Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo reproductivo, como cómo determinar la aparición puberal en ratones y ratas a través de la separación preputial, la apertura vaginal y el establecimiento de la primera estrus antes de realizar un estudio de fertilidad. La principal ventaja de esta técnica es que al establecer el inicio puberal utilizando el enfoque no invasivo demostrado, es posible seguir y realizar un estudio de fertilidad en animales que son sexualmente maduros. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de déficits en la reproducción, causados por mutaciones genéticas o tratamientos susceptibles a afectar la competencia reproductiva, como los productos químicos disruptores endocrinos.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la competencia reproductiva en ratones, también se puede aplicar a otros sistemas modelo, como ratas y hámsters. La demostración visual de este método es crítica, ya que requiere buenas y delicadas habilidades de manejo animal. Es particularmente importante sostener los ratones correctamente para la siguiente identificación visual de la separación preputial y la abertura vaginal.
Para preparar el área de trabajo, coloque una almohadilla sobre la mesa. A continuación, coloque una tapa limpia de la jaula del ratón con la rejilla hacia arriba, en la almohadilla. A continuación, configure una escala en el área de trabajo.
Coloque un vaso limpio de 500 a 1000 mililitros en la báscula y tara. A continuación, coloque una hoja junto al área de trabajo para registrar los datos. Después de esto, coloque la jaula del ratón en el área de trabajo.
Abra la jaula y retire la tapa, la botella de agua y el soporte de alimentos a la mesa. Mientras sostiene el ratón por la cola, colóquelo en la parte superior de la jaula del ratón. Mientras mantiene la sujeción de la cola, permita que el ratón explore la cuadrícula de la parte superior de la jaula.
Tire suavemente de la cola hacia atrás y acérquese la otra mano a la piel cerca del cuello y las orejas. Sujete la piel suelta entre los hombros y el cuello con el pulgar y el dedo índice. A continuación, agarre la piel en la parte posterior con los dedos restantes y sostenga el ratón presionando suavemente contra la mano.
Con la mano libre, empuje suavemente la piel alrededor del pene hacia atrás. En la separación preputial, la piel preputial se desliza hacia atrás, exponiendo el pene del glande. Después del examen, registre la presencia o ausencia de separación preputial.
Después de esto, pesar el ratón y registrar su peso. A continuación, vuelva a introducir el ratón en la jaula de la carcasa sosteniendo el vaso de precipitados sobre el suelo de la jaula y permitiendo que el ratón salga por sí solo. Coloque una bola de algodón, un vaso de precipitados grande y una botella de agua estéril en el área de trabajo.
Vierta agua estéril en el vaso de precipitados. A continuación, humedúntale la bola de algodón con el agua estéril en el vaso de precipitados y colóquela junto a la parte superior de la jaula limpia. Coloque la jaula del ratón en el área de trabajo.
A continuación, transfiera el ratón a la parte superior de la jaula sosteniéndolo por la base de su cola. Tire suavemente de la cola del ratón para fomentar un movimiento hacia adelante por el ratón. Después de esto, levante la cola mientras sostiene las caderas con tres dedos.
Limpie suavemente la vulva con la bola de algodón humidificado, luego examine la vulva para determinar si la vagina está completamente abierta. Registre si se ha producido una abertura vaginal. A continuación, pesar el ratón y devolverlo a la jaula de casa.
Prepare una jaula limpia de ratón con tapa, agua, alimentos, ropa de cama y material de anidación para cada par de ratones reproductores. A continuación, rellene las tarjetas de jaula con la información necesaria. Coloque la jaula de ropa de cama preparada en una mesa limpia, luego introduzca lentamente una mano enguanada en la jaula del ratón y déjela en la jaula durante un corto período de tiempo.
Acérquese lentamente a los ratones con la mano enguanda. Cuando los ratones corran sobre la mano, agarre la cola de un ratón entre el pulgar y el dedo índice, luego levante el ratón por la cola. El ratón puede ser sostenido por la cola sin soporte del cuerpo durante un máximo de dos a tres segundos.
Coloque el ratón en la jaula de cría preparada, luego cierre la jaula después de asegurarse de que los ratones machos y hembras tengan alimento, agua y material de anidación. Utilizando el método presentado, se estudiaron dos modelos de ratón transgénicos diferentes. La apertura vaginal y la separación preputial ocurrieron a la misma edad y peso tanto en los ratones heterocigotos como en los ratones de control.
Por el contrario, la apertura vaginal y la separación preputial se retrasaron significativamente en las mujeres y los hombres noqueadores condicionales, y se asociaron con el aumento del peso corporal. A las 4,5 semanas de edad, los controles femeninos y los ratones noqueadores condicionales tenían un peso corporal comparable, mientras que los machos nocaut condicionales eran ligeramente más pesados que los controles. Esto indica que el retraso en la apertura vaginal y la separación preputial de los ratones noqueadores condicionales no se asoció con un retraso en el aumento de peso.
Después de completar el inicio puberal, el estudio de fertilidad se inició a la edad de 10 a 16 semanas. Tanto los ratones heterocigoto machos como hembras eran sub-fértiles. Las hembras de heterocigoto generaron menos camadas en el estudio de tres meses, y tanto los ratones heterocigotos masculinos como hembras generaron camadas más pequeñas.
Para ilustrar la importancia de confirmar el inicio puberal antes de establecer un ensayo de fertilidad, se evaluó la competencia reproductiva en ratones nocaut condicionales. Durante el estudio de fertilidad de 70 días, ni los nocauts condicionales ni las mujeres generaron camadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manejar a los ratones con cuidado y mantener la calma mientras se acerca y maneja a los animales.
Después de este procedimiento, otros métodos como la medición de los niveles de hormonas sexuales circulantes se pueden realizar para responder preguntas adicionales, como si la infertilidad u otra subfertilidad fue causada por testosterona anormal, estrógeno, hormona estimulante del folículo, y los niveles de hormona luteinizante. No olvide que trabajar con ratones puede ser peligroso debido al riesgo de morder y desarrollar alergias. Para reducir la exposición, siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio, y un manejo cuidadoso de los ratones durante la realización de este procedimiento.
