Este estudio utiliza un modelo animal establecido para investigar la recuperación y las etapas de las secuelas de la isquemia cerebral. Las principales ventajas de esta técnica son que es estable, fiable y relativamente simple. Comience colocando una rata anestesiada en una mesa de fijación quirúrgica.
A lo largo de la cirugía, mantener la temperatura corporal de la rata a 37 grados Celsius en un pequeño termostato animal. Conecte la boca a la mascarilla de la máquina de anestesia y confirme la anestesia profunda por falta de tensión en las extremidades, reflejos corneales y dolor. Fije las extremidades de la rata a la mesa de operaciones con vendas de papel.
Con una afeitadora eléctrica, retire la capa del cuello y esterilice el cuello con 75% de alcohol. Usa tijeras oftálmicas para cortar de dos a tres centímetros a lo largo de la forma longitudinal central del cuello. Y luego con fórceps oftálmicos, separa el músculo subcutáneo.
Utilice retractor casero para exponer completamente el campo de visión. Se debe tener cuidado de presentar la técnica aséptica adecuada para todos los procedimientos quirúrgicos de supervivencia. La técnica ilustrada más adelante en el video debe ser practicada a través de todo el procedimiento.
Utilice los micro fórceps para aislar la arteria carótida común, la arteria carótida externa y la arteria carótida interna. Trabajando bajo el microscopio, use 8-0 suturas para ligar la arteria carótida común con nudo duro, arteria carótida externa lejos del extremo del corazón con nudo duro, arteria carótida interna con nudo suelto y luego para forrar la arteria carótida externa cerca del extremo del corazón. Usando tijeras micro, corte una pequeña abertura en la arteria carótida externa e inserte suavemente un perno de rosca.
Ligar la sutura de la arteria carótida externa que es nudo delgado y suelto y cortar la arteria carótida externa. Afloje el nudo suelto de la arteria carótida interna y continúe insertando el perno de rosca al principio de la arteria cerebral media marcada con la sutura y corte el perno de rosca expuesto. Después de alcanzar el tiempo isquémico después de dos a tres horas, fije la fractura de la arteria carótida externa usando micro fórceps y tire suavemente del perno del hilo con otro microppps.
Después de retirar completamente el extremo frontal del perno de rosca de la arteria carótida interna, ligar la arteria carótida externa que ha sido forrada con 8-0 sutura y luego retire el perno de rosca por completo. Después de aflojar la arteria carótida común, déjelo aproximadamente 50.000 unidades de polvo de penicilina sódica en la superficie de la herida para prevenir la infección. Usa cuatro suturas para suturar los músculos subcutáneos y la piel.
Después de colocar la rata de vuelta a la jaula, utilice una jeringa de un mililitro para dar aproximadamente 0,2 mililitros de agua a la rata por vía oral para evitar la deshidratación postoperatoria. Elija los animales de acuerdo con la puntuación más larga para la tinción TTC o estudios motores sensoriales. Después de incubar el cerebro aislado para la tinción TTC a menos 20 grados Celsius de 30 minutos, colóquelo en un molde pre-enfriado de la rebanada de cerebro de rata.
Usando una hoja preenfriada, corta el cerebro en seis secciones consecutivas de dos milímetros de grosor. Manchar las secciones con 2%TTC en una placa de cultivo de seis pozos e incubar durante 30 a 60 minutos a 37 grados Celsius mientras agita. Cada 10 minutos, voltea las secciones hasta que la isquemia cerebral y las áreas no afectadas sean visiblemente blancas y rojas.
Alinee las rebanadas cerebrales verticalmente en el cartón negro en orden desde la parte posterior hasta la parte delantera del cerebro usando una regla para asegurarse de que la longitud total de cada línea es la misma y tomar fotos. Importa la foto y selecciona las rebanadas cerebrales. Seleccione primer plano negro y escriba Alt Supr para rellenar el color de fondo y, a continuación, Control D para anular la selección.
Por último, guarde la imagen en el escritorio. Para analizar el volumen de infarto, abra primero el software e importe la foto. Para modificar el defecto, ajuste el brillo con la herramienta de mejora de contraste para que el fondo sea negro.
En el filtro, utilice la herramienta mediana para eliminar los resaltados. Para calcular el área normal izquierda del cerebro, seleccione el color usando la segmentación y ajuste el valor de H, S y I para separar las rebanadas cerebrales del fondo negro. Vuelva al tamaño del recuento y haga clic en el recuento.
Haga clic en los objetos divididos en la edición para separar el cerebro de la línea media que distinguirá automáticamente las áreas del cerebro izquierdo y derecho. Para calcular el área cerebral de infarto derecha, importe la imagen, ajuste el fondo y elimine los resaltados como se hizo anteriormente. Seleccione el tamaño del recuento y haga clic en la herramienta Dibujar objetos de fusión en la edición.
Seleccione manualmente el área isquémica y haga clic en el recuento para calcular el área isquémica. Para calcular el área del cerebro saludable correcta, primero importe la imagen, ajuste el fondo y elimine los resaltados como se hizo anteriormente. Seleccione el color usando la segmentación y ajuste el valor de H, S y I para separar las rebanadas sanas del cerebro del fondo negro.
Vuelva al tamaño del conteo y haga clic en el recuento para calcular esta área. Haga clic en los objetos divididos en la edición para separar el cerebro de la línea media que distinguirá automáticamente las áreas del cerebro izquierdo y derecho. Tome ratas elegidas para estudios motores sensoriales y para la prueba de asimetría bilateral y envuelva la cinta de papel en la parte safenosa de cada garra de proa tres veces utilizando la misma presión.
Para cada rata, grabe con la cámara el número de veces que cada garra delantera se pone en contacto y retira la cinta en un plazo de cinco minutos, incluidos los tiempos de pata no afectados y afectados. Repita el ajuste y la grabación después de 30 minutos y, a continuación, calcule los valores. Para la prueba de caminar por la rejilla, coloque la rata en el centro de una plataforma de superficie de rejilla elevada con aberturas de 2,5 centímetros cuadrados.
Empuje ligeramente las caderas de la rata para animarla a moverse a través de la superficie. Usando la cámara, grabe el número de fallas en los pies hechas por las extremidades afectadas derechas y las izquierdas y el número de paso total en un minuto con la cámara. Para la prueba de la varilla del rotor, configure el aparato de fatiga de la barra giratoria de la rata a una velocidad de 13 RPM durante un período de cinco minutos utilizando el software de soporte.
Inicie el programa informático y coloque la rata en los anillos de la varilla del rotor al mismo tiempo. Finalice el ensayo si la rata se cae del anillo o después de cinco minutos y registre el tiempo de rotación. Deje que la rata descanse durante 30 minutos, luego repita la prueba dos veces más y elija el valor máximo como el último tiempo de rotación.
Para levantar la prueba de cuerda, coloque el instrumento de cuerda de elevación en un escritorio. Haga que la rata agarre la cuerda con sus extremidades delanteras y déjela colgar. Registre el tiempo de suspensión y calcule las puntuaciones.
Cuando se estudió la lesión isquémica cerebral inducida por la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión, el perno de hilo de 300 gramos de 3040 gramos y el tiempo de infarto cerebral de tres horas demostraron ser los más adecuados con el infarto cerebral más grande, la puntuación más larga y la mayor proporción de éxito del modelo. Esto se mejoró significativamente en comparación con el tratamiento convencional de 275 gramos de peso, 2636 perno de rosca y tiempo de infarto cerebral de dos horas. Para estudiar el estado de recuperación de la isquemia cerebral, se realizó la tinción TTC y reveló el volumen de infarto y contracción en 23,4% el primer día después de la oclusión y reperfusión de la arteria cerebral media, 19,6% en el día 35, 16,1% en el 60 y 15,7% en el 90o día.
Después de un día de oclusión y reperfusión de la arteria cerebral media, el sesgo motor sensorial en la prueba de asimetría bilateral, los tiempos de error de marcha de la rejilla en la prueba de marcha de la rejilla y la puntuación de la cuerda de elevación en la prueba de cuerda de elevación se incrementan, mientras que el tiempo de la varilla del rotor en la prueba de la barra del rotor disminuyó, lo que indica la importancia de estas pruebas en el estudio de la isquemia cerebral aguda. Sólo el sesgo motoro sensorial mantuvo grandes trastornos funcionales de manera dependiente del tiempo después de 35, 60 y 90 días de oclusión y reperfusión de la arteria cerebral media. Para la prueba de caminar en la cuadrícula, hubo diferencias significativas de los tiempos de error de caminar de la cuadrícula durante 35 y 60 días.
Estos resultados indicaron que estas dos pruebas podrían ser adecuadas para probar la recuperación en ratas. Con el fin de garantizar el éxito, la acción debe ser suave y la operación debe ser estable. Otras pruebas conductuales, como la detección de la marcha, también pueden ser adecuadas para este modelo.
El desarrollo de este modelo podría allanar el camino para que los investigadores exploren la isquemia cerebral en las etapas de recuperación y secuelas.
