Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo riproduttivo, come come determinare l'insorgenza pubertale in topi e ratti attraverso la separazione pre-espettorato, l'apertura vaginale e la creazione del primo estro prima di eseguire uno studio sulla fertilità. Il principale vantaggio di questa tecnica è che stabilendo l'esordio pubertale utilizzando l'approccio non invasivo dimostrato, è possibile seguire e condurre uno studio sulla fertilità in animali sessualmente maturi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi di deficit nella riproduzione, causati da mutazioni genetiche o trattamenti suscettibili di impatto sulla competenza riproduttiva, come le sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla competenza riproduttiva nei topi, può anche essere applicato ad altri sistemi modello, come ratti e criceti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto richiede buone e delicate capacità di gestione degli animali. È particolarmente importante trattenere correttamente i topi per la seguente identificazione visiva della separazione preputale e dell'apertura vaginale.
Per preparare l'area di lavoro, posizionare un pad sul tavolo. Quindi posizionare una parte superiore pulita della gabbia del mouse con la griglia rivolta verso l'alto, sul pad. Impostare quindi una scala nell'area di lavoro.
Posizionare un becher pulito da 500 a 1000 millilitri sulla bilancia e tararlo. Quindi posizionare un foglio accanto all'area di lavoro per registrare i dati. Successivamente, posizionare la gabbia del mouse nell'area di lavoro.
Aprire la gabbia e rimuovere il coperchio, la bottiglia d'acqua e il porta cibo sul tavolo. Mentre si tiene il mouse per la coda, posizionarlo sulla parte superiore pulita della gabbia del mouse. Pur mantenendo la presa della coda, consentire al mouse di esplorare la griglia della parte superiore della gabbia.
Tirare delicatamente la coda all'indietro e avvicinarsi all'altra mano alla pelle vicino al collo e alle orecchie. Afferrare la pelle sciolta tra le spalle e il collo con il pollice e l'indice. Quindi afferrare la pelle sul retro con le dita rimanenti e tenere il mouse premendolo delicatamente contro la mano.
Con la mano libera, spingere delicatamente la pelle intorno al pene indietro. Alla separazione preputale, la pelle preputale scivola all'indietro, esponendo il glande. Dopo l'esame, registrare la presenza o l'assenza di separazione precontenziale.
Dopo questo, pesare il mouse e registrare il suo peso. Quindi reintrodurre il mouse nella gabbia di alloggiamento tenendo il becher sopra il pavimento della gabbia e permettendo al mouse di uscire da solo. Posizionare un batuffolo di cotone, un grande becher e una bottiglia di acqua sterile nell'area di lavoro.
Versare acqua sterile nel becher. Quindi, umidifica il batuffolo di cotone con l'acqua sterile nel becher e posizionalo accanto al piano pulito della gabbia. Posizionare la gabbia del mouse nell'area di lavoro.
Quindi trasferire il mouse sulla parte superiore della gabbia tenendolo per la base della coda. Tirare delicatamente la coda del mouse per incoraggiare un movimento in avanti da parte del mouse. Dopo questo, sollevare la coda mentre si sostengono i fianchi con tre dita.
Pulire delicatamente la vulva con il batuffolo di cotone umidificato, quindi esaminare la vulva per determinare se la vagina è completamente aperta. Registrare se si è verificata l'apertura vaginale. Quindi pesare il topo e restituirlo alla gabbia di casa.
Prepara una gabbia pulita per topi con coperchio, acqua, cibo, biancheria da letto e materiale di nidificazione per ogni coppia riproduttiva di topi. Quindi compilare le schede della gabbia con le informazioni necessarie. Posizionare la gabbia da letto preparata su un tavolo pulito, quindi introdurre lentamente una mano guantata nella gabbia del topo e lasciarla nella gabbia per un breve periodo di tempo.
Avvicinati lentamente ai topi con la mano guantata. Quando i topi corrono sopra la mano, afferra la coda di un mouse tra il pollice e l'indice, quindi solleva il mouse per la coda. Il mouse può essere tenuto dalla coda senza supporto del corpo per un massimo di due o tre secondi.
Posizionare il topo nella gabbia da riproduzione preparata, quindi chiudere la gabbia dopo aver assicurarsi che i topi maschi e femmine abbiano cibo, acqua e materiale di nidificazione. Utilizzando il metodo presentato, sono stati studiati due diversi modelli di topi transgenici. L'apertura vaginale e la separazione preputiale si sono verificate alla stessa età e peso sia nei topi eterozigoti che nei topi di controllo.
Al contrario, l'apertura vaginale e la separazione pre-espettorato sono state significativamente ritardate nelle femmine e nei maschi knockout condizionali e associati all'aumento del peso corporeo. A 4,5 settimane di età, i controlli femminili e i topi knockout condizionali avevano un peso corporeo comparabile, mentre i maschi knockout condizionali erano leggermente più pesanti dei controlli. Ciò indica che il ritardo nell'apertura vaginale e nella separazione pre-espettorato dei topi knockout condizionali non è stato associato a un ritardo nell'aumento di peso.
Dopo il completamento dell'esordio pubertale, lo studio sulla fertilità è stato avviato all'età di 10-16 settimane. Sia i topi eterozigoti maschi che femmine erano subfertili. Le femmine eterozigoti hanno generato meno cucciolate nello studio di tre mesi, e sia i topi eterozigoti maschi che quelli femmine hanno generato cucciolate più piccole.
Per illustrare l'importanza di confermare l'esordio pubertale prima di istituire un saggio sulla fertilità, la competenza riproduttiva è stata valutata nei topi knockout condizionali. Durante lo studio sulla fertilità di 70 giorni, né maschi né femmine knockout condizionali hanno generato cucciolate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare i topi con cura e rimanere calmi mentre si avvicinano e maneggiano gli animali.
Seguendo questa procedura, altri metodi come misurare i livelli di ormone sessuale circolante possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come se l'infertilità o altra subfertilità è stata causata da testosterone anormale, estrogeni, ormone follicolo stimolante e livelli di ormone luteinizzante. Non dimenticare che lavorare con i topi può essere pericoloso a causa del rischio di mordere e sviluppo di allergie. Per ridurre l'esposizione, durante l'esecuzione di questa procedura devono sempre essere prese precauzioni come indossare guanti e un camice da laboratorio e un'attenta manipolazione dei topi.
