Este método podría ayudar en el desarrollo de variedades de algodón resistentes a los nematodos reniformes. Mediante la identificación de genotipos resistentes de otras especies de algodón y la evaluación de las poblaciones reproductoras. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método simple y no destructivo para el cribado de nematodos reniformes.
Comience colocando una bola de algodón en la parte inferior de un diámetro de cuatro centímetros, 21 olla de plástico cónico de altura central por semilla. Y llenar las ollas con mezcla de suelo pasteurizado al vapor a aproximadamente dos centímetros de la parte superior de la olla. Coloque una estaca de plástico en cada maceta designando el genotipo a plantar y plante una semilla del genotipo de algodón correspondiente apropiado en cada maceta.
Llene cada maceta con tierra adicional para cubrir la semilla y coloque las macetas en una cámara de crecimiento ajustada a temperatura constante de 28 grados celsius con un período de foto de lámpara fluorescente e incandescente de 16 horas. A continuación, coloque los emisores de agua en cada maceta y utilice un sistema de riego automático para regar las ollas dos veces al día. Siete días después de la siembra, crear una pequeña depresión en el suelo junto a cada planta y añadir un mililitro de suspensión de nematodo reniformado en cada depresión.
Después de la inoculación, el agua de la olla debe ser cuidadosamente controlada para evitar el lavado de los nematodos de la zona radicular. 28 días después de la inoculación, utilizar tijeras para eliminar la mayoría de las hojas completamente expandidas de las plantas antes de apretar cada maceta y deslizar el suelo hacia fuera en una mano para eliminar las plantas. Agitar suavemente el sistema radicular en agua del grifo en un recipiente de 10 litros para eliminar el suelo de las raíces, seguido de un breve enjuague en un recipiente de agua limpia del grifo.
Utilice tijeras para eliminar el sistema radicular limpiado de la planta aproximadamente un centímetro por debajo de la línea del suelo. Coloque las raíces en un recipiente de plástico desechable no estéril de 120 mililitros. A continuación, cubra completamente el sistema radicular con aproximadamente 30 mililitros de solución para colorear alimentos rojos y coloque el recipiente de la muestra en un horno microondas para calentar la solución de tinción hasta que comience a hervir.
Cuando la muestra se haya enfriado a temperatura ambiente, sustituya la solución para colorear alimentos rojos por 100 mililitros de agua del grifo para eliminar cualquier exceso de manchas. A continuación, coloque la cubierta en el recipiente de la muestra y almacene la muestra en un grado Celsius de cuatro grados hasta el análisis de la infección radicular. Para recuperar las plantas para la producción de semillas, coloque una bola de algodón en la parte inferior de una nueva olla de plástico cónico y llene parcialmente la olla con un medio de maceta de musgo de turba.
Coloque un brote vegetativo cosechado por el sistema radicular en la olla y agregue firmemente el medio de maceta para llenar la olla. Coloque una nueva estaca de plástico etiquetada en cada olla para designar el genotipo de algodón y coloque la bandeja de ollas en un recipiente de plástico de agua. Regar brevemente las plantas para humedecer el medio de maceta y colocar las macetas en una cámara de crecimiento ajustada a una temperatura constante de 28 grados Celsius y un período fotográfico de 16 horas.
Después de aproximadamente 30 días, llene parcialmente una olla de plástico de seis litros por planta con un medio de maceta. Transfiera cada planta a una maceta de seis litros, añadiendo firmemente un medio de maceta a cada maceta a medida que se planta cada plántula. A continuación, coloque las plantas en una casa de vidrio y agregue agua para humedecer el medio de maceta.
Para evaluar la infección de la raíz de R.reniformis, retire una muestra de raíz del contenedor de la muestra. Utilice un microscopio estéreo para contar el número de nematodos hembra unidos al sistema radicular bajo aumento de 20X. Una infección exitosa del sistema radicular de nematodos puede verse influenciada por varios factores, incluyendo la viabilidad del nematodo utilizado para la inoculación y la variación estacional, ya que los nematodos son menos activos durante los meses de invierno.
A continuación, coloque el sistema radicular en toallas de papel durante aproximadamente 10 minutos para eliminar el exceso de humedad. Pesar el sistema radicular para determinar el peso de la raíz fresca. Las variaciones en el crecimiento de las raíces son comunes entre las escisiones.
Estas variaciones, medidas por el peso de la raíz fresca, también se pueden observar entre plantas del mismo genotipo. Relativamente menos nematodos reniformes femeninos son capaces de establecer un sitio de alimentación para el genotipo de algodón resistente en comparación con el genotipo susceptible. Los datos de peso raíz fresco se pueden utilizar para calcular el número de nematodos reniformes femeninos por gramo de tejido radicular para cada genotipo.
El número de nematodos reniformes femeninos por gramo de raíz para genotipos resistentes es generalmente inferior a 10, mientras que los genotipos susceptibles suelen tener más de 30 nematodos por gramo de raíz. Aquí, se muestra un subconjunto de datos de una población F2 segregante que incluía 300 plantas. Estos rangos de variación para el crecimiento de las raíces y la infección por nematodos de los sistemas radiculares se observan comúnmente para las evaluaciones de nematodos, lo que ilustra la capacidad de este procedimiento para ser utilizado para examinar un gran número de plantas en un solo experimento, para minimizar esta variación, y para facilitar una evaluación precisa de la genética de resistencia.
Después de este procedimiento, la genética de la resistencia a los nematodos reniformes se puede determinar para identificar los marcadores de ADN asociados con la resistencia. Estos marcadores se pueden utilizar para la cría asistida por marcadores y para la transferencia de resistencia a nematodos al algodón americano (upland). Después de su desarrollo, esta técnica proporcionó un método no destructivo para permitir a los investigadores recuperar plantas después de la re-cribado de nematodos para ayudar en la cría de variedades de algodón resistentes.
