Este trabajo fue financiado por una beca de la BSF Estados Unidos e Israel a BS y EDSBS es un titular de la cátedra Hilda y Cecil Lewis en Genética Molecular.

NOTA: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Instituto Weizmann de Ciencias. 1. Preparación de muestras <ol><li> Aislamiento de acinos pancreáticos <ol><li> Preparar 300 ml de bicarbonato fresco Krebs-Ringer HEPES (KRBH) medio antes de empezar. Mezclar NaCl 140 mM, KCl 4,7 mM, 1,16 mM MgCl2, CaCl2 1 mM, 11 mM de glucosa, 10 mM HEPES. Añadir albúmina de suero bovino (BSA) y el inhibidor de 0,1 mg / ml de tripsina de soja (STI) (medio de resuspensión). Preparar de 5 - 10 ml de la resuspensión medio suplementado con colagenasa (~ 0,75 mg / ml) (medio de digestión). </li><li> Oxigenar el medio KRB durante ~ 30 min. Añadir BSA después de la oxigenación para prevenir el burbujeo. Traiga resuspensión y digestión medios a 37 ° C. NOTA: oxigenar el medio reduce la mortalidad celular y mejora la respuesta a secretagogos. El efecto de la oxigenación es evidente por lo menos durante 6 horas. </li><li&gt; sacrificar el ratón por dislocación cervical o asfixia con CO2, según las directrices de cuidado de los animales institucionales. Colocar el animal sacrificado en su parte posterior, adjuntarlo a un cojín de disección y limpiar la superficie abdominal con etanol. NOTA: Con el fin de evitar la contaminación, autoclave las herramientas de disección y el agua utilizada para el medio KRBH antes de su uso. Filtra medio KRBH a través de un filtro de 0,2 micras. Antes de la escisión del páncreas enjuagar las herramientas de disección con 70% de etanol y llevar a cabo la disección en un banco limpio. Realizar las infecciones virales en un gabinete de bioseguridad de nivel 3. Añadir antibióticos a la / medio de cultivo N O (ver sección 4). </li></ol></li><li> La escisión del páncreas murino <ol><li> Incisión ampliamente la piel abdominal y la capa subcutánea. Identificar el hígado, el estómago, el intestino, el páncreas y el bazo (Figura 1). NOTA: En los siguientes pasos, manejar el tejido pancreático con cuidado y no aplique excesiva forc mecánicaE para prevenir auto-digestión del tejido y la muerte celular. </li><li> Mediante el uso de dos pinzas romas, sacar el intestino delgado. Comienza en el extremo proximal del intestino pequeño, cerca de la salida del estómago. Separar el páncreas a partir del intestino y retener dentro de la cavidad corporal. Una vez que llega al intestino grueso, notar un tejido conectivo de color rosa / blanco. No lo confunda con el páncreas. </li><li> Desactive mayor cantidad de tejido pancreático posible sin recoger el tejido graso o conectivo. Retire el páncreas separándolo del bazo y el estómago y el corte de los vasos sanguíneos abdominales debajo de ella (Figura 1A-C). NOTA: Debido a que el rendimiento de los acinos pancreáticos de un solo animal es alta, uno puede abstenerse de recolectar todo el tejido pancreático para evitar que la recolección de otros tejidos. </li></ol></li><li> Digestión con colagenasa <ol><li> Enjuague el páncreas un par de veces en medio de resuspensión calentado a 37 ° C y retirar el resto de partes de no pancreáticatejidos. Sumerja el páncreas en ~ 5 ml de medio de digestión precalentado en un vial de centelleo de 20 ml. Picar el páncreas para piezas de 1-3 mm. Colóquelo en un baño de agua caliente (de manera óptima con agitación de ~ 100 rpm). Para acelerar la digestión, la pipeta hasta el tejido digerido y abajo una vez cada pocos minutos. NOTA: La duración de la digestión con colagenasa depende principalmente de la concentración de colagenasa y de la cantidad de fuerza mecánica aplicada sobre el tejido. El uso de 0,75 mg / ml de colagenasa durante aproximadamente 15 min y pipeteando el tejido con una pipeta de 5 ml de poliestireno con un orificio de 2 mm cada 3 - 5 min, resultando en acinos de 10 - 30 células. Después de la digestión, la suspensión aparece turbia que contiene fragmentos visibles de tejido. Desde colagenasas eficiencia varía entre los diferentes tipos comerciales y lotes, determinar el momento de la digestión empíricamente. </li><li> Lavado y filtrado <ol><li> Transferir el tejido digerido en un tubo de 50 ml y terminar excavaciónestion añadiendo 45 ml de medio de resuspensión. Se filtra la suspensión a través de una gruesa (~ 1 mm) de malla metálica en un tubo nuevo. Centrifugar el flujo a través a 100 × g durante 3 min. </li><li> Descartar el sobrenadante y se resuspendió el páncreas digeridos en 50 ml de medio de resuspensión. Se filtra la suspensión a través de una malla de nylon 70 o 100 micras. Centrifugar como antes. </li><li> Con el fin de eliminar flotante, acinos dañado, descartar el sobrenadante y resuspender el tejido pancreático en 3 - 5 ml de medio de resuspensión. Aplicar 1 ml de la acinos pancreáticos en 15 ml tubos cónicos llenos de 7 ml de medio de resuspensión. Permita que los acinos se asiente durante 2 - 3 min. Recoger los acinos que se han asentado en la parte inferior del tubo con una pipeta de 1 ml, y repetir este paso 2 - 3 veces. </li><li> Ver el acinos pancreáticos bajo un microscopio de luz o de disección para comprobar su estado. En la Figura 2, observar la pureza de aislamiento y daños infligidos a las células duriaislamiento ng. Utilice estos acinos inmediata o la cultura para un máximo de 20 horas. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. amilasa Secreción Ensayo NOTA: El ensayo de secreción de amilasa sirve como una medida global de la capacidad secretora de acinos pancreáticos. Esto se consigue recogiendo el medio en el que se incubaron los acinos pancreáticos, y la determinación de la actividad de la amilasa del medio, por lo general mediante el uso de un kit comercial. <ol><li> Determinar el número de condiciones experimentales que deben examinarse (frente a por ejemplo no estimulado-estimulado). Use al menos tres réplicas para cada condición. Además, añadir un conjunto de réplicas para determinar el contenido celular total amilasa (muestra &quot;total&quot;) y un conjunto para la actividad de la amilasa del medio (&quot;cero&quot; de la muestra). Etiquetar una placa de múltiples pocillos en la que se llevará a cabo el ensayo, y dos juegos de microtubos para cada una de las repeticiones que se utilizará. NOTA: de 12 ó 24 pocillos placas se puede utilizar para controlar 1 y 0,5 ml de suspensiones acinares, respectivamente. </li><li> Lave los acinos dos veces en 30 ml de medio de resuspensión KRBH e incubar en medio de resuspensión durante 30 minutos a 37 ° C. Para la placa de múltiples pocillos añadir una gota de 10μl secretagogo para alcanzar la concentración final apropiada. </li><li> Acinos pancreáticos responden a un gradiente de secretagogo de una manera bifásica. Las concentraciones con valores óptimos de secreción son 50 - 100 pM de colecistoquinina (CCK) y 1μM de carbacol (Figura 3A) 5. </li><li> Lavar y volver a suspender los acinos en medio de resuspensión. Asegúrese de que los acinos se distribuyen homogéneamente en suspensión y las alícuotas iguales cantidades de suspensión en la placa de múltiples pocillos y en los &quot;microtubos total&#39; marcado. Incubar la placa durante 30 minutos a 37 ° C. (Preferiblemente en un baño de agua bajo agitación suave (~ 50 rpm)). NOTA: El número exacto de los acinos puede variar entre experiments, pero deben ser similares en las réplicas en cada experimento. Por lo tanto, precisa alícuotas de la suspensión acinos es crítico para la comparación entre las diferentes repeticiones y condiciones. </li><li> Durante la incubación, producir el &quot;total&quot; y &quot;cero&quot; muestras. Centrifugar los microtubos &#39;integrales&#39; para unos segundos a 5000 × g y eliminar 50 l del sobrenadante en &quot;microtubos-etiquetados zero&#39; y colocarlos a 4 ° C. Lyse los acinos en las muestras &quot;total&quot; mediante la adición de Triton X-100 a los microtubos para llegar a una concentración final de 1%. Vortex los microtubos vigorosamente. NOTA: aliquote el &quot;total&quot; replica similar a las réplicas del experimento. Lisis de los acinos, conduce a la liberación del contenido total de amilasa. Alternativamente, recoger los acinos en cada condición y se lisan al final del experimento, para determinar el contenido celular de cada réplica. </li><li> Recoger la mayor parte de la suspensión i acinarnto el primer conjunto de los microtubos pre-etiquetados. Centrifugar los microtubos durante unos segundos a 5000 × g. Transferir el sobrenadante en el segundo conjunto de los microtubos pre-etiquetados. </li><li> Ensayar el sobrenadante para la actividad de la amilasa con un kit comercial. Calcular el porcentaje de la amilasa secretada. NOTA: Es muy importante leer la actividad de la amilasa en su rango lineal. Presentar el porcentaje de la amilasa secretada como el porcentaje de la amilasa liberada de contenido total inicial. Reste el nivel de fondo de la amilasa del medio de cada uno por triplicado y se divide por el contenido total inicial similar normalizado. </li></ol> 3. imágenes en vivo de la secreción pancreática La secreción de acinos pancreáticos se puede controlar directamente por imágenes en vivo. Utilizando varios colorantes fluorescentes y sensores, imágenes en directo permite la caracterización de la secreción a una resolución subcelular. <ol><li> Preparar medio de resuspensión oxigenada como in paso 1.1 y llevarlo a 37 º C. Ajuste el microscopio, y si está equipado con un controlador de temperatura, ajuste a 37 ° C. </li><li> Lavar las células acinares en 30 ml de medio de resuspensión y colocarlos en un vaso de plástico o diapositiva. Nota: Si colorantes lipófilos se van a utilizar para etiquetar Para membrana plasmática marcada con colorantes lipófilos, manchar los acinos por no más de 5 minutos para evitar el etiquetado de las membranas internas por endocitosis. A lo largo de la obra, manejar los acinos con suavidad y evitar pipeteo excesiva. </li><li> Una vez en el microscopio, acinos imagen cuya morfología es clara, y evitar la proyección de imagen de acinos que muestran ampollas basolateral o vacuolas intracelulares. Añadir gota secretagogo de sabia o mediante el uso de una cámara de perfusión, ya sea durante o inmediatamente antes de la iniciación de la formación de imágenes. NOTA: A altas lentes de aumento con altas aperturas numéricas (por ejemplo × 63 / 1.4 o × 100 / 1,4) se recomienda para observar estructuras subcelulares. </li></ol> 4. O / N de Cultura pancreático Acinos (Cell alternativo Técnica Cultura) NOTA: O / N de cultivo se utiliza a menudo para la infección por virus adeno. La infección se llevó a cabo a 10 6 -10 7 pfu / ml para 9 - 16 horas antes del examen. <ol><li> Cultura acinos pancreáticos para un máximo de 20 horas. Acinos resuspendidas obtenidos a partir de un único páncreas en 25 ml de medio de cultivo (DMEM complementado con suero de ternero fetal (FCS) (5%), piruvato de sodio (1%), antibióticos (1%), L-glutamina (0,5%), BSA (10 mg / ml) y STI (0,2 mg / ml), y se divide a cinco placas de 10 cm. infectan los acinos con el virus en un gabinete de seguridad biológica de nivel 3. </li><li> Se incubó acinos pancreáticos a 37 ° C en un aire humidificado 5% de CO 2. Permitir acinos se recuperen en medio de resuspensión oxigenada durante 30 minutos antes de su examen ulterior 3,8. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Rho+and+Rac+in+secretagogue-induced+amylase+release+by+pancreatic+acini.">A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).</li><li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis.">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189, 867 (1975).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Petersen, H., Grossman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Además del cultivo ex vivo, configuraciones alternativas para el estudio de la secreción exocrina incluyen microscopía intravital y medición de fluidos desde el conducto pancreático. Microscopía intravital se demostró que operar bien en el ratón glándulas salivales 10. Este método puede grabar la secreción en tiempo real en el animal intacto, pero está limitado en su resolución y por los medios para manipular el tejido exocrino. La evaluación de la secreción mediante la recopilación d...

El páncreas exocrino constituye la mayor parte de la masa del páncreas de mamíferos y está dedicada a la producción y secreción de enzimas digestivas 1. La unidad funcional del páncreas exocrino, el acino, es un grupo de células epiteliales que forman y comparte un lumen conjunta. Tras la estimulación hormonal o neuronal, vesículas llenas de enzimas son transportados a la superficie celular apical, fusible con ella y expulsan su contenido en el lumen 1-3. Las enzimas secretadas se escurrieron entonces por un conjunto de coalescencia de los conductos en el intestino delgado, donde se catalizan la descomposición de los alimentos en nutrientes. Este video muestra cómo acinos intacta se aisló de todo el páncreas y cómo su capacidad secretora se puede evaluar. Utilizando esta configuración, la secreción pancreática se cuantifica midiendo la cantidad relativa de amilasa que se publicó después de la estimulación. Alternativamente, la secreción se pueden obtener imágenes en vivo por el uso de diferentessensores y colorantes. La configuración ex vivo de acinos pancreáticos es ventajoso ya aislado acinos, que conservan muchas de las características del páncreas intactos, puede ser manipulado y controlado más fácilmente que en el animal entero 4-6. Esta configuración fue desarrollado originalmente en la década de 1970 y fue puesto prorrogado por el estudio de varios tejidos exocrinas, como las glándulas salivales y mamarias 3-7. En particular, permite el estudio de la secreción con un mínimo de interferencia a las complejas organizaciones celulares de estos epitelios polarizados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

Células acinares pancreáticas producen y secretan las enzimas digestivas. Estas células están organizadas como un grupo que forma un lumen y acciones conjuntas. Este trabajo demuestra cómo la capacidad secretora de estas células puede evaluarse por cultivo de acinos aislados. La configuración es ventajosa, ya aislado acinos, que conservan muchas de las características del páncreas exocrino intacta puede ser manipulado y controlado más fácilmente que en el animal entero. Aislamiento adecuado de los acinos pancreáticos es un requisito clave para que el cultivo ex vivo representará a la naturaleza in vivo de los acinos. El protocolo demuestra cómo aislar acinos intacta desde el páncreas de ratón. Posteriormente, se presentan dos métodos complementarios para la evaluación de la secreción pancreática. El ensayo de secreción de amilasa sirve como una medida global, mientras que la imagen directa de la secreción pancreática permite la caracterización de la secreción a una resolución subcelular. Colectivamente, las técnicas PresenTed aquí, permite un amplio espectro de experimentos para estudiar la secreción exocrina.

Acinos pancreáticos que fueron aisladas adecuadamente mostrar una morfología estereotipado cuando se observa con luz transmitida. Sus dominios basolateral deben aparecer redonda y carente de ampollas. El dominio apical está rodeado de cientos de vesículas secretoras y aparece de color más oscuro (Figura 2A, B). Los núcleos se encuentran basal a la zona vesicular. Escombros y componentes del sistema ductal pancreático y del páncreas endocrino, que se puede detectar en las primeras etapas de aisla...

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Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Acinos pancreáticos aislados conservan su morfología y actividad in vivo y ofrecen maneras de gran alcance para el seguimiento y la manipulación de la secreción. Este trabajo demuestra cómo acinos se pueden aislar a partir del páncreas de ratón, y cómo se pueden evaluar sus capacidades secretoras.

La evaluación de la capacidad secretora de las células pancreáticas acinares

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.5K vistas.  Weizmann Institute of Science.  Acinos pancreáticos aislados conservan su morfología y actividad in vivo y ofrecen maneras de gran alcance para el seguimiento y la manipulación de la secreción. Este trabajo demuestra cómo acinos se pueden aislar a partir del páncreas de ratón, y cómo se pueden evaluar sus capacidades secretoras. 

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Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

El aislamiento de células madre de cáncer de páncreas xenoinjertos

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Investigación

Biología

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Preparación de las células acinares pancreáticas para los fines de Imagen de calcio, Lesiones Medidas Celulares e infección viral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Función Fenotipificación ratón pulmonar<em&gt; En Vivo</em&gt; Con la capacidad de difusión pulmonar

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

El uso de la técnica Patch-Clamp para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Cuantificación de la fagocitosis epitelial pigmentaria de la retina y acumulación de lipofuscina

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

Autor destacado: Modelos mejorados de lipofuscina y cuantificación de la capacidad de fagocitosis del segmento externo en cultivos epiteliales de pigmento de retina humano altamente polarizados  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

Modelos mejorados de lipofuscina y cuantificación de la capacidad de fagocitosis del segmento externo en cultivos epiteliales de pigmento retiniano humano altamente polarizados

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...

Methods Article

La evaluación de la capacidad secretora de las células pancreáticas acinares