Aquí, se presenta un protocolo para la detección eficiente y precisa de genotipos de tabaco para la resistencia a Phytophthora nicotianae en plántulas. Es práctico para la cría de precisión, así como para la investigación de mecanismos moleculares. Materiales. Obtenga las variedades de tabaco Beinhart1000-1, una selección de Beinhart1000 BH y Xiaohuangjin1025 XHJ del Geneback Nacional a Mediano Plazo del Recurso de Germoplasma de Tabaco de China.
BH es resistente, mientras que XHJ es susceptible a la infección por Phytophthora nicotianae. Plantación de genotipos de tabaco para la evaluación de la resistencia a Phytophthora nicotianae. Mezcle las semillas de tabaco con vermiculita y transmita las semillas suavemente sobre el suelo esterilizado para macetas.
Coloque las macetas en la cámara de crecimiento. Mantenga una temperatura constante de 25 grados Celsius bajo un período de fotos de luz de 16 horas / ocho horas de luz oscura. Prepare dispositivos hidropónicos con bandejas y láminas de espuma.
Después de que las semillas germinen, pinche las plántulas de la tierra para macetas. Lave las raíces suavemente con agua desionizada estéril y trasplantarlas a los dispositivos hidropónicos. Coloque los dispositivos en cámaras climáticas a 25 grados Celsius bajo un período de fotos de luz de seis horas / ocho horas de luz oscura durante 24 horas.
Prepare la solución nutritiva de Hoagland de antemano. Transplante las plántulas a dispositivos hidropónicos con la solución nutritiva de Hoagland. Coloque los dispositivos en la cámara climática a 25 grados Celsius bajo un período de foto oscuro de 16 horas de luz / ocho horas durante dos semanas.
Preparación de la suspensión de zoosporas de Phytophthora nicotianae. Preparación de agar medio de avena. Pesar 33 gramos de avena en un hueco y añadir 1.000 mililitros de agua estéril.
Hervir en un horno electromagnético. Después de que la avena se vuelva pegajosa, cuele el líquido a través de un trozo de gasa estéril. Vierta el líquido en un cilindro graduado de 1. 000 mililitros y ajuste el volumen a 1.000 mililitros con agua estéril.
Vierta el líquido en una botella de reactivo de vidrio y agregue 18 gramos de agar. Agitar bien y autoclave la mezcla de agar de avena medio a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Déjelo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Vierta alrededor de 20 mililitros de agar medio de avena esterilizado en cada placa de Petri. Deje que las placas de Petri a temperatura ambiente se enfríen completamente antes del cultivo micelial. Cultivo de micelios.
Prepare punzones y palillos de dientes de un centímetro de diámetro de antemano en autoclave en un autoclave a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Perfora agujeros en cultivos de agar micelio de Phytophthora nicotianae para hacer esteras miceliales redondas. Elija esteras miceliales, coloque el lado micelial hacia abajo en el medio de agar de avena e incube el micelio a 25 grados centígrados en la oscuridad durante 14 días.
Preparación de la suspensión de zoosporas de Phytophthora nicotianae. Agregue una solución de nitrato de potasio al 0,1% a cada cultivo de micelios 15 mililitros por plato, seguido de un cultivo a cuatro grados centígrados durante 20 minutos para inducir el esporangio. Mantenga los platos a 25 grados centígrados durante 25 minutos para liberar zoosporas.
Recoja la suspensión de zoosporas a un vaso de precipitados y mida la concentración de zoosporas con microscopio y hemocitómetro. Ajuste la concentración de zoosporas a una vez 10 a la cuarta zoospora por mililitro con agua estéril. Identificación de variedades de tabaco resistentes a enfermedades.
Tome las plántulas de la solución nutritiva de Hoagland e inocularlas sumergiendo las raíces en 20 mililitros de suspensión de zoosporas de Phytophthora nicotianae en una placa de Petri de 90 milímetros a 25 grados centígrados durante tres horas en la oscuridad. Después de la inoculación, coloque las plántulas de tabaco en nuevas placas de Petri con 10 mililitros de agua estéril, sumergiendo las raíces. Mantenga las raíces húmedas cubriendo con dos trozos de papel de filtro.
Mantenga los platos en 25 grados Celsius 16 horas de luz / ocho horas de oscuridad período de fotos. Después de dos o tres días, observe la gravedad de la enfermedad. Para el tratamiento de control, coloque las plántulas de tabaco directamente en las placas de Petri con agua estéril de 10 mililitros, sumergiendo las raíces y cubriendo las raíces con dos trozos de papel de filtro.
Evaluación de la infección por Phytophthora nicotianae. Evalúe la gravedad de la enfermedad de cuatro a cinco días después de la inoculación. Basado en el estándar nacional chino, califique la gravedad de la enfermedad de las plantas individuales en una escala de cero a nueve.
Grado 0 significa que no hay síntomas en toda la planta. Grado 1 significa lesiones del tallo inferiores a 1/3 de la circunferencia del tallo o 1/3 de las hojas marchitadas. Grado 3 significa lesiones del tallo entre 1/3 y 1/2 de la circunferencia del tallo o entre 1/3 y 1/2 de las hojas ligeramente marchitas.
Grado 5 significa lesiones del tallo mayores de 1/2 de la circunferencia del tallo, pero no completamente alrededor de la circunferencia o entre 1/2 y 2/3 de las hojas marchitando. Grado 7 significa lesiones del tallo alrededor de la circunferencia del tallo entero o mayor que 2/3 de las hojas marchitadas. El grado 9 significa que las plantas parecen muertas.
Calcule el índice de enfermedad utilizando la siguiente fórmula. La gravedad de la enfermedad se dividió en seis grados. Resultados representativos.
Las plantas de cuatro semanas de edad de la variedad resistente BH y la variedad susceptible XHJ fueron desafiadas con Phytophthora nicotianae utilizando el método presentado en este artículo. A los tres días después de la inoculación, en XHJ, las lesiones del tallo cubrieron aproximadamente 1/2 de la circunferencia del tallo y 1/2 de las hojas estaban ligeramente marchitas. En la variedad resistente BH, no se observaron síntomas.
A los cuatro días después de la inoculación, el marchitamiento de las hojas y las lesiones graves del tallo ocurrieron en XHJ, mientras que estos síntomas no aparecieron en BH.At cinco días después de la inoculación, se registró y calculó la gravedad de la enfermedad de la planta individual y se calculó sobre la base del estándar nacional chino para el grado y el método de investigación de las enfermedades del tabaco y las plagas de insectos. El índice medio de enfermedad de BH fue de 6,48, que muestra resistencia R según el estándar, y el índice medio de enfermedad de XHJ fue de 76,85, que muestra susceptibilidad S según el estándar. Para confirmar la eficiencia de la inoculación, la biomasa relativa del patógeno se cuantificó mediante PCR en tiempo real.
El resultado de la PCR en tiempo real confirma las observaciones fenotípicas. Cinco progenies de la población BC4 F2 de un cruce entre BH y XHJ, dos variedades de resistencia intermedia, K326 y Yunyan87, fueron evaluadas por el método de inoculación en suspensión de zoosporas y el método de inoculación de granos de avena. El método de suspensión de zoosporas se realizó en plántulas pequeñas y el método de inoculación de granos de avena se realizó en plantas adultas.
Para las cinco progenies de la población BC4 F2, el índice de enfermedad varió de 16.49 a 77.60 por el método de suspensión de zoosporas y varió de 10.33 a 83.08 por el método de granos de avena. Las clasificaciones de resistencia entre dos métodos de infección son en su mayoría consistentes entre sí. Con las dos variedades de resistencia intermedia K326 y Yunyan87, la evaluación mostró resistencia en ambos métodos.
Estos datos ilustran la correlación entre dos métodos de inoculación a pesar de que se realizaron con tabaco en diferentes períodos de crecimiento. El protocolo descrito aquí es un método eficiente y confiable para evaluar la resistencia del tabaco a la infección por la etapa de plántulas de P.nicotianae. Este protocolo es práctico para la cría, así como para la investigación de mecanismos moleculares, ya que el método del grano de avena es aplicable para el cribado de resistencia a gran escala de plantas adultas.
Estos dos métodos pueden ser complementarios. Gracias por verlo.
