광반점 분석기를 이용하여, 유충의 동작은 유충 운동의 세부사항을 분석할 수 있도록 광영역에 들어가기 전, 도중 및 진입 한 후에 추적될 수 있다. 이 분석은 간단하고 수행하기 쉽습니다. 라이트 응답은 한 번만 테스트되므로 광 적응의 가능한 효과를 제외할 수 있습니다.
한천 판을 준비하려면 15센티미터 페트리 접시의 바닥을 약 4mm 두께의 뜨거운 1% 한고로 천천히 균일하게 덮습니다. 한천이 고화될 때까지 접시를 실온에서 식힙니다. 시각적 자극 시스템을 설정하려면 준비된 LED 광원을 철프레임에 잘라 바탕 화면쪽으로 빛이 투사하는 것을 주의하십시오.
실린더 평면과 수직 평면 사이의 각도가 약 10도 될 때까지 실린더를 약간 기울이게합니다. 470나노미터 블루 LED 라이트를 고출력 LED 드라이버의 LED 1플러그에 연결하고 드라이버를 켭니다. 드라이버의 오른쪽 상단 모서리에 있는 노브를 돌려 채널 470 나노미터를 선택하고 LED를 클릭합니다.
화면에 검사가 표시되면 바탕 화면에 파란색 표시등이 나타납니다. 확인을 클릭하고 노브를 돌려 빛의 강도를 조정합니다. 광원의 위치를 위아래로 이동하여 광점의 직경을 2cm로 조정합니다.
노브를 회전하여 실험 요구 사항에 따라 광 강도를 선택합니다. 표준 사진 다이오드 전원 센서가 있는 컴팩트한 파워 미터 콘솔을 사용하여 그 자리에서 최대출력과 최소한의 광출력을 측정할 수 있습니다. 빛 힘은 실제 실험에서 어둠 속에서 측정해야합니다.
그런 다음 광전력을 기록하고 세 번 측정하고 평균 값을 사용합니다. 상상 시스템을 설정하려면 데스크탑의 라이트 스팟에서 약 10센티미터 높이의 아이언 클립으로 고해상도 웹 카메라를 고정하고 카메라 렌즈의 방향을 바탕 화면쪽으로 조정합니다. USB 인터페이스를 통해 Windows 7을 실행하는 컴퓨터에 카메라를 연결하고 카메라 바로 아래 바탕 화면에 한천 판을 놓습니다.
AMCap 9.22 소프트웨어를 열면 라이트 스팟이 AMCap 창에 자동으로 표시됩니다. 카메라를 왼쪽 또는 오른쪽으로 약간 이동하여 라이트 스팟이 창 중앙 근처에 있는지 확인합니다. 클립을 사용하여 카메라 바로 아래 5~7mm에서 850 플러스 또는 마이너스 3나노미터 밴드패스 필터를 수정합니다.
접시 가장자리에서 약 5센티미터 떨어진 천판 주변에 중앙 파장이 850나노미터의 중앙 파장을 가진 3개의 적외선 광 생성 LED를 놓고, LED 렌즈는 플레이트를 향하여 70도 각도로 배치합니다. 그런 다음 AC를 통해 전원에 LED를 DC 컨버터에 연결합니다. AMCap 소프트웨어 의 메뉴에서 옵션, 비디오 장치 및 캡처 형식을 선택하고 캡처된 비디오의 픽셀 크기를 800x 600으로 설정하고 프레임 속도를 초당 60프레임으로 설정합니다.
필터를 제거하고 눈금자를 카메라 아래에 배치합니다. 스케일 라인이 비디오 시야의 너비와 명확하고 평행해질 때까지 카메라 포커스를 조정하고 캡처, 설정 및 비디오 캡처를 클릭하여 저장 경로를 선택합니다. 그런 다음 레코딩을 클릭하여 600픽셀에 해당하는 실제 거리를 기록하고 각 픽셀의 비율을 실제 거리와 계산합니다.
이미징 설정에 애벌레를 도입하기 전에, 빛의 위치의 짧은 비디오를 획득하고 필터링되지 않은 제어 배경 비디오 광 영역의 이름을 지정합니다. 필터를 카메라 렌즈에 다시 놓고 애벌레를 명확하게 관찰할 수 있도록 가능한 한 낮은 설정으로 실험 장치에서 멀리 떨어진 빛을 켭니다. 숟가락을 사용하여 배양 배지에서 유충을 제거하고 세 번째 인스타 애벌레를 부드럽게 선택하십시오.
증류수에 애벌레를 씻고 애벌레를 한천 접시 중앙에 놓습니다. 애벌레에서 여분의 물을 부드럽게 제거하고 방 빛을 끕니다. 적외선 LED 조명을 켜기 전에 어두운 환경에서 2 분 동안 애벌레가 적응하도록 허용하십시오.
다음 광 회피 동작 실험은 어둠 속에서 수행되어야 합니다. 데모의 편의를 위해 우리는 밝은 빛으로 촬영했습니다. 애벌레를 접시 중앙으로 부드럽게 브러시합니다.
애벌레가 똑바로 기어 다니기 시작하면 접시를 회전하여 유충이 광반쪽으로 향하게 합니다. 캡처, 설정 및 비디오 캡처를 클릭하여 저장 경로를 선택하고 녹화를 클릭하여 녹화를 시작합니다. 애벌레가 시야에서 거의 벗어날 때까지 라이트 스팟을 향해 크롤링하고 입력하고 방치하고 녹화 중지를 클릭합니다.
필터를 카메라에서 멀리 이동하고 라이트 스팟의 위치의 짧은 비디오를 가져옵니다. 그런 다음 게시물 분석법 필터링되지 않은 비디오 라이트 영역 2의 이름을 지정하고 이 비디오를 라이트 영역 1비디오와 비교하여 라이트 스팟 위치가 변경되지 않도록 합니다. 여기서, 꼬리 속도, 바디 굽힘 각도 및 대표적인 애벌레의 신체 굽힘의 각도 속도를 관찰할 수 있다.
애벌레 헤드 캐스트의 크기는, 따라서, 최대 체 굽힘 각도크게 Tdc2-Gal4 뉴런이 정상적인 애벌레 빛 반응에 필요하다는 것을 나타내는 부모 통제에 비해 파상풍 독성 발현에 의해 억제 옥토 파민성 뉴런제3인스타 애벌레에서 감소된다. 성공적인 이미지 처리를 위해 카메라가 빛을 차단하지 않고 라이트 스팟이 둥글고 창 중앙 근처에 있는지 확인합니다. 이 절차에 따라, 광유전학은 특정 뉴런이 활성화될 때 애벌레가 어떻게 반응하는지 관찰하기 위하여 수행될 수 있습니다.
이 분석기를 사용하여, 애벌레 운동의 세부 사항은 환경과 애벌레 빛 회피 행동에 대한 내부 요인의 먼 영향을 연구 할 수 있도록 분석 할 수 있습니다.
