Dieses Protokoll bietet eine leistungsstarke Alternative zum Screening der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten, mit einer einfach umzusetzenden Methodik auch für Forscher, die sich nicht so sehr auf Nukleinsäuresonden spezialisiert haben. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Nukleinsäuresonden auszuwählen, die sowohl bekannte als auch unbekannte Nukleaseaktivitäten identifizieren können, wobei die dynamische Interaktion zwischen Sonde und Nuklease genutzt wird. Weitere Vorteile dieser Methode sind flexibilitätsmöglich, hohe Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit.
Die Demonstration wird von Khadija, einem Master-Studenten, und Baris, einem Postdoc aus unserem Labor, durchgeführt. Bei der Entwicklung einer Oligonukleotid-Bibliothek, enthalten Mindestens eine DNA und eine RNA Zufallssequenz enthält eine Kombination von Adenin, Guanin, Cytosin und Thiamin oder Uracil. Zur Vorbereitung der Oligonukleotid-Sonden die lyophilisierten Oligonukleotid-Sonden herunterdrehen und jede Sonde im Tris-EDTA-Puffer mit einer Konzentration von 500 Picomolar pro Mikroliter verdünnen, um einen Nukleaseabbau zu verhindern.
Für die Bakterienkultur auf festem Medium, rollen Sie eine einzelne poröse Glasperle aus kryogener Lagerung direkt auf eine Kulturschale mit TSA, ergänzt mit abgezäuntem Schafblut, um einzelne Bakterienkolonien auszustreichen. Dann legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Für bakterienkultur im flüssigen Medium, übertragen Sie eine einzelne Kolonie von einer festen mittleren Kultur auf 50 Milliliter TSB für die Inkubation bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute.
Am nächsten Tag verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis eins bis 500 in frischem TSB und bebrüten die Bakterien zusätzlich 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute in einem Schüttelinkubator. Um einen Nuklease-Aktivitätstest einzurichten, sollte zunächst ein Fluorometer auf 37 Grad Celsius vorwärmen und 96 Mikroliter steriles TSB oder Überstand aus einer Salmonellen- oder E.Coli-Flüssigkeitsmediumkultur vorsichtig zu einer 1,5-Milliliter-Nuklease-freien Mikrozentrifugenröhre pro Sonde hinzufügen. Fügen Sie vier Mikroliter Sondenarbeitslösung zu jedem Rohr hinzu und verwenden Sie eine Pipette, um jeden Rohrinhalt gründlich zu mischen, bis homogene Lösungen erreicht sind, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden.
Als nächstes, sorgfältig laden 95 Mikroliter jeder Lösung in der Nähe der Wand der einzelnen Brunnen einer schwarzen Boden, unbehandelt 96 Brunnenplatte, sorgfältig darauf achten, Blasen zu vermeiden. Wenn alle Lösungen hinzugefügt wurden, bedecken Sie die Platte und überprüfen Sie den Deckel visuell auf Stiftmarkierungen oder Staub, der Messartefakte einführen kann. Um die Software für die Nukleaseaktivitätsmessung einzurichten, öffnen Sie ein geeignetes Erfassungssoftwareprogramm.
Wählen Sie Jetzt lesen aus dem Task-Manager-Fenster aus, und wählen Sie Neu aus, um das kinetische Messprotokoll zu erstellen. Klicken Sie auf Temperatur festlegen, um 37 Grad Celsius auszuwählen und die Einstellungen zu bestätigen und zu speichern, indem Sie auf OK klicken. Klicken Sie auf Kinetik starten. Wählen Sie im Popupfenster zwei Stunden im Eingabefeld Laufzeit und zwei Minuten im Intervalleingabefeld aus, bevor Sie auf OK klicken, um die Einstellungen zu bestätigen und zu speichern.
Klicken Sie auf Lesen. Wählen Sie im Popupfenster Fluoreszenzintensität als Erkennungsmethode, Endpunktkinkinetik als Lesetyp und Filter als Optiktyp aus. Klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie im Popup-Fenster aus dem Filtersatz Grün aus, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie im Fenster Prozedur die Option Deckel verwenden aus, und klicken Sie auf Überprüfen.
Es wird ein Popupfenster angezeigt, das bestätigt, dass das erstellte Protokoll gültig ist. Wählen Sie im Menü Protokoll prozeduraz. Definieren Sie im Fenster Prozedur die zu messenden Bohrungen, und geben Sie den Namen des Experiments in das Eingabefeld Dateiname ein.
Dann laden Sie die Platte in den Plattenleser, wobei Sie darauf achten, dass sich die Platte in der richtigen Ausrichtung befindet, und klicken Sie auf die Schaltfläche Neu lesen, um mit der Erfassung zu beginnen. Öffnen Sie für die Datenanalyse die Daten in der entsprechenden Analysesoftware, und wählen Sie eine der gemessenen Bohrungen in einem Fenster auf der Platte aus. Klicken Sie auf Brunnen auswählen und schließen Sie alle gemessenen Brunnen in das Fenster Brunnenauswahldialog ein, bevor Sie auf OK klicken. Wählen Sie dann Daten in einem Fenster auf der Platte aus, um die tabellarischen Ergebnisse zu visualisieren, und klicken Sie auf QuickExport, um die Daten in eine Kalkulationstabelle zu exportieren.
Beschriften Sie in einer Kalkulationstabelle die Datenspalten als für jede Probe und Sonde geeignet, und zeichnen Sie die relativen Fluoreszenzeinheiten im Vergleich zur Zeit für die Daten zum Generieren kinetischer Diagramme. In diesem repräsentativen Experiment berichteten die Salmonella-Kulturüberfälle nach der ersten Screening-Runde von einer klaren Präferenz für RNA-Sonden gegenüber den DNA-Sonden. Basierend auf der Identifizierung von RNA als bevorzugtem Nukleinsäuretyp durch Salmonella-Nukleasen soll eine neue RNA-Bibliothek in der zweiten Screening-Runde verwendet werden.
Im Gegensatz dazu zeigten E.Coli in Kulturmedium-Kontrollen eine sehr begrenzte Fähigkeit, RNA-Sonden zu degradieren. Nach einer zweiten Screening-Runde mit chemisch modifizierten Nukleotiden zur Erhöhung der Spezifität der RNA-Sonden konnten RNA pyrimidin 2'O-Methyl und RNA Purin 2'O-methyl anhand ihrer chemischen Modifikationen als das leistungsstärkste kinetische Verhalten im Vergleich zu den RNA Pyrimidin 2'fluoro bzw. RNA Purin 2'fluoro identifiziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Salmonellen eine wichtige RNAse-Aktivität mit Differentialsubstratchemie bevorzugt haben, die für die Auswahl von Sonden verwendet werden kann, die diese Bakterien spezifisch erkennen können.
Dieses Verfahren ermöglicht die Auswahl von Sonden, die nuklease-Aktivitäten im Zusammenhang mit Krankheitszuständen wie Krebs oder bakteriellen Infektionen identifizieren können, was die Entwicklung neuer klinischer Diagnoseinstrumente ermöglicht.
