada de mezcla maestra de enzimas de restricción para dar lugar a un volumen de reacción de 40 microlitros, que contiene 1 veces el tampón de reacción de digestión y 10 unidades de NCO-1HF. Incubar la reacción enzimática de restricción en una máquina pcr a 37 grados Celsius durante una hora, para una eficiencia óptima en la digestión. Luego, inactivar la enzima de restricción incubando 80 grados Celsius durante 20 minutos.
Transfiera toda la reacción enzimática de restricción a un tubo de 1,5 mililitros. Posteriormente, agregue 400 microlitros de 1 veces T4 T4 DNA ligasa buffer y 500 unidades de ligasa de ADN T4, y mezcle bien. Gran volumen de reacción fomenta la ligadura intramolecular de los fragmentos de ADN digeridos.
Incubar la reacción de ligadura a temperatura ambiente durante 2 horas para asegurar la ligadura completa. Después de 2 horas, Inactivar la ligasa de ADN T4 a 70 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, agregue 10 microlitros de 10 sulfato de Dodedecyl de sodio para asegurar la inactivación completa de la ligasa T4.
Añadir cloruro de sodio a una concentración final de 100 mililitros, y Dextran a una concentración final de 90 microgramos por mililitro. Mezclar por vórtice de pulso, y girar brevemente hacia abajo la mezcla de reacción. A continuación, agregue 900 microlitros de 100 etanol y mezcle por inversión.
Precipitar el ADN a 20 grados Celsius negativos durante la noche. Y pele el ADN precipitado por centrifugación a 14000 veces G durante 15 minutos. Después, retire el Su-per-na-dine por aspiración.
Lavar el pellet con 500 microlitros de 70 etanol. Y centrifugación a 14000 veces G durante 15 minutos. A continuación, retire el etanol por aspiración y seque al aire el pellet de ADN a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Disolver el pellet en 20 microlitros de agua y añadir 20 microlitros de la mezcla maestra de enzimas restringidas para dar lugar a un volumen de reacción de 40 microlitros, que contiene 1 veces tampón de reacción de digestión, 5 unidades BSIHK-1 y 5 unidades de SPH-1HF. Nido, incubar la reacción enzimática de restricción en un bloque de calor a 37 grados Celsius, durante 1 hora. Gire brevemente la mezcla de reacción, incubar la reacción enzimática de restricción en un bloque de calor a 65 grados Celsius durante 1 hora.
En este procedimiento, elimine los amplicons potenciales de un sello de estera de silicio reutilizable, utilizando una solución de degradación del ADN. Enjuague bien la estera con agua libre de ADN y séquela al aire a temperatura ambiente. A continuación, prepare un mililitro de 1 veces la mezcla de PCR que contenga las imprimaciones exteriores hacia adelante y hacia atrás a una concentración de 0,5 micromolares.
Añadir 170 microlitros si la mezcla de PCR 1 veces a los pozos A-1 y E-1, en una placa PCR de 96 pozos. A continuación, agregue 120 microlitros de la mezcla de PCR 1 veces a los pozos B-1 y H-1. Después, agregue 10 microlitros del ADN invertido a los pozos A-1 y E-1.
Mezclar la reacción en cada pozo, pipeteando suavemente cada uno, unas 10 veces usando un P-1000 establecido en 100 microlitros. Diluir en serie las muestras de los pozos A-1 a D-1, a una relación de 1:3 mediante la transferencia de 60 microlitros en cada paso. Mezcle los pozos en cada paso pipeteándolos suavemente unas 10 veces usando un P-1000 establecido en 100 microlitros.
Evite la formación de burbujas, repita el procedimiento para el pozo E-1, diluyendo hasta bien H-1. Posteriormente, asignar 10 microlitros de la mezcla de reacción, utilizando pipeta multicanal, de Wells A-1, H-1, en pozos A-2, H2, A-3, H-3 y so-on, hasta llegar a los pozos A-12, H-12 de la placa de 96 pozos. Cubra la placa PCR con una estera de silicio seca y presione firmemente.
A continuación, coloque la placa en una máquina PCR y ejecute el programa indicado, antes de transferir la placa a temperatura ambiente. Después, calienta los pines de un replicador de 96 pines para que esté al rojo vivo con un quemador Bunsen, luego enfríe durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente. Llene los pozos de una segunda placa PCR con 10 microlitros de 1 mezcla de PCR, que contiene un tampón listo para la carga de gel, y el interior hacia adelante y hacia atrás a 0,5 micromolares.
Retire con cuidado la estera de silicio de la placa PCR de la placa de 96 pozos de la PCR primera redonda, y evite la contaminación cruzada entre pozos. Utilice el replicador refrigerado para transferir los productos PCR de la placa de 96 pozos, desde la PCR primera redonda, a la placa de 96 pozos recién asignada. Lleve a cabo el PCR anidado, utilizando la condición indicada.
Para aislar los productos PCR, analícelos por electroforesis de gel, utilizando una placa de 96 pozos, con 1,3 Agarrose gel. Para un gel Agarose de 100 mililitros, corre a 200 voltios durante 10 a 15 minutos. Después, extirpa las bandas de ADN de los geles de Agarose, usando pajitas desechables para beber.
Para cada producto PCR, coloque la pajita y el tapón de gel de Agarose en un tubo de 1,5 mililitros, recorte la paja a medida con tijeras. Después, expulse los tapones de Agarose en cada tubo, apretando el extremo del fragmento de paja. A continuación, agregue 300 microlitros de tampón de extracción de gel, y 5 microlitros de perlas de vidrio de extracción de gel a cada tubo.
Extraiga los productos PCR según las instrucciones del fabricante para el kit de extracción de gel y diluya el ADN de las perlas con 30 microlitros de agua. Envíe el ADN purificado para la secuenciación de Sanger, con la imprimación delantera utilizada en la PCR anidada de la segunda ronda. Un ejemplo de electroforesis de gel de agarosa de PCR inversa exitosa, antes y después del aislamiento del producto PCR, se muestra aquí.
M representa el marcador de ADN último, cada fila de 12 representa las réplicas técnicas en una sola dilución en la placa PCR. En este caso, los productos de PCR individuales deben lograrse mediante la segunda o tercera dilución 1:3 de cada muestra. En estas diluciones, aproximadamente el 50% de los productos representarán uniones verdaderas de ADN de células de virus.
Mientras que la otra mitad representa la amplificación de los intermedios del ADN del VHB. Esta técnica ha permitido a los investigadores explorar la integración del ADN del VPH en sistemas de infección in vitro altamente controlados. Se pueden utilizar métodos adicionales, como el análisis biotemático, para responder a otras preguntas.
Por ejemplo, si la integración del ADN del VPH se produce en regiones específicas del genoma celular. No olvide que trabajar con el virus de la hepatitis B por infección puede ser peligroso y los controles de infección adecuados, como los gabinetes de seguridad biológica y la vacunación previa, siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.
