Aquí aplicamos microinyección de ARN con etiqueta fluorescente para detectar secuencias de ARN que son esenciales para la localización de ARN nucleares cortos en estructuras nucleares llamadas cuerpos Cajales. Esta técnica tiene dos grandes ventajas. En primer lugar, se puede aplicar para ARN cortos que son difíciles de etiquetar y realizar un seguimiento.
Y en segundo lugar, permite la rápida selección de diferentes secuencias y probar su papel en la localización de ARN. Un día antes de la microinyección, heLa de semilla u otras células adherentes en cubreobjetos de 12 milímetros para alcanzar el 50% de confluencia en el momento de la microinyección. Para empezar, coloque un cubreobjetos preparado en el centro de un plato de Petri, agregue celdas y dos milímetros de medios de cultivo.
Al día siguiente, coloque la célula llena de petri en una etapa del microscopio. Con un microcargador, cargue tres microlitros de la mezcla de arneses en la aguja e instale la aguja en el soporte del microinyector en un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie de la placa Petri. Utilice un objetivo de larga distancia 10X para encontrar la aguja.
En primer lugar, ajuste la velocidad gruesa en el inyector y baje la aguja hasta que toque el medio de cultivo. Usando los prismáticos del microscopio, encuentre el punto brillante que es el lugar donde la aguja toca el medio de cultivo. Cambie la velocidad a fina y baje aún más la aguja mientras mira en el microscopio hasta que se observe la punta de la aguja.
Mueva la aguja en el centro del campo visual y cambie a un objetivo de larga distancia 40X. Después de esto, seleccione la celda y mueva la aguja por encima de la celda. Ajuste la presión y el tiempo para el contacto de la celda.
Mueva la aguja hacia abajo en la celda y luego establezca el límite inferior del micromaniprógrafo. Establecer el límite inferior es la parte más crítica del protocolo. Debido a que la superficie de cobertura no es perfecta y debido a que cada celda es diferente, tendrá que establecer el límite inferior varias veces durante la sesión de inyección.
A continuación, vuelva a mover la aguja por encima de la célula y pulse el botón de inyección en el joystick del inyector. La aguja se moverá automáticamente dentro de la célula hasta el lugar donde se establece el límite para inyectar la mezcla de ARN. Para terminar, pulse el botón de menú del inyector y retire la aguja del soporte.
A continuación, desconecte el tubo del inyector antes de apagar el inyector y el micromaniprógrafo. Después de la microinyección, devolver las células a una incubadora de dióxido de carbono e incubar a 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, enjuague las células tres veces con PBS a temperatura ambiente.
Fijar las celdas durante 20 minutos con 4%paraformaldehído en 0,1 tubos molares a pH 6,9. Luego lave las células tres veces con PBS a temperatura ambiente. Si solo se analiza la localización del arn esnar, enjuague brevemente las células en agua y monte en un medio de montaje con DAPI.
En caso de localización adicional de proteínas, permeabilizar las células con 0.5%Triton X-100 en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Enjuague las células tres veces con PBS y manchelas con los anticuerpos primarios y secundarios apropiados como se describe en el protocolo de texto. A continuación, enjuague tres veces con PBS y enjuague una vez en agua.
Después de esto, monte las celdas en un medio de montaje con DAPI. Cuando esté listo para la imagen, utilice un sistema microscópico de fluorescencia de alta gama equipado con un objetivo de inmersión para adquirir las imágenes. Una vez identificadas las células microinyecyéyas, recoja una pila de 20 secciones Z con pasos Z de 200 nanómetros por muestra y sujeto a desconvolución matemática.
Para cuantificar la señal fluorescente, primero abra la imagen de microscopía en ImageJ y divida los canales en ventanas. Sincronice las ventanas mediante la herramienta Sincronizar ventana. A continuación, dibuje la región de interés alrededor de un cuerpo Deal se identificado por inmunostaining coilin.
Mida la intensidad de la señal de ARN en el ROI definido por la bobina. Determinar la intensidad de la fluorescencia del ARN en ROI colocado aleatoriamente en el nucleoplasmo. Guarde los valores medidos y calcule la relación de la señal de ARN en el cuerpo de Cajal y el nucleoplasmo.
En este estudio, los snRNAs con etiqueta fluorescente se inyectan microinyectados para monitorear su transporte dentro de la célula. Para comprobar si el sitio SM es importante para la acumulación del cuerpo de Cajal, el ARN que carece del sitio SM se inyecta microinyecte directamente en el núcleo. La inyección en el citoplasma sirve como control, mientras que el ARN de longitud completa se inyecta microinyecía para servir como un control positivo.
Después de la incubación, se fijan las células microinyecteladas y la bobina del marcador corporal de Cajal se visualiza mediante inmunofluorescencia indirecta. El ARN de longitud completa se acumuló en los cuerpos de Cajal después de inyecciones nucleares y citoplasmáticos. Por el contrario, el ARN que carecía del sitio SM permaneció en el citoplasma después de la microinyección en este compartimento, mientras que la microinyección nuclear del ARN sin el sitio SM revela que la secuencia de unión SM es importante para la localización del cuerpo de Cajal, ya que este ARN permanece en el núcleo pero no se acumula en los cuerpos de Cajal.
A veces la microinyección en un solo compartimiento celular falla y engañado Dextran 70 kilodalton se puede encontrar tanto en el núcleo como en el citoplasma. Estas células se descartan de un análisis posterior. A pesar del hecho de que los snRNAs con etiqueta fluorescente se almacenan en 80 grados Celsius negativos antes de la inyección, puede producirse la degradación del ARN.
El ARN degradado inyectado en el citoplasma no se transporta al núcleo y permanece localizado en el citoplasma. Se debe desechar tal arnesón y sintetizar el nuevo ARN. Es importante ajustar correctamente las presiones de inyección y compensación para su tipo de célula.
Y como se dijo antes, establecer el límite inferior correcto para la inyección celular es esencial para una buena microinyección. Recuerde que el fenol-cloroformo utilizado durante el aislamiento del ARN es peligroso y que la aguja de microinyección es un objeto afilado. Tenga cuidado al manipular estos materiales.
